響應曲面法優化鮮地龍可溶性蛋白提取工藝

何 超， 索緒斌， 張 涵， 王偉明*

（1.黑龍江省中醫藥科學院，黑龍江哈爾濱150036；2.廣東藥學院，廣東廣州51006）

響應曲面法優化鮮地龍可溶性蛋白提取工藝

何 超1， 索緒斌2， 張 涵1， 王偉明1*

（1.黑龍江省中醫藥科學院，黑龍江哈爾濱150036；2.廣東藥學院，廣東廣州51006）

目的優化鮮地龍中可溶性蛋白的提取工藝。方法冰浴超聲提取法，采用響應曲面Box-Benhnken設計，考察攪碎時間、料液比、提取液的pH對可溶性蛋白得率的影響，對鮮地龍可溶性蛋白冰浴超聲提取工藝進行優化。結果冰浴超聲提取鮮地龍蛋白的最佳工藝條件為加入2倍量pH 7.46的緩沖液后攪碎256 s，再加入4.63倍的緩沖液冰浴超聲15 min，此條件下蛋白質得率為21.01%。結論冰浴超聲法簡單、快速、高效，工藝穩定可行，適用于鮮地龍可溶性蛋白提取。

響應面法；鮮地龍；可溶性蛋白；冰浴超聲

地龍為環節動物門鉅蚓科動物參環毛蚓Pheretima aspergillum（E.perrier）、通俗環毛蚓Pheretima vulgaris chen、威廉環毛蚓Pheretima guillelmi（Michaelsen）或櫛肓毛蚓Pheretima pectinifera Michaelsen的干燥體。前1種俗稱 “廣地龍”，后3種俗稱 “滬地龍”［1］。地龍在我國藥用歷史悠久，《本草綱目》上就記載了地龍的作用?，F代中醫藥理論認為地龍有清熱定驚，通絡，平喘，利尿的功效［2］。近代藥理研究表明地龍有抗凝血溶血的雙重作用、改善微循環和心腦血管病理狀態、調節肝臟功能等作用［3-4］?？扇苄缘鞍资堑佚堉械闹饕钚晕镔|，國內外研究表明其是地龍溶血栓、抗血栓的主要活性物質［5-6］。

已有研究顯示鮮地龍中的蛋白種類及含有量都比干地龍豐富［7］，而查閱文獻發現對地龍蛋白提取工藝的研究很少，且研究對象多為干地龍［8-9］。因而實驗旨在于優化對鮮地龍可溶性蛋白的提取工藝，對于地龍藥材的合理、有效利用具有重要意義。

1 材料、試劑和儀器

本實驗所用鮮地龍均來自東莞郊區，從野外收集后在極近自然環境中養殖保存以備實驗之用。

考馬斯亮藍G250（Ameresco-0615，Biosharp進口分裝）；牛血清白蛋白 （上海藍季科技發展有限公司）；所用其他試劑均為國產分析純試劑；所用水均為純化水。

SG280-B4榨汁/攪拌器 （中山市好媽咪電器廠）；TGL-16C高速離心機 （上海安亭科學儀器廠）；Sartorius BAS 124S型分析天平（賽多利斯科學儀器 （北京）有限公司）；JJ500型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；PHS-3C型pH計 （上海雷磁）；KQ5200B超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；759型紫外可見分光光度計 （上海菁華科技儀器有限公司）等。

2 方法與結果

2.1 可溶性蛋白測定［9］以牛血清白蛋白為對照品，采用Brodford法測定提取液中可溶性蛋白的量，本實驗中未特別說明的蛋白含有量均以牛血清白蛋白計。

考馬斯亮藍G250溶液的配制：稱取100 mg考馬斯亮蘭G250，用50 mL 95%的乙醇超聲分散后于50～60℃水浴中充分溶解2 h，再加入120 mL 85%的磷酸50～60℃水浴2 h，用去離子水定容至1 L，過濾，濾液置棕色瓶內避光保存備用。

2.1.1 標準曲線的制備 精密稱取24.4 mg標準牛血清白蛋白（BSA）以0.9%NaCl溶液溶解后定容于25 mL量瓶中，作為標準貯備液，備用。精密吸取標準貯備液2.00、2.75、3.50、4.25、5.00 mL分別置于10 mL量瓶中，以0.9%NaCl溶液定容至刻度，得質量濃度分別為 195.2、268.4、341.6、414.8、488.0μg/mL的BSA溶液。向5支5 mL具塞試管中依次加入0.10 mL上述BSA溶液，以0.9%NaCl溶液補至0.25 mL，加入5 mL考馬斯亮藍G250溶液，充分搖勻后放置15 min，于595 nm處測定吸光度值。以標準蛋白質量 （μg）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得線性方程為Y=0.005 9x+0.085 1，r2=0.998 6，在19.52～48.80μg范圍內線性良好可用于定量測定。

2.1.2 精密度考察 精密吸取線性項下質量濃度為341.6μg/mL的對照品溶液0.10 mL，按方法測定吸光度，重復測定6次，計算RSD為0.36%，表明儀器精密度良好。

2.1.3 重復性考察 精密吸取6份線性項下質量濃度為341.6μg/mL的標準品溶液0.10 mL，按方法測定吸光度，計算樣品中可溶性蛋白含量，RSD為2.07%。

2.1.4 加樣回收率 取已測定蛋白量的鮮地龍提取液 （含可溶性蛋白8.90 mg），分別加入BSA6.25、7.80、9.35 mg，每個樣品平行3份，以0.9%NaCl溶液稀釋至適宜濃度，依法測定吸光度，結果平均回收率為106.1%，RSD為2.1%。

2.1.5 穩定性研究 取線性項下高、中、低質量濃度的對照品溶液，依法測定加入考馬斯亮藍G250搖勻后15、20、30、40、50、60 min時的吸光度，計算RSD為1.7%，表明該法在顯色后15～60 min內穩定性良好，適于含量測定。

2.2 樣品測定

2.2.1 樣品溶液制備 鮮地龍洗凈沙土后以10%乙醇麻醉，洗至無醇味后解剖除去腹腔中的泥沙及雜物。用濾紙吸干其表面附著的水，精密稱量后，加入2倍量緩沖液，攪碎，再加提取液至所需體積，冰浴超聲15min。10 000 r/min離心5min后取上清液，稀釋至適宜濃度即可。精密吸取0.10 m L樣品溶液，照 “2.1.1”項下操作，測定樣品吸光度值，計算蛋白量。

2.2.2 樣品中蛋白測定 參照 《中國藥典》2010年版一部附錄ⅨH水分測定法測定鮮地龍含水量。依照公式 （1）計算可溶性蛋白提取率，式中r為鮮地龍的含水量。

2.3 鮮地龍可溶性蛋白提取工藝優化

2.3.1 單因素預試驗 選擇冰浴超聲提取法，考察了攪碎時間、料液比、提取液的pH對可溶性蛋白得率的影響。

2.3.1.1 料液比考察 平行取多個樣品，依照樣品制備方法，分別加入2、4、6、8、10、12、14倍pH 7.4的提取液，攪碎30 s，冰浴超聲15 min，離心后依法測可溶性蛋白的提取率。以蛋白得率為縱坐標，提取溶劑倍數為橫坐標，制作蛋白得率（%） -提取溶劑倍數曲線，實驗結果表明6倍量pH 7.4的提取液可得蛋白提取率最高，而后隨著提取液的增加，蛋白提取率反而降低。

2.3.1.2 提取溶劑的pH考察 平行取多個樣品，依照樣品制備方法，分別加入6倍量的pH分別為6.8、7.0、7.4、7.8和8.0的提取液，攪碎30 s，冰浴超聲15 min，離心后依法測可溶性蛋白得率。以蛋白得率為縱坐標，提取液pH為橫坐標，制作蛋白得率 （%）-提取液pH曲線，實驗結果表明在一定的pH范圍內，提高提取液的pH可以提高蛋白提取率，但超過7.4后，再提高提取液的pH反而不利于可溶性蛋白的提取，因而提取液最適宜pH應為7.4。

2.3.1.3 攪碎時間考察 平行取多個樣品，依照樣品制備方法，加入6倍量pH 7.4的提取液，分別攪碎 30、120、210、300、390 s，冰浴超聲15 min，離心后依法測可溶性蛋白的提取率。以提取率為縱坐標，提取時間為橫坐標，制作蛋白得率（%） -攪碎時間 （s）曲線，實驗結果表明，總體上隨著攪碎時間的增加，蛋白得率升高，但其在120～210 s處有一個平臺，說明其中可能有上升再下降的趨勢，結合攪碎時的觀察，隨著攪碎時間的延長，樣品膠狀嚴重不利于離心，且設備發熱嚴重。

綜合各因素，最終選擇提取液倍數4～8，提取液pH 7.0～7.8，攪碎時間30～330 s進行后續響應面設計，優化提取工藝。

2.3.2 Box-Behnken響應曲面法（RSM）優化提取工藝 依據單因素試驗結果，根據Box-Behnken響應曲面設計原理，考察攪碎時間、料液比、提取液的pH對可溶性蛋白得率的影響。采用Design-Expert7.1.6統計分析軟件設計實驗，分析結果。實驗水平因素安排見表1，響應面分析實驗設計及結果見表2。

表1 響應曲面法實驗因素水平Tab.1 Factors and levels of RSM test

表2 鮮地龍可溶性蛋白提取工藝優化實驗設計及結果Tab.2 Conditions and results for extraction optim ization

對表2的實驗結果回歸擬合得到多元二次回歸方程模型：

R1=-994.458 69-0.168 78A+19.353 87B+ 260.749 38C-2.658 33×10-3AB+0.032 125AC-1.984 38BC-1.070 33×10-4A2-0.307 0B2-17.145 31C2；式中A為攪碎時間，B為提取溶劑倍數，C為提取溶劑的pH，R1為可溶性蛋白得率。

對該模型的方差分析結果見表3。由方差分析結果可知該模型 （P=0.00 04，P＜0.05）顯著，相關系數R2為0.961 6，模型調整系數Radj為0.912 2，失擬項 （P=0.563 7，P＞0.05），表明失擬項相對于絕對誤差不顯著，該模型對實驗的擬合程度良好，能較好的反映各因素與響應值之間的真實關系，可利用該模型對鮮地龍可溶性蛋白得率進行分析預測。

對模型回歸方程的系數的顯著檢驗分析可知，一次項A、B，交互項AC、BC，二次項A2、B2、C2均為顯著影響項，表明各因素對可溶性蛋白得率的影響不是簡單的線性關系。由F值的大小可以推斷，在所選擇的試驗范圍內，3個因素對可溶性蛋白得率影響的順序為攪碎時間＞提取溶劑倍數＞提取溶劑pH。

表3 方差分析Tab.3 ANOVA regression analysis

攪碎時間、提取溶劑倍數及提取溶劑pH3個因素間的交互作用對鮮地龍蛋白得率的影響如圖1～3所示。

分析圖1A～3A可知，當攪碎時間 （A）、提取溶劑倍數 （B）及提取溶劑pH（C）3個因素均取值較小時，響應曲面較陡，說明在各要素均處于較低水平時，各要素對蛋白得率R1的影響顯著；而B、C均處于較高水平時，R1的響應面幾乎為平面，說明，此時BC對R1的影響較小。

分析圖1B～3B可知，各要素的影響與響應面分析結果一致；AC、BC等高線圖均呈明顯的橢圓形，說明攪碎時間和提取溶劑pH及提取溶劑倍數和提取溶劑pH兩個因素之間的交互作用均顯著，與方差分析結果一致。

經過Box-Behnken設計優化提取條件，鮮地龍可溶性蛋白提取的最佳工藝條件為：攪碎257 s，提取溶劑6.63倍，提取溶劑的pH為7.46，此時可溶性蛋白的理論得率為19.98%。

圖1 攪碎時間和提取溶劑倍數對蛋白得率影響的效應面圖及等高線圖Fig.1 M ultip le effects of grinding time and extraction solven t on protein yield response surface map and contour plots

圖2 攪碎時間和提取溶劑pH對蛋白得率影響的效應面圖及等高線圖Fig.2 Effects of grinding time and extraction solvent pH on protein yield response sur facemap and contour plots

圖3 提取溶劑倍數和提取溶劑pH對蛋白得率影響的效應面圖及等高線圖Fig.3 Effects ofmu ltip le extraction solvent and pH on protein yield response surfacemap and contour m ap

2.3.3 驗證試驗 按最優提取工藝條件進行3次驗證試驗，結果蛋白質平均得率21.01%，RSD 1.34%，與理論值的相對誤差為5.11%，說明該優選工藝重復性好，穩定可行。

3 討論與結論

地龍中成分含有量最為豐富的物質即為蛋白質，近年來關于地龍藥效的研究也表明蛋白質類成分是其主要的活性成分［10-12］。對于地龍蛋白的獲取，以前多采用動物組織中可溶性蛋白獲取的通用方法［13-14］，采用高速勻漿或者低溫冷浸，離心取上清液，無機鹽或有機試劑沉淀，透析除鹽，冷凍干燥獲取粗蛋白。這些方法要么對設備要求高，要么有處理周期長、處理量小的缺點。而煎煮或者回流等熱提方法本身容易破壞蛋白質的結構。本實驗在冰浴超聲提取方法優化的同時，對地龍蛋白的低溫冷浸法進行了較深入的研究，發現低溫冷浸法不僅提取周期長，而且蛋白得率不是很高，工藝重現的難度也較大。采用冰浴超聲提取方法，不僅簡單可行，而且蛋白提取率高、提取周期短。優化后的工藝粗蛋白得率可達21.01%，可以用于鮮地龍可溶性蛋白的提取。

本研究利用響應曲面分析法對冰浴超聲法提取鮮地龍可溶性蛋白的工藝進行優化。結果表明此方法具有良好的應用性和預測性，能提供較準確的變量和誤差信息，為鮮地龍可溶性蛋白的進一步研究提供了技術基礎。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版二部［S］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：113.

［2］高學敏.中藥學［M］.北京：中國中醫藥出版社，2002：480-481.

［3］Mihara H.Fibrinolytic enzymes extracted from the earthworm. Lumbricus rubellus：a possible thrombolytic agent［J］.Nihon Seirigaku Zasshi，1991，53（7）：231-243.

［4］Trisina J，Sunardi F，Suhartono MT，et al.A protein extract from Lumbricus rubellus，possesses antithrombotic and thrombolytic activities［J］.Biomed Biotechnol，2011，10（1155）：1.

［5］Yan X M，Kim CH，Lee C K，etal.Intestinalabsorption of fibrinolytic and proteolytic lumbrokinase extracted from earthworm，eisenia and rei［J］.Physiol Pharmacol，2010，14（2）：71-75.

［6］Hwang C M，Kim D I，Huh S H，et al.In vivo evaluation of lumbrokinase，a fibrinolytic enzyme extracted from Lumbricus rubellus，in a prosthetic vascular graft［J］.Cardiovasc Surg（Torino），2002，43（6）：891-894.

［7］陳麗艷，張 迎，綦 菲，等.地龍的鮮品和干品可溶性蛋白及纖溶酶活性的對比研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18（8）：89-92.

［8］毛泉明，張 寧，王憶勤，等.地龍中蛋白質的提取工藝研究［J］.上海中醫藥雜志，2010，44（3）：74-77.

［9］楊豐云，付延明，郭立偉，等.響應面分析法優化濕法超微粉碎地龍蛋白的提取工藝［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18（10）：33-37.

［10］張蘭娥，李清華，康 白，等.地龍蛋白肽的成分分析及對血管緊張素轉化酶活力的影響［J］.天然產物研究與開發，2013，25（12）：1740-1742，1747.

［11］楊 明，陳學東，彭 韡.地龍蛋白組分Ⅲ對鼻咽癌裸鼠移植瘤微血管密度的影響［J］.湖南中醫藥大學學報，2008，28（4）：39-40.

［12］傅煒昕，董占雙，李鐵英，等.免疫活性地龍肽的制備及其對小鼠NK細胞活性的影響［J］.中國醫科大學學報，2007，36（6）：650-652.

［13］盧 歡，朱和平，嚴國俊，等.正交設計優選地龍的提取工藝［J］.現代中藥研究與實踐，2009，23（1）：58-61.

［14］王子佳，李紅梅，弓愛君，等.蛋白質分離純化方法研究進展［J］.化學與生物工程，2009，26（8）：8-11.

Extraction optim ization for fresh earthworm protein by response surface m ethodology

HE Chao1， SUO Xu-bin2， ZHANG Han1， WANGWei-ming1*

（1.Heilongjiang Academy of Chinese Medicine Sciences，Harbin 150036，China；2.Guangdong College of Pharmacy，Guangzhou 51006，China）

response surfacemethodology（RSM）；fresh earthworm；soluble protein；ice-bath ultrasound

R284.2

A

1001-1528（2015）04-0758-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.014

2014-08-28

國家自然科學基金資助項目（80303288）；黑龍江省應用技術研究與開發計劃項目院所創新專項（2013G1081）

何 超（1989—），女，碩士生，從事中藥研發。E-mail：hechao.1990@163.com

*通信作者：王偉明，女，博士，研究員，碩士生導師，從事中藥及保健品研發。E-mail：zyyiy@163.com