津力達顆粒對高脂誘導的胰島素抵抗ApoE-/-小鼠骨骼肌SREBP-1c的影響

金 鑫， 張會欣，2*， 崔雯雯，3， 常麗萍

（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱150040；2.河北以嶺醫藥研究院，河北石家莊050000；3.國家中醫藥管理局重點研究室 （心腦血管絡病），河北 石家莊 050000；4.河北醫科大學，河北 石家莊050017；5.河北省絡病重點實驗室，河北石家莊050000）

津力達顆粒對高脂誘導的胰島素抵抗ApoE-/-小鼠骨骼肌SREBP-1c的影響

金 鑫1， 張會欣1，2*， 崔雯雯1，3， 常麗萍4，5

（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱150040；2.河北以嶺醫藥研究院，河北石家莊050000；3.國家中醫藥管理局重點研究室 （心腦血管絡病），河北 石家莊 050000；4.河北醫科大學，河北 石家莊050017；5.河北省絡病重點實驗室，河北石家莊050000）

目的探究津力達顆粒 （人參、黃精、蒼術、苦參、麥冬、地黃、何首烏、山茱萸等）對高脂誘導的胰島素抵抗ApoE-/-小鼠骨骼肌甘油三酯相關基因的影響。方法8只雄性C57BL/6J小鼠設為正常組。40只雄性ApoE-/-小鼠喂養16周后分為模型組、羅格列酮組、津力達顆粒低，中和高劑量組，灌胃給藥8周.采用組織游離脂肪酸試劑盒、BCA蛋白濃度法測定骨骼肌游離脂肪酸含量；葡萄糖耐量實驗 （OGTT）評價小鼠的胰島素抵抗程度；實時熒光定量反轉錄PCR和蛋白質印跡法（Western-blot）測定小鼠骨骼肌胰島素受體、胰島素受體底物2、膽固醇調節元件結合蛋白-1c（SREBP-1c）mRNA和蛋白表達。結果津力達顆粒能夠降低小鼠的空腹血糖、膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇，升高高密度脂蛋白，下調小鼠骨骼肌游離脂肪酸含量，提高胰島素敏感指數。同時上調小鼠胰島素受體和胰島素受體底物2，下調SREBP-1cmRNA和蛋白表達。結論津力達顆粒能夠明顯改善小鼠糖耐量異常來改善高脂誘導的ApoE-/-小鼠的胰島素抵抗。

津力達顆粒；ApoE-/-小鼠；胰島素抵抗；胰島素受體；胰島素受體底物2；膽固醇調節元件結合蛋白-1c（SREBP-1c）

脂毒性在2型糖尿病的發生發展中所起到的作用日益受到大家的關注［1］。所謂 “脂毒性”指的是過多的脂質沉積超過了脂肪組織本身的儲存能力而轉移到非脂肪組織，如骨骼肌等，導致脂肪的異位沉積，促使胰島素的外周作用和分泌功能受到損害［2］。迄今為止脂毒性導致胰島素抵抗的機理尚未明確［3］。SREBP-1c是調控脂肪酸合成和細胞內脂質含量的關鍵因子［4-5］。因此，探討SREBP-1c的作用，能夠為了解胰島素抵抗的能量代謝過程提供實驗依據。

1 藥品與試劑

津力達顆粒由人參、黃精、蒼術 （炒）、苦參、麥冬、地黃、何首烏、山茱萸、茯苓、佩蘭、黃連、知母、淫羊藿、丹參、葛根、荔枝核、地骨皮等十七味中藥組成，石家莊以嶺藥業股份有限公司提供，批號120429；鹽酸羅格列酮片由貴州圣濟堂制藥有限公司生產，批號20120202；組織游離脂肪酸測定試劑盒購自南京建成科技有限公司；胰島素受體（INSR）、胰島素受體底物2（IRS-2）和膽固醇調節元件結合蛋白-1c（SREBP-1c）抗體均購于abcam公司；INSR、IRS-2、SREBP-1c引物由上海生工生物公司合成。

1.1 實驗動物 ApoE-/-小鼠、C57BL/6J小鼠，雄性，18～20 g，SPF級，均購自北京大學醫學部，許可證號SCXK（京）2011-0012，動物合格證號C57BL/6J小鼠（0302333），ApoE-/-小鼠（0302331）。

1.2 實驗飼料 實驗基礎飼料購自河北醫科大學實驗動物中心，熱量組成為蛋白質24.2%，碳水化合物65.5%，脂肪10.3%，總熱量為348 kcal/ 100 g；參照文獻 ［6］自制高脂飼料，熱量組成為蛋白質占20.1%，碳水化合物20.1%，脂肪59.8%，總熱量為501 kcal/100 g。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組 8只雄性C57BL/6J小鼠設為正常組，給予正常飼料；40只雄性ApoE-/-小鼠，給予高脂飼料，喂養16周后，分為5組：模型組、羅格列酮組、津力達高劑量組、津力達中劑量組、津力達低劑量組，津力達用純水配制，參照文獻［6］按照小鼠體質量高劑量3.8 g/kg，中劑量1.9 g/kg，低劑量0.95 g/kg進行灌胃給藥，鹽酸羅格列酮片按1.33 mg/kg灌胃給藥。正常組和模型組給予純水，連續8周，處死小鼠后，留取血清、骨骼肌標本，-80℃保存備用。

1.4.2 血清生化指標檢測 空腹血糖、甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇水平采用全自動生化分析儀檢測。

1.4.3 骨骼肌游離脂肪酸檢測 采用游離脂肪酸測試盒檢測小鼠骨骼肌游離脂肪酸含量，BCA法測定蛋白濃度校正骨骼肌游離脂肪酸含有量，實驗嚴格按照說明書操作。

1.4.4 胰島素敏感性評價

1.4.4.1 空腹胰島素水平和胰島素敏感指數 空腹胰島素水平測定采用放射免疫分析法檢測，計算胰島素敏感指數評價其胰島素抵抗程度，胰島素敏感指數=1/（空腹血糖×空腹胰島素）。

1.4.4.2 小鼠葡萄糖耐量實驗評價小鼠的胰島素敏感性 小鼠飼養24周后，禁食不禁水14～16 h，尾部采血，測定空腹血糖，記為小鼠葡萄糖耐量實驗0min的血糖值，隨后各組小鼠口服30%的葡萄糖溶液，用微量血糖儀測定30、60、120 min血糖水平。

1.4.5 骼肌INSR、IRS-2、SREBP-1cmRNA表達水平檢測 參照文獻［6］取小鼠骨骼肌組織勻漿并用Trizol法提取總RNA后，反轉錄反應。采用實時熒光定量反轉錄PCR（RT-PCR）方法檢測小鼠骨骼肌胰島素受體 （INSR）、胰島素受體底物2（IRS-2）、膽固醇調節元件結合蛋白-1c（SREBP-1c）的表達。

內參β-actin及各目的基因引物序列如下：

INSR正向引物TTTGCCCAACCATCTGTAAG，反向引物GACCATCCAGGTAGAAGTTTCG；IRS-2正向引物TCTCTGGCAGTTCAGGTCG，反向引物AGTCCTCTGGGTAAGGGTTG；SREBP-1c正向引物CAAAGAGGAGATTGGCATTG，反向引物TGCGTGTGGAGAAGTAGATGT。反應結束后，按照各反應孔Ct值，以β-actin基因為內參，根據公式2-ΔCt計算各樣品目的基因相對表達量。

1.4.6 骨骼肌INSR、IRS-2、SREBP-1c蛋白表達水平測定 小鼠骨骼肌胰島素受體 （INSR）、胰島素受體底物2（IRS-2）、膽固醇調節元件結合蛋白-1c（SREBP-1c）蛋白表達水平采用Western blot法測定。參照文獻 ［6］取骨骼肌組織100 mg，加入1 mL裂解液，充分裂解并采用改良酚試劑法定量。取30μg進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，完畢后進行半干轉膜，轉膜完畢，取出聚偏氟乙烯膜室溫封閉2 h，將封閉后的PVDF聚偏氟乙烯膜置入稀釋的一抗溶液中，4℃緩慢搖動過夜。洗膜后將聚偏氟乙烯膜置入適量稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗溶液中，室溫反應2 h。抗體結合區帶用化學發光法檢測。以目的蛋白的IOD與β-actin的IOD比值表示該樣品的目的蛋白相對含量。

1.4.7 統計學處理 用SPSS 13.0統計軟件進行分析各項數據資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清生化指標比較 與正常組相比，模型組小鼠血糖、膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇明顯升高，高密度脂蛋白膽固醇明顯降低，差異均有統計學意義 （P＜0.05）；與模型組相比，羅格列酮組、津力達高劑量組小鼠血糖水平明顯降低（P＜0.05）；羅格列酮組、津力達不同劑量組小鼠膽固醇、甘油三酯明顯降低 （P＜0.05）；津力達高劑量組低密度脂蛋白膽固醇明顯降低 （P＜0.05）；津力達中劑量組、高劑量組小鼠高密度脂蛋白膽固醇升高 （P＜0.05）。見表1。

表1 津力達對血液生化指標的影響 （）Tab.1 Effects of JLD on biochem ical parameters in blood（）

表1 津力達對血液生化指標的影響 （）Tab.1 Effects of JLD on biochem ical parameters in blood（）

注：與正常組比較，#P＜0.05，與模型組比較，*P＜0.05

組別 給藥劑量 血糖/（mmol·L-1）膽固醇/（mmol·L-1）甘油三酯/（mmol·L-1）高密度脂蛋白膽固醇/（mmol·L-1）低密度脂蛋白膽固醇/（mmol·L-1）正常組 —6.06±0.71 2.78±0.47 0.82±0.06 4.02±0.44 0.38±0.14模型組 — 7.98±0.68# 12.67±1.16# 1.80±0.18# 2.78±0.63# 3.9±0.52#羅格列酮組 1.33 mg/kg 6.69±0.54* 8.76±1.00* 1.25±0.09* 3.08±0.41 3.58±0.63津力達低劑量組 3.8 g/kg 7.74±0.34 11.03±0.46* 1.62±0.23 3.10±0.29 3.83±0.53津力達中劑量組 1.9 g/kg 7.62±0.40 9.60±0.57* 1.31±0.08* 3.39±0.60* 3.55±0.33津力達高劑量組 0.95 g/kg 6.77±0.42* 7.78±0.36* 1.17±0.06* 4.76±0.85* 3.29±0.45*

2.2 骨骼肌游離脂肪酸含量比較 與正常組相比，模型組小鼠骨骼肌游離脂肪酸水平明顯升高，差異均有統計學意義 （P＜0.05）；與模型組比較，羅格列酮組、津力達各劑量組小鼠骨骼肌游離脂肪酸水平均明顯降低 （P＜0.05）。見表2。

2.3 胰島素敏感性評價

2.3.1 空腹胰島素和胰島素抵抗指數 與正常組相比，模型組空腹胰島素水平升高，胰島素抵抗指數升高 （P＜0.05），與模型組比較，羅格列酮組、津力達低、中、高劑量組空腹胰島素水平、胰島素抵抗指數明顯下降，結果具有統計學意義 （P＜0.05）。見表3。

表2 津力達對骨骼肌游離脂肪酸的影響 （）Tab.2 Effects of JLD on skeletalmuscle of the FFA（）

表2 津力達對骨骼肌游離脂肪酸的影響 （）Tab.2 Effects of JLD on skeletalmuscle of the FFA（）

注：與正常組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05

組別 給藥劑量 骨骼肌游離脂肪酸/（mmol·L-1）正常組 —12.32±4.01模型組 — 98.19±18.23#羅格列酮組 1.33 mg/kg 27.61±6.44*津力達低劑量組 0.95 g/kg 62.55±10.26*津力達中劑量組 1.9 g/kg 41.16±6.97*津力達高劑量組 3.8 g/kg 27.57±5.30*

表3 津力達對血清胰島素和胰島素敏感指數的影響 （）Tab.3 Effects of JLD on FIns and ISI（）

表3 津力達對血清胰島素和胰島素敏感指數的影響 （）Tab.3 Effects of JLD on FIns and ISI（）

注：與正常組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05

胰島素敏感指數正常組 —組別 給藥劑量 血清胰島素/（mU·L-1）26.14±7.97 -5.01±0.43模型組 — 145.28±8.22# -7.05±0.12#羅格列酮組 1.33 mg/kg 60.46±9.03* -5.99±0.18*津力達低劑量組 3.8 g/kg 121.82±2.33* -6.85±0.05*津力達中劑量組 1.9 g/kg 95.13±8.18* -6.58±0.09*津力達高劑量組 0.95 g/kg 63.94±10.04* -6.06±0.21*

2.3.2 小鼠葡萄糖耐量實驗 各組小鼠糖耐量于口服葡萄糖30 min后出現血糖水平升至高峰，以后逐漸降低；與正常組相比模型組各時間點的血糖水平均有明顯升高；與模型組小鼠比較，津力達各組小鼠血糖升高峰值明顯降低，降低血糖時間縮短，與模型組相比差異顯著。見表4。

表4 津力達對葡萄糖耐量的影響 （）Tab.4 Effect of JLD on glucose tolerance（）

表4 津力達對葡萄糖耐量的影響 （）Tab.4 Effect of JLD on glucose tolerance（）

注：與正常組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05

0 min 30 min 60 min 120 min正常組組別 只數 血糖/（mmol·L-1）8 5.4±0.3 11.3±1.1 9.1±0.9 7.0±0.7模型組 8 7.9±0.5# 18.1±1.5#15.4±1.2#11.6±1.0#羅格列酮組 8 6.6±1.2* 12.4±1.5*12.3±1.2*7.8±0.3津力達低劑量組 8 6.8±0.7 18.3±1.3 14.5±1.5 11.1±0.5津力達中劑量組 8 6.9±1.1 16.8±1.5 13.7±1.6*9.9±1.1*津力達高劑量組 8 6.7±1.4* 15.8±2.6*12.6±1.6*8.2±0.6*

2.4 骨骼肌INSR、IRS-2、SREBP-1c mRNA水平比較 與正常組比較，模型組骨骼肌INSR、IRS-2水平均明顯低于正常組，SREBP-1c明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，羅格列酮組、津力達中、高劑量組INSR、IRS-2 mRNA水平明顯上升（P＜0.05）；津力達各個劑量組SREBP-1c mRNA水平均明顯降低（P＜0.05）。見表5。

2.5 骨骼肌INSR、IRS-2、SREBP-1c蛋白表達比較 與正常組相比，模型組INSR、IRS-2蛋白表達均有明顯降低，SREBP-1c蛋白水平明顯升高，差異具有統計學意義 （P＜0.05）；與模型組相比，羅格列酮組、津力達各組INSR蛋白水平明顯升高，羅格列酮組、津力達高、中劑量組的IRS-2蛋白表達明顯升高，津力達中、高劑量組SREBP-1c蛋白水平明顯降低，差異有統計學意義 （P＜0.05）。見表6，圖1。

表5 津力達對INSR、IRS-2、SREBP-1cm RNA表達的影響 （）Tab.5 Effects of JLD on INSR，IRS-2 and SREBP-1c m RNA expression（）

表5 津力達對INSR、IRS-2、SREBP-1cm RNA表達的影響 （）Tab.5 Effects of JLD on INSR，IRS-2 and SREBP-1c m RNA expression（）

注：與正常組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05

INSR IRS-2 SREBP-1c正常組 —組別 給藥劑量1.04±0.18 1.03±0.15 1.00±0.1模型組 — 0.26±0.04#0.24±0.04# 5.52±0.74#羅格列酮組 1.33 mg/kg 0.79±0.14*0.51±0.08* 5.08±0.55津力達低劑量組 3.8 g/kg 0.31±0.06 0.32±0.05 2.67±0.35*津力達中劑量組 1.9 g/kg 0.49±0.09*0.57±0.09* 2.18±0.21*津力達高劑量組 0.95 g/kg 0.60±0.10*0.74±0.12* 2.06±0.26*

表6 津力達對INSR、IRS-2、SREBP-1c蛋白表達的影響（）Tab.6 Effects of JLD on INSR，IRS-2 and SREBP-1c protein expression（）

表6 津力達對INSR、IRS-2、SREBP-1c蛋白表達的影響（）Tab.6 Effects of JLD on INSR，IRS-2 and SREBP-1c protein expression（）

注：與正常組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05

INSR IRS-2 SREBP-1c正常組 —組別 給藥劑量1.12±0.10 0.90±0.02 0.22±0.04模型組 — 0.34±0.04#0.16±0.02# 0.63±0.05#羅格列酮組 1.33 mg/kg 0.75±0.07*0.46±0.04* 0.67±0.09津力達低劑量組 3.8 g/kg 0.49±0.03*0.36±0.07 0.59±0.02津力達中劑量組 1.9 g/kg 0.60±0.05*0.40±0.03* 0.50±0.08*津力達高劑量組 0.95 g/kg 0.84±0.06*0.45±0.04* 0.28±0.02*

圖1 津力達對INSR、IRS-2、SREBP-1c蛋白表達的影響Fig.1 E ffects of JLD on protein expression of INSR，IRS-2 and SREBP-1c in skeletalmuscle

3 討論

胰島素抵抗 （IR）指的是正常劑量的胰島素產生低于正常生物學效應的一種狀態，也就是胰島素對其靶器官的敏感性下降［7］。沒有高脂誘導的ApoE-/-小鼠，就會產生很明顯的脂代謝紊亂［8］，經過長期高脂誘導之后，發現模型組小鼠相對于正常組的血脂水平明顯升高；胰島素敏感指數明顯下降，小鼠的糖耐量實驗都表明模型組小鼠產生了明顯的胰島素抵抗特征；骨骼肌的游離脂肪酸含量明顯上升。而津力達能夠不同程度的改善小鼠的以上指標，可以看出津力達具有一定的改善胰島素抵抗的作用。

胰島素抵抗的發生是一個十分復雜的過程，其牽涉到復雜的胰島素信號網絡的共同作用，任何一個環節發生改變都可能會產生胰島素抵抗。INSR存在于多數哺乳動物的細胞表面，是胰島素信號的起始部位。胰島素到達靶細胞后，與其表面的INSR的α亞基特異性結合，構型改變，導致酪氨酸激酶活化，激活β亞基，導致受體磷酸化激活IRS。然后被磷酸化的 IRS與 p85結合，激活PI3K，再激活葡萄糖轉運因子，促進糖的轉運活動［9-10］。INSR和IRS在胰島素的信號轉導過程中起到十分重要的作用。2型糖尿病的患者普遍存在INSR蛋白、基因不同程度的下降，可見INSR在胰島素信號轉導過程中的重要性。IRS在胰島素的信號傳導過程中也起到十分重要的作用，其中IRS的家族成員中主要有IRS-1和IRS-2廣泛分布在外周組織中。有實驗發現，剔除IRS-1基因純合子的大鼠只發生胰島素抵抗，血糖變化不明顯；而敲除IRS-2的純合子大鼠不僅胰島素抵抗嚴重，而且血糖升高明顯，我們可以猜測在胰島素信號轉導的過程中，IRS-2的作用可能較IRS-1更為重要［11］。本實驗研究發現，HF組的INSR和IRS-2的蛋白和mRNA含量明顯下降，而津力達能夠不同程度的增加INSR和IRS-2的表達，從而改善胰島素的傳導過程來調節外周脂代謝，從這一點我們推測津力達改善小鼠骨骼肌的胰島素抵抗可能與這個原因有關，其具體機制仍需進一步研究。

SREBP-1c作為骨骼肌細胞內調節糖代謝和調控脂肪酸的轉錄因子，參與調控脂肪酸合成酶、己糖激酶Ⅱ、乙酰輔酶A羧化酶2，能夠調控細胞內脂質含量，控制脂肪酸的合成。有研究證明：胰島素可以調節SREBP-1c的水平。高糖可以誘導SREBP-1c的表達［12］；早期胰島素治療后肌細胞的脂質合成減少，SREBP-1c的蛋白和mRNA含量均降低［13］。骨骼肌的SREBP-1c表達增加會促進脂質合成，增加細胞內脂質的含量，促進脂毒性的產生。本實驗發現，模型組小鼠骨骼肌內游離脂肪酸含量明顯高于正常組組，并且SREBP-1c的蛋白和基因水平發生上調。津力達干預的小鼠骨骼肌內SREBP-1c基因、蛋白水平發生不同程度的下調，可能是由于津力達能夠下調SREBP-1c的表達，因此而減少津力達小鼠骨骼肌內的脂質沉積，降低其脂毒性，以改善胰島素抵抗，但其具體機制還不是很明確。在胰島素抵抗和糖尿病的動物模型中，IRS-2的基因敲除鼠均可觀察到SREBP-1c在肝臟的過度表達［14］。大量研究證明，SREBP-1c的過度表達可以抑制IRS-2和糖原合成酶基因的的表達，但是這些研究大多集中在肝臟上，對骨骼肌的研究關注較少。本實驗中模型組小鼠骨骼肌的IRS-2的表達下降，可能和SREBP-1c的過度表達或者直接參與抑制骨骼肌胰島素信號通路的作用有關，仍需進一步研究。

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Effect of Jinlida Granules on SREBP-1c in skeletalmuscle in fat-induced insulin resistance ApoE-/-m ice

JIN Xin1， ZHANG Hui-xin1，2*， CUIWen-wen1，3， CHANG Li-ping4，5
（1.Heilongjiang University of ChineseMedicine，Harbin 150040，China 2.Yiling Medical Research Institute of Hebei Province，Shijiazhuang 050000，China；3.Key Laboratory of State Administration of Traditional ChineseMedicine（Cardio-Cerebral Vascular Network Disease），Shijiazhuang 050000，China；4.Yiling Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China；5.Key Laboratory of Network Disease of Hebei Province，Shijiazhuang 050000，China）

ABSTRACT：AIMTo investigate the effect of Jinlida Granules（Ginseng Radix et Rhizoma，Polygonati Rhizoma，Atractylodis Rhizoma，Sophorae flavescentis Radix，Ophiopogonis Radix，Rehmanniae Radix，Polygonimultiflori Radix，Corni Fructus，etc）on SREBP-1c in skeletalmuscle in fat-induced insulin resistance ApoE-/-mice.METHODSEightmale C57BL/6Jmice were assigned to the normal group.Forty male ApoE-/-mice fed for sixteen weeks were divided into model group，rosiglitazone group，Jinlida Granules low，middle and high-dose groups，and then gavaged for eightweeks.The organization free fatty acid kit，BCA protein concentration determination method was used to determine skeletalmuscle FFA levels，glucose tolerance test（OGTT）was adopted to evaluate the degree of insulin resistance in mice.Real-time fluorescent quantitative reverse transcription PCR（RTPCR）and Western-blot（Western-blot）method were used to determinemice skeletalmuscle insulin receptor（INSR），insulin receptor substrate 2（IRS-2），cholesterol regulating element binding protein 1c（SREBP-1c）mRNA and protein expression.RESULTSJinlida Granules could decrease fasting blood glucose，cholesterol，triglyceride and low density lipoprotein cholesterol in blood and skeletalmuscle FFA content in mice，while increase high density lipoprotein and raise insulin sensitive index.Jinlida Granules significantly improved abnormal glucose tolerance and up-regulated the skeletalmuscle INSR，IRS-2，down-regulated SREBP-1c mRNA and protein expression in mice.CONCLUSIONJinlida Granules can adjust the skeletalmuscle SREBP-1c protein and gene expression，improve the ApoE-/-mice induced by high fat of insulin resistance.

Jinlida Granules；ApoE-/-mice；insulin resistance；INSR；IRS-1；SREBP-1c

R285.5

A

1001-1528（2015）04-0705-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.004

2014-08-12

國家重點基礎研究發展計劃 （973計劃）項目 （2012CB518606）

金 鑫（1989—），女，碩士生，研究方向為中藥學。E-mail：jinxin19890712@163.com

*通信作者：張會欣（1976—），女，博士，正高級工程師，研究方向為糖尿病微血管病。E-mail：zhanghuixin@yiling.cn