番石榴酸改善INS-1胰島β細胞胰島素抵抗

魏崧丞， 王婧茹，2， 葉開和， 王小康， 馬錦錦， 張曉琦， 葉文才， 葉春玲*

（1.暨南大學藥學院藥理學教研室，廣東廣州510632；2.瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學院，瑞典斯德哥爾摩17177；3.暨南大學中藥與天然藥物研究所，廣東廣州510632）

番石榴酸改善INS-1胰島β細胞胰島素抵抗

魏崧丞1， 王婧茹1，2， 葉開和1， 王小康1， 馬錦錦1， 張曉琦3， 葉文才3， 葉春玲1*

（1.暨南大學藥學院藥理學教研室，廣東廣州510632；2.瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學院，瑞典斯德哥爾摩17177；3.暨南大學中藥與天然藥物研究所，廣東廣州510632）

目的考察番石榴酸對INS-1胰島β細胞胰島素抵抗的作用，并探討其可能的作用機制。方法40 mmol/L葡萄糖干預INS-1胰島β細胞48 h建立胰島素抵抗模型，設番石榴酸干預組 （0.3、1、3、10、30 nmol/L），以及空白對照組、二甲亞砜對照組，胰島素抵抗模型組，正釩酸鈉組 （1mmol/L）和羅格列酮組 （1mmol/L），藥物作用48 h。分別以5.6、16.7 mmol/L葡萄糖干預細胞1 h作為基礎胰島素分泌 （BIS）、高糖刺激胰島素分泌 （GSIS）條件，用放射免疫法檢測藥物對胰島素分泌的影響，結果以該細胞總蛋白量校正。熒光定量PCR法檢測藥物對胰島素抵抗INS-1細胞內PTP1B、PPARγmRNA表達的作用。結果與胰島素抵抗模型組比較，0.3 nmol/L番石榴酸便能促進胰島素抵抗INS-1細胞的GSIS（P＜0.05或P＜0.01）；1 nmol/L番石榴酸即可顯著促進基礎胰島素分泌（P＜0.01）。0.3、3、30 nmol/L番石榴酸均能顯著下調胰島素抵抗INS-1細胞的PTP1BmRNA相對表達（P＜0.05或P＜0.01），其中0.3和3 nmol/L番石榴酸下調作用優(yōu)于正釩酸鈉，上調PPARγmRNA相對表達作用優(yōu)于羅格列酮。結論番石榴酸能夠改善INS-1細胞胰島素抵抗，可能通過下調PTP1B和上調PPARγ基因表達有關。番石榴酸可能通過改善胰島β細胞自身胰島素抵抗而發(fā)揮抗糖尿病作用。

番石榴酸；INS-1胰島β細胞；胰島素抵抗；PTP1B；PPARγ

糖尿病（diabetesmellitus，DM）是由胰島素絕對或相對不足引發(fā)的以慢性高血糖為主要表現(xiàn)的代謝綜合征［1］。糖尿病分為1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠期糖尿病及其他類型糖尿病，其中90%為2型糖尿病（type 2 diabetesmellitus，T2DM）患者［2］。2型糖尿病的發(fā)病機制雖尚未闡明，但胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是其發(fā)病的主要環(huán)節(jié)之一［3］。胰島素抵抗在2型糖尿病病程早期即存在，甚至可能在高血糖之前出現(xiàn)，其貫穿在2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的全過程，實質是通過降低胰島素介導的靶細胞對胰島素的敏感性，而導致靶組織代謝能力異常。流行病學證據(jù)證明糖耐量受損及糖尿病、高血壓、血脂紊亂、動脈硬化均與胰島素抵抗有關。在胰島素抵抗時，胰島β細胞可代償性地分泌更多的胰島素，以維持正常的空腹或餐后血糖水平，機體糖耐量仍在正常水平［4］。若胰島β細胞功能受損，失代償，其功能障礙進一步加重，導致糖耐量受損，誘發(fā)糖尿病。

隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)，胰島β細胞自身具有胰島素信號傳遞級聯(lián)反應［6］。研究人員證實胰島β細胞胰島素受體基因敲除小鼠 （βIRKO）會出現(xiàn)胰島素第一相分泌喪失80%以上，這與人類2型糖尿病發(fā)病初期的臨床特征相類似［7］。說明胰島β細胞胰島素信號轉導通路發(fā)生障礙時，會影響胰島素的分泌，人們將此定義為胰島β細胞的胰島素抵抗。綜上所述，胰島素抵抗不單只發(fā)生在胰島素靶細胞上，分泌胰島素的胰島β細胞也會出現(xiàn)胰島素抵抗，其發(fā)生機制可能與外周靶細胞相類似：以胰島素信號轉導通路異常為主要因素。因此，2型糖尿病患者中β細胞分泌胰島素功能的減弱也可能與自身胰島素抵抗程度相關。改善胰島β細胞自身發(fā)生胰島素抵抗也可成為藥物研發(fā)新方向。

番石榴（Psidium guajava）為桃金娘科番石榴屬植物［8］。本課題組首次發(fā)現(xiàn)番石榴葉總三萜（total triperpenoids from Psidium guajava leaf，TTPGL）是番石榴葉抗糖尿病的有效組分［9］（發(fā)明專利號：ZL201110100466.5）并認為TTPGL降血糖的活性部位以烏蘇烷型多羥基三萜酸為主。作為其主要成分之一的番石榴酸（guavenoic acid），它同烏蘇酸（ursolic acid）、2α-羥基烏蘇酸（2αhydroxyl-ursolic acid）、積雪草酸（asiatic acid）一起共占總含量的50%以上。但目前，對于番石榴酸的抗糖尿病作用及其作用機制分析，尚未見文獻報道。為進一步探討番石榴葉總三萜的抗糖尿病作用及其機制，本實驗采用INS-1胰島β細胞建立胰島β細胞胰島素抵抗模型，探討番石榴葉總三萜中主要成分番石榴酸對胰島β細胞胰島素抵抗的影響；并通過觀察番石榴酸對INS-1β細胞內蛋白酪氨酸磷酸酶1B（protein-tyrosine phosphatase 1B，PTP1B）基因、過氧化物酶增殖物活化受體 （peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）基因表達的影響，揭示其改善胰島β細胞胰島素抵抗的作用機制。

1 材料

1.1 細胞 大鼠胰島細胞瘤細胞株，ISN-1（資源編號3111c0001ccc000378）購自中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和細胞資源中心。

1.2 主要儀器 SAFIRZ-Z酶標儀（TZCAN，奧地利）；SN-682B全自動γ計數(shù)器 （上海日環(huán)儀器有限公司）；PTC-1152 PCR儀（BIO-RAD，美國）；CFD-3120熒光實時定量PCR儀（BIO-RAD，美國）。

1.3 藥品及主要試劑 番石榴酸 （結構式見圖1）來源于番石榴的干燥葉，溶劑法純化工藝提取，純度為95%，實驗前用二甲亞砜 （DMSO）溶解，4℃保存。RPMI 1640培養(yǎng)液 （Lot.8112347）、0.05%胰酶-EDTA（1×）（Lot.210175K）、胎牛血清（Lot.1184652），均購自GIBCO公司；D-（+）-葡萄糖、2β-巰基乙醇、DMSO，購自SIGMA公司；碘 ［125I］胰島素放射免疫分析試劑盒，購自北京北方生物技術研究所；馬來酸羅格列酮，上海原葉生物科技有限公司提供，實驗前用DMSO溶解；正釩酸鈉，購自Aladdin，實驗前用DMSO溶解；RIPA裂解液（強）、BCA蛋白定量試劑盒，購自碧云天生物技術研究所；TRIzol，購自Invitrogen；ReverTra Ace qPCR RT Kit，購自TOYOBO；SsoFast EvaGreen Supermix qPCR Kit，購自BIORAD；DNA引物，委托華大基因合成。

圖1 番石榴酸結構式Fig.1 Structural formula of guavenoic acid

2 方法

2.1 INS-1胰島細胞的培養(yǎng) 培養(yǎng)條件為含有10%FBS、5.6 mmol/L葡萄糖、100 U雙抗、50 mmol/L 2β-巰基乙醇的RPMI1640培養(yǎng)液；于37℃，5%CO2環(huán)境培養(yǎng)。

2.2 胰島素抵抗INS-1細胞的胰島素分泌的測定

取對數(shù)生長期的細胞，調整細胞密度至1×105個/mL，接種于48孔板。24 h后棄舊培養(yǎng)液。空白對照組、二甲亞砜對照組給予完全培養(yǎng)液，胰島素抵抗模型組均給予含40 mmol/L葡萄糖完全培養(yǎng)液，正釩酸鈉組 （1 mmol/L）、羅格列酮組（1 mmol/L）、番石榴酸組 （0.3、1、3、10、30 nmol/L）分別給予含有相應藥物的40 mmol/L葡萄糖完全培養(yǎng)液。作用48 h，棄上清，PBS洗后加入300 ml/孔HBSS緩沖液于37℃平衡30 min；各組的基礎糖刺激 （BIS），高糖刺激 （GSIS）分別給予5.6 mmol/L、16.7 mmol/L葡萄糖-HBSS溶液，300 mL/孔。37℃孵育1 h，取上清液，應用放射免疫法測定胰島素量。結果以胰島細胞總蛋白量校正。以單位質量胰島素濃度 （每孔胰島素含量/相應的蛋白含量）表示，即IU/（L·g protein）。

2.3 胰島素抵抗的INS-1細胞PTP-1B，PPARγ mRNA的表達的測定 取對數(shù)生長期的細胞，調整細胞密度至2×105個/mL，接種于24孔板，24 h后棄培養(yǎng)液。干預方法及分組同 “2.2”項，其中番石榴酸劑量調整為：0.3、3、30 nmol/L。藥物作用48 h后，棄上清，PBS洗，按TRIzol是結合實驗手冊提取總RNA，測定樣品濃度與純度后，逆轉錄。參照TOYOBO RT試劑盒進行逆轉錄。以RT產(chǎn)物為模板，加入SsoFast EvaGreen Supermix、對應引物，以10mL體系進行熒光定量PCR，反應條件為：95℃30 s，95℃5 s、62℃/54.5℃（PTP1B/PPARγ）5 s共進行45個循環(huán)，溶解曲線65～95℃（in 0.5℃inc.）5 s/step。

設計引物序列，分別為：RAT-PTP1B引物（正向引物5'-ACC CTG TGC GGA AAT GCG GG-3'，反向引物5'-GGC AGT CAG TCA ACC CCG GC-3'）、RAT-PPARγ引物（正向引物5'-TGT GGA CCT CTC TGT GAT-3'，反向引物5'-CAT TGG GTC AGC TCT TGT GA-3'）、內參GAPDH引物（正向引物5'-CCC ACT CCT CCA CCT TTG AC-3'，反向引物5'-TCT TCC TCT TGTGCT CTT GC-3'），委托華大基因進行引物合成。

2.4 統(tǒng)計學分析 以上實驗均進行重復性實驗，結果以 “平均值±標準差” （）表示。應用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件對實驗結果進行統(tǒng)計學分析，兩組間比較用t-test，P＜0.05被認為有顯著性差異，P＜0.01為差異非常顯著；應用GraphPad Prism 5.0軟件繪圖。

3 結果

3.1 番石榴酸對胰島素抵抗INS-1細胞（IR-INS-1）分泌功能的影響 應用放射免疫法測定胰島素抵抗INS-1胰島β細胞在番石榴酸干預48 h后的BIS、GSIS值，用對應的總蛋白量校正。結果發(fā)現(xiàn)，40mmol/L葡萄糖干預48 h的胰島素抵抗模型組與二甲亞砜組［BIS為（165.1±8.7）IU/（L·g protein）、GSIS為（215.1±8.1）IU/（L·g pro-tein）］比較，胰島素抵抗組BIS與GSIS均有十分顯著的降低 （P＜0.01），分別為 （102.7±12.6）、（127.1±31.8）IU/（L·g protein），說明INS-1胰島β細胞胰島素抵抗模型構建成功。羅格列酮組和正釩酸鈉組INS-1β細胞的BIS、GSIS與胰島素抵抗模型組比較，均有顯著的升高 （P＜0.05或P＜0.01）。

與胰島素抵抗模型組BIS［（102.7±12.6）IU/（L·g protein）］比較，1、3、10、30 nmol/L的番石榴酸均能顯著促進胰島素抵抗INS-1細胞的基礎分泌能力 （P＜0.05），分別為（172.5± 33.6）、（140.0±39.5）、（157.0 ±12.4）、（149.3±7.2）IU/（L·g protein）；與IR模型組GSIS［（127.1±31.8）IU/（L·g protein）］比較，較低劑量的番石榴酸 （0.3、1 nmol/L）便能顯著促進胰島素抵抗INS-1細胞的GSIS（P＜0.01），分別為（297.9±0.8）、（237.2±19.7）IU/（L·g protein），結果見圖2。

圖2 番石榴酸對胰島素抵抗INS-1細胞分泌功能的影響Fig.2 Effects of guavenoic acid on insulin secretion function of IR-INS-1 cells（，n=6）

3.2 番石榴酸對IR-INS-1細胞PTP1B、PPARγ mRNA表達的影響 番石榴酸、40 mmol/L葡萄糖干預INS-1胰島β細胞48 h后，提取總RNA并測定其濃度與純度 （測定結果A260/280在1.8～2.0正常范圍內），逆轉錄后進行熒光定量PCR擴增，測定番石榴酸對IR-INS-1細胞中PTP1B、PPARγmRNA相對表達量。

3.3 PTP1B mRNA相對表達 胰島素抵抗模型組與二甲亞砜對照組（1.00±0.07）比較，PTP1B mRNA相對表達上調顯著 （P＜0.05），為（1.23±0.07）；番石榴酸組與胰島素抵抗模型組比較，各濃度 （0.3、3、30 nmol/L）番石榴酸均能顯著下調胰島素抵抗INS-1細胞內PTP1B mRNA相對表達 （P＜0.05或P＜0.01），分別為（0.62± 0.12）、（0.55±0.03）、（0.73±0.18），其中0.3、3 nmol/L番石榴酸下調作用強于正釩酸鈉 （0.76± 0.11）。結果詳見圖3。

圖3 番石榴酸對IR-INS-1細胞PTP1B m RNA表達的影響（，n=6）Fig.3 Effects of guavenoic acid on relative RNA expression of PTP1B in IR-INS-1 cells（，n=6）

3.4 PPARγmRNA相對表達 胰島素抵抗模型組與二甲亞砜對照組 （1.53±0.32）比較，PPARγ mRNA相對表達下調十分顯著 （P＜0.01），達（0.84±0.10）；番石榴酸組與胰島素抵抗模型組比較，各濃度 （0.3、3、30 nmol/L）番石榴酸均能極顯著上調胰島素抵抗INS-1細胞內PPARγmRNA表達 （P＜0.01），分別為 （12.92±0.97）、（12.78±1.71）、（3.78±0.03）；且 0.3、3 nmol/L番石榴酸上調作用明顯強于羅格列酮（9.40±0.42）。結果見圖4。

4 討論

胰島素主要有兩方面的生物效應： （1）調節(jié)代謝，在維持機體新陳代謝穩(wěn)態(tài)的過程中起全面促進合成代謝的作用； （2）調節(jié)細胞增殖，抑制凋亡。胰島素生物效應是通過與胰島素受體結合后，啟動細胞內胰島素信號轉導級聯(lián)反應實現(xiàn)的。胰島素信號傳導通路由以下成員組成：胰島素受體（Insulin Receptor，IR）、胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS）［10］、磷脂酰肌醇-3激酶-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 （PI3K-Akt）［11］，絲裂原激活蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）等［12］。胰島素信號轉導通路的下游信號反應主要有兩條通路：（1）PI3K-AKT/PKB，主要發(fā)揮胰島素代謝效應，介導細胞增殖等； （2）Shc/Raf/MAPK，主要調節(jié)受體基因轉錄，調節(jié)細胞生長、凋亡。在胰島β細胞中，以上通路也都是存在的。胰島β細胞也可以通過以上信號轉導途徑對其自身的胰島素分泌、反饋、再合成進行調控。

圖4 番石榴酸對IR-INS-1細胞PPARγm RNA表達的影響（，n=6）Fig.4 Effects of guavenoic acid on relative RNA expression of PPARγin IR-INS-1 cells（，n=6）

胰島素信號轉導通路對胰島β細胞功能、外周靶細胞對葡萄糖的攝取及利用均有關鍵作用。目前，作為胰島素信號轉導通路調節(jié)因子的PTP1B和PPARγ已成為糖尿病治療的靶點。PTP1B是最早發(fā)現(xiàn)并被編碼的蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinases，PTPase）家族成員之一［13］，廣泛而豐富地分布于各種細胞細胞漿內，屬于去磷酸化酶［14］，PTP1B是對胰島素信號轉導起到負性調控胰島素作用受體通路的作用［15-16］。PTP1B基因敲除小鼠與對照小鼠相比，其胰島素敏感性顯著增強；還能延緩IRS-2基因敲除小鼠發(fā)生糖尿病的時間。另外，PTP1B與2型糖尿病的胰島素抵抗密切相關［17-18］。研究人員在骨骼肌中過度表達PTP1B，通過應用葡萄糖鉗夾術，證實PTP1B表達增高的小鼠具有明顯的胰島素抵抗特征；而抑制骨骼肌PTP1B表達，則能夠抵抗白介素-6誘導的胰島素抵抗［19］。

過氧化物酶增殖物活化受體家族（PPARs），為核激素受體家族成員，是配體依賴性轉錄因子，可以調節(jié)細胞生長、分化及代謝等相關基因［20］。PPARγ與PPARα，PPARδ3種亞型是PPARs存在形式［21］。與相應的配體結合活化后，PPARs方能與維甲酸X受體 （RXR）異源二聚化，再通過與目的基因調控區(qū)內的PPAR應答元件（peroxisome proliferator response element，PPRE）作用，以實現(xiàn)調控目的基因的轉錄［21-23］。PPARγ活力受絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）或c-Jun的N-末端激酶信號通路調控。其中PPARγ主要表達于脂肪組織、肝臟、骨骼肌，能促進脂肪細胞分化的轉錄因子。在糖代謝調節(jié)中激活后的PPARγ發(fā)揮改善外周組織胰島素敏感性作用［24-25］。

胰島β細胞具有完整的胰島素信號轉導通路，并且能夠表達主要轉導調節(jié)因子，例如PTP1B、PPARγ。研究報道，胰島素抵抗不單只發(fā)生在胰島素靶細胞上，分泌胰島素的胰島β細胞自身也會出現(xiàn)胰島素抵抗，其發(fā)生機制可能與外周靶細胞相類似：以胰島素信號轉導通路異常為主要因素。

本實驗使用40 mmol/L高濃度的葡萄糖干預INS-1胰島β細胞48 h，建立胰島素抵抗模型。結果發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗模型組的BIS、GSIS顯著下降，而陽性藥物羅格列酮、正釩酸鈉均能使BIS、GSIS恢復。以上結果表明，該胰島素抵抗模型成功建立。實驗結果顯示，番石榴酸能夠恢復INS-1胰島β細胞胰島素抵抗模型的BIS、GSIS，其中對GSIS作用尤為顯著，表明番石榴酸具有改善INS-1胰島β細胞自身胰島素抵抗的作用。

在胰島素信號轉導通路中，胰島素受體與胰島素受體底物均是PTP1B的底物，能夠在PTP1B的作用下去磷酸化而阻斷信號傳導［26］。本實驗結果顯示，陽性藥正釩酸鈉能顯著下調胰島素抵抗INS-1細胞的PTP1B基因表達；番石榴酸亦能顯著下調胰島素抵抗INS-1細胞的PTP1B基因表達，此結果與其影響胰島素分泌的結果一致，其可能通過下調PTP1B基因表達，從而改善INS-1細胞胰島素抵抗狀態(tài)。

已有研究發(fā)現(xiàn)，內源性PPARγ以配體依賴的方式在INS-1細胞中發(fā)揮作用；在沒有配體存在下，過表達PPARγ，能夠增加INS-1細胞的GSIS，說明GSIS是受PPARγ介導的；當同時增加PPARγ與RXR時，能夠產(chǎn)生協(xié)同效應，說明對GSIS目的基因的調控需要該二聚體的存在；PPARγ能夠以配體依賴的形式通過上調GLUT2與Cb1-associated protein（CAP）基因的表達來實現(xiàn)對胰島β細胞GSIS的促進作用［27］。本實驗結果表明，陽性藥羅格列酮能顯著上調胰島素抵抗INS-1細胞的PPARγ基因表達。番石榴酸在低劑量下即能對PPARγ基因表達量產(chǎn)生顯著的上調作用，此作用結果與其促進胰島素分泌的結果一致，提示其可能通過上調PPARγ基因表達，從而改善INS-1細胞胰島素抵抗狀態(tài)。

總之，番石榴酸能顯著改善胰島素抵抗，其作用機制可能與其下調PTP1Bm RNA、上調PPARγ mRNA基因表達有關。

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Effect of guavenoic acid on im proving insulin resistance in INS-1 cells and itsmechanisms

WEISong-cheng1， WANG Jing-ru1，2， YE Kai-he1， WANG Xiao-kang1， MA Jin-jin1， ZHANG Xiao-qi3， YEWen-cai3， YE Chun-ling1*

（1.Department of Pharmacology，Pharmacy Collegeof Jinan University，Guangzhou 510632，China；2.The Karolinska Institute in Sweden，Stockholm，Sweden 17177；3.Research Institute of Traditional Chinese Medicine and Natural Medicine of Jinan University，Guangzhou 510632，China）

AIMTo investigate the improvementeffectof guavenoic acid（GA）on insulin resistance in INS-1 cells and its possiblemechanism.M ETHODS40mmol/L glucose caused stimulation to INS-1 cells in vitro for 48h to establish the insulin resistance model（IR）.These INS-1 cells were assigned into guavenoic acid groups（0.3，1，3，10，30 nmol/L），DMSO group，the IR group，sodium orthoranadate group（1 mmol/L），Rosiglitazone group（1 mmol/L），and the control group，then 5.6，16.7 mmol/L glucose were used to challenge INS-1 cells for 1h，respectively，to test their basal insulin secretion（BIS）and glucose stimulated insulin secretion（GSIS）.The influence of test drugs to insulin secretion was calculated by radioimmunology and was calibrated by total proteins in cells.ThemRNA expressions of PTP1B and PPARγweremeasured by q-PCR.RESULTSCompared with themodel group，guavenoic acid（0.3 nmol/L）could promote GSIS of insulin resistance INS-1 cells（P＜0.05 or P＜0.01）；guavenoic acid（1 nmol/L）played a significant role in the promotion of BIS（P＜0.01）.Compared with the model group，guavenoic acid（0.3，3，and 30 nmol/L）could significantly decrease relative expression of PTP1BmRNA in insulin resistance INS-1 cells（P＜0.05 or P＜0.01）.Downward effectof guavenoic acid（0.3 and 3 nmol/L）was better than thatof sodium orthovanadate；the incrementof relative expression of PPARγmRNA by guavenoic acid（0.3 and 3 nmol/L）wasmore than that of Rosiglitazone.CONCLUSIONGuavenoic acid can significantly improve the insulin resistance of INS-1 cells，which may be related to the down-regulation of PTP1B gene expression and up-regulation of PPARγgene expression.

guavenoic acid；INS-1βcells；insulin resistance；PTP1B；PPARγ

R285.5

A

1001-1528（2015）04-0710-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.005

2014-05-18

廣東省高等學校科技創(chuàng)新重點項目 （cxzd1111）

魏崧丞（1988—），女，碩士生，研究方向為內分泌藥理學。Tel：13751824465，E-mail：wswschello@163.com

*通信作者：葉春玲，女，博士，教授，碩士生導師，研究方向為內分泌藥理學。Tel：（020）85223843，E-mail：yechunling2005@ 163.com