多目標遺傳算法優化黃連的提取工藝

徐冰婉， 徐小雯， 黃家衛

（浙江中醫藥大學藥學院，浙江杭州310053）

多目標遺傳算法優化黃連的提取工藝

徐冰婉， 徐小雯， 黃家衛*

（浙江中醫藥大學藥學院，浙江杭州310053）

目的采用多目標遺傳算法（multi-objective genetic algorithm，MOGA）優選黃連的最佳提取工藝條件。方法采用MOGA法，以鹽酸小檗堿的提取率和浸膏得率為指標，對黃連的提取工藝進行了研究。結果經優化后，最佳提取條件為乙醇76%，料液比1：10，提取時間1 h，提取次數3次。結論在保證兩個指標均最優的前提下，MOGA搜索得的Pareto非劣解較為理想，最佳提取條件提取率高、穩定性好、精確度高，為黃連提取條件選擇提供了合理可靠的方法。

黃連；鹽酸小檗堿；提??；優化；多目標遺傳算法

黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch.、三角葉黃連Coptis deltidea C.Y.Chenget Hsiao或云連Coptis teeta Wall.的干燥根莖，具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效。用于濕熱痞滿，嘔吐吞酸，瀉痢黃疸，血熱吐衄，癰腫疔瘡，消渴等；外治濕疹，濕瘡，耳道流膿［1］。臨床上多用于治療痢疾、急性胃腸炎、慢性腹瀉、呼吸道感染以及各種炎癥，近年研究發現其在抗腫瘤、抗心率失常、降血糖等方面亦有明顯作用［2］。黃連主要有效成分是以鹽酸小檗堿為代表的生物堿［3］，故目前對于黃連提取工藝的研究大多是僅以鹽酸小檗堿量為指標，或者將鹽酸小檗堿量和浸膏得率兩個指標換算成一個指標，即綜合評分進行評價，這就又存在著主觀因素影響權重系數較大的問題，缺乏一定的客觀性。

正交試驗設計是當前研究中藥有效成分提取工藝的較為簡單高效的常用方法，但缺點是其只采用傳統的直觀、方差分析對實驗結果進行處理，因而只能在正交試驗設計的因素水平點上確定最佳條件，這便有可能因經驗不足而導致設計時正交表的水平點偏離最優控制點，以致最后確定的最佳條件有所偏移［4］。

遺傳算法（genetic aglorithm，GA）是一種借鑒生物界的進化規律演化而來的隨機化搜索方法，可以直接對結構對象進行操作。在解決全局最優化問題上，搜索效率高，穩定性好，不存在求導和函數連續性的限定；而且采用概率化的尋優方法，能自動獲取和指導優化的搜索空間，因此搜索過程中不易陷入局部最優，能以很大的概率找到全局最優解［5］。多目標遺傳算法（multi-objective genetic algorithm，MOGA）即是通過“Pareto最優個體”的概念對某一群體中所有的個體進行排序，根據這個排列次序進行進化過程中的選擇運算，從而使得排在前面的Pareto最優個體能有更多的機會遺傳到下一代群體［6］，該法在圖像擬合、信號處理、組合優化等領域已得到廣泛的應用，但在中藥研究方面仍應用較少。

本實驗擬在正交設計基礎上，引入二次回歸模型，建立黃連鹽酸小檗堿提取率和浸膏得率與其提取工藝條件的目標函數，并用MOGA對目標函數進行全局尋優，給出可選的、非受控的Pareto非劣解，為決策者提供可選擇的空間［7］，并確定黃連的最佳提取工藝。旨在更經濟、有效地增加藥材利用率及有效成分的浸出。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260系列高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），KQ-250E型超聲波清洗器 （昆山超聲儀器有限公司），Synergy?UV超純水儀（杭州景元科技有限公司），DKS-16型恒溫水浴鍋（嘉興市中新醫療儀器有限公司）。

1.2 試藥 黃連 （產地山西，批號130120，上海雷允上中藥飲片廠）；鹽酸小檗堿 （批號110713-201212，供含量測定，由中國食品藥品檢定研究院提供）；水為超純水；磷酸為分析純；乙腈、甲醇為色譜純。

2 方法與結果

2.1 正交試驗設計 根據相關文獻及單因素考察結果，確定乙醇體積分數、料液比、提取次數、提取時間為黃連提取條件的影響因素，每個因素取3個水平，以鹽酸小檗堿提取率和浸膏得率為評價指標，尋找提取黃連時兩個指標均最大的工藝條件，采用L9（34）正交表進行試驗，各因素水平及正交試驗設計可見表1～2。

表1 正交試驗因素水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal design

2.2 色譜條件［8］Agilent Extend C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液 （20：80），柱溫30℃，測定波長346 nm；體積流量1 m L/min；進樣量5μL。理論板數按鹽酸小檗堿計算不低于10 033，色譜圖詳見圖1。

2.3 鹽酸小檗堿的測定

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量，用甲醇溶解并稀釋成每1 mL含鹽酸小檗堿0.326 mg的對照品貯備原液。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取0.2 g黃連藥材粗粉9份，按表2進行提取，提取后，趁熱過濾，精密吸取濾液50μL，用50%甲醇稀釋至5 mL量瓶，過0.22μm微孔濾膜，取續濾液即得。

2.3.3 標準曲線的制備 分別精密吸取對照品混合溶液0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL用甲醇定容至5 m L量瓶，搖勻，得不同質量濃度的對照品溶液，按上述 “2.2”項下色譜條件測定，記錄峰面積，以峰面積 （S）為縱坐標，對應的對照品質量濃度（C）為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程為S= 4.905 6C+242.65，r=0.999 4。表明峰面積與對照品在32.60～195.60μg/mL范圍內線性關系良好。

2.3.4 精密度試驗 精密吸取質量濃度為48.90 μg/mL的對照品溶液5μL進樣，平行操作6次，以鹽酸小檗堿峰面積值計算的RSD為0.82%，表明儀器的精密度良好。

2.3.5 穩定性試驗 按 “2.3.2”項方法制備供試品溶液，室溫下放置，分別于0、2、4、6、8、10、12、24、48 h進樣，按 “2.2”項色譜條件，其峰面積的RSD為1.1%，表明供試品溶液在48 h內具有良好的穩定性。

2.3.6 重復性試驗 精密吸取6份供試品溶液各5μL，“2.2”項色譜條件下進樣，鹽酸小檗堿的平均提取率為8.17%，RSD為2.5%。表明方法的重復性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗 精密稱取已知含有量的樣品6份0.1 g，分別精密加入對照品4.5 mg，按“2.3.2”項下制備樣品， “2.2”項色譜條件下，計算6次平均回收率為100.0%，RSD為2.7%。

2.3.8 樣品測定 取黃連0.2 g共9份，按正交設計表進行提取，按 “2.3.2”項下方法制備成供試品，測定，結果見表2。

表2 正交試驗設計及測定結果Tab.2 O rthogonal design and determ ination results

2.4 對試驗指標建立模型［9］應用SPSS 19.0軟件，采用逐步回歸法對正交試驗結果進行分析，結果鹽酸小檗堿提取率：α入=0.10，α出=0.15；F=14.507，R2=0.829，Y1=3.295+0.012X1X2-0.250X2X4。黃連浸膏得率：α入=0.10，α出=0.15；F=31.124，R2=0.816，Y2=10.273+0.585X2X3。

2.5 單目標及多目標遺傳算法搜索最優條件 分別以鹽酸小檗堿提取率、浸膏得率的回歸模型為目標函數，使用Matlab 2009a外掛SGALAB beta 5008工具箱，應用單目標遺傳算法搜索最佳提取條件，其參數如下：初始種群為40、單點變異概率為0.05、單點交叉概率為0.8、最大進化代數為100，分別進行10次隨機搜索［10-11］。

2.5.1 黃連中鹽酸小檗堿的最佳提取條件 結果見圖2，表3～4。從圖2中可以看出25代后鹽酸小檗堿提取率的最大、最小、平均適應度穩定在10.02%的水平左右，搜索達到穩定狀態。由表3、4可知，每次搜索對目標函數值都很逼近，精度也較高?？梢钥闯?0號方案搜索的條件可使鹽酸小檗堿提取率達到最大為10.03%。即乙醇體積分數為80%，料液比為1：10，提取1 h。其中提取次數未進入以鹽酸小檗堿提取率為目標函數的模型中，可根據實際情況選擇。

圖2 黃連鹽酸小檗堿歷代適應度曲線Fig.2 Fitness curves of berberine hydrochloride content in the past dynasties

表3 單目標遺傳算法搜索的鹽酸小檗堿提取率最佳提取條件Tab.3 Single-objective genetic algorithm search on the optimum extraction conditions for berberine hydrochloride content

表4 鹽酸小檗堿最佳提取條件的平均水平Tab.4 Average rate of berberine hydrochloride content by optimum extraction

2.5.2 黃連浸膏最佳提取條件 結果見圖3，表5～6。

圖3 黃連浸膏得率歷代適應度曲線Fig.3 Fitness curves of dry extract yield in the past dynasties

表5 單目標遺傳算法搜索的黃連浸膏得率最佳提取條件Tab.5 Single-objective genetic algorithm search on optimum extraction conditions for dry extract yield

表6 黃連浸膏得率最佳提取條件的平均水平Tab.6 Average rate of the dry extract yield by optimum extraction condition

從圖3中可以看出20代后黃連浸膏得率的最大、最小、平均適應度均穩定在26.86%的水平，搜索達到穩定狀態。由表5、6可以看出6號方案可使浸膏得率達到最大為27.27%。即料液比為1：10，提取次數為3次，其中乙醇體積分數和提取時間沒有進入以黃連浸膏得率為目標函數的模型中，可以根據實際情況選擇。

2.5.3 單目標遺傳算法搜索黃連鹽酸小檗堿提取率、浸膏得率最佳條件比較 由上述可知，兩個評價指標各自的最佳提取條件有所不同。兩者均與料液比有關，此外，黃連鹽酸小檗堿提取率還與乙醇體積分數和提取時間有關，而浸膏得率與提取次數有關。從表3和表5分別可以得知，鹽酸小檗堿提取率在用10倍80%乙醇提取1 h的條件下達到最大；浸膏得率在料液比為1：10，提取3次時達到最大值。前者達到最大時需要較高體積分數的乙醇，而后者達到最大時則需要提取多次，兩個目標之間是存在矛盾的，使一個目標最大可能導致其他目標偏低。若是想使兩個目標都達到最大值，各自的最優提取條件會不相同，這就需要進行兩個目標的同時尋優。

2.5.4 黃連提取工藝MOGA法搜索最佳提取條件

以黃連鹽酸小檗堿提取率和浸膏得率作為兩個目標函數，采用MOGA法進行優化分析，以達到兩個指標均最大的目的。從圖4、5歷代適應度曲線看到，鹽酸小檗堿提取率和浸膏得率的最大適應度在25代之后趨于穩定，平均適應度在20代以后趨于穩定，搜索水平達到了穩定的效果。最大適應度進化曲線反映所得解的變化趨勢，用來評價MOGA的收斂性，平均適應度曲線則評價MOGA的動態性能。

圖4 MOGA最大適應度曲線Fig.4 Maximum fitness curves searched by MOGA

圖5 MOGA平均適應度曲線Fig.5 Average fitness curves searched by MOGA

MOGA搜索得的部分Pareto非劣解方案，見表7。從表7中可知方案1是最優的提取條件，即10倍量的76%乙醇，提取3次，每次1h，在此條件下得到的鹽酸小檗堿提取率為9.80%，浸膏得率為27.53%。再從表4、5可看出，10次隨機搜索結果的標準差及95%可信區間的精度均較高，即每次搜索都是對目標函數值的逼近，且逼近程度好。從表8中10種方案的平均水平看，可知鹽酸小檗堿提取率、浸膏得率的精度較好，變異系數小，說明MOGA搜索的結果是較為理想的。

表7 黃連鹽酸小檗堿提取率、浸膏得率隨機搜索結果Tab.7 Random search results of berberine hydrochloride content and dry extract yield

表8 黃連鹽酸小檗堿提取率、浸膏得率隨機搜索結果的平均水平Tab.8 Random search results for average levels of berberine hydrochloride content and dry extract yield

由于兩目標優化時是將子目標進行折衷處理而使之盡可能得到各子目標均最大的解，所以MOGA搜索到的目標函數值都小于單目標函數目標值，不過MOGA優化所得的鹽酸小檗堿提取率達到了單目標法的92.69%，浸膏得率則有單目標遺傳算法的95.63%，兩者均達單目標最大函數值90%以上，從專業角度上來說，其效果是較為理想的。

2.6 優化工藝的驗證 按確定的最佳提取工藝：乙醇體積分數76%，料液比1：10，提取次數為3次，提取時間1 h，重復進行3次驗證試驗，得黃連鹽酸小檗堿提取率的平均值為8.80%，RSD為1.7%，浸膏得率的平均值為25.03%，RSD為1.2%，高于正交試驗中的最高結果。

3 討論

本研究采用逐步回歸法建立鹽酸小檗堿提取率、浸膏得率與提取因素的二次回歸模型，并以此為目標函數，應用全局優化的多目標遺傳算法，在保證多個目標均最大的前提下，對全局范圍進行搜索，確定了其最佳提取工藝［12］。驗證性試驗結果較表8中10次隨機搜索結果的理論均值 （即黃連鹽酸小檗堿提取率為 8.75%，浸膏得率為25.15%）要高，說明多目標遺傳算法得到的最佳工藝有較好的重現性。同時，MOGA法克服了正交試驗不能超越所取水平范圍優選結果的缺陷，為藥物有效成分提取條件的選擇提供可行的方法，達到節省人力、物力，提高有效成分提取率，降低研究成本的目的［13］。

鹽酸小檗堿的量受黃連藥材產地、生長年限的影響較大［14］，且本次實驗中所用黃連均是同一批次，故所測定的黃連藥材中鹽酸小檗堿的相關數據僅提供一定的參考。

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M ulti-objective genetic algorithm for Coptis chinensis optim um extraction

XU Bing-wan， XU Xiao-wen， HUANG Jia-wei

（College of Pharmacy，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China）

Coptis chinensis Franch.；berberine hydrochloride；extraction；optimization；multi-objective genetic algorithm（MOGA）

R284.2

A

1001-1528（2015）04-0768-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.016

2014-05-16

2013年度浙江省科學技術廳公益性技術應用研究項目 （2013C33185）

徐冰婉 （1991—），女，碩士生，主要從事中藥及天然有效成分的研究與開發。Tel：15158191897，E-mail：xubingwan1991@ 126.com

*通信作者：黃家衛 （1961—），男，教授，碩士生導師。Tel：（0571）86613657，E-mail：hjw3657@163.com