綠茶對五倍子發酵品的影響

史蓮蓮， 鄧德英， 張振凌， 崔雅萍

（河南中醫學院呼吸疾病診療與新藥研發河南省協同創新中心，河南鄭州450008）

綠茶對五倍子發酵品的影響

史蓮蓮， 鄧德英， 張振凌*， 崔雅萍

（河南中醫學院呼吸疾病診療與新藥研發河南省協同創新中心，河南鄭州450008）

目的比較百藥煎 （五倍子發酵品）中鞣質和沒食子酸含有量來選擇何種綠茶 （茶葉，茶渣和茶汁）作為發酵基質。方法制備茶葉、茶渣和茶汁與五倍子混合發酵產物后，采用紫外分光光度法測定鞣質含有量，高效液相法測定沒食子酸含有量。結果五倍子、酒曲與煎煮后的茶渣、茶汁混合發酵的鞣質含有量為11.59%，沒食子酸含有量為10.43%；五倍子、酒曲、茶葉直接混合發酵的鞣質含有量為15.25%，沒食子酸含有量為6.21%；五倍子、酒曲與煎煮后的茶汁混合發酵的鞣質含有量為16.41%，沒食子酸含有量為7.63%；五倍子、酒曲混合發酵的鞣質含有量為21.39%，沒食子酸含有量為5.34%。結論茶葉煎煮后茶渣和茶汁一起加入五倍子酒曲中發酵，鞣質轉化率最高，發酵效果最好。

五倍子；百藥煎；發酵；綠茶；鞣質；沒食子酸

傳統中藥百藥煎是由五倍子經發酵制備而成，最早見于 《本草蒙筌》： “五倍子造成，新五倍子十斤，舂搗爛細，磁缸盛，稻草蓋合，七晝夜，取出復搗，加桔梗、甘草末各二兩，又合一七，仍搗仍合，務過七次，捏成餅錠，曬干任用。如無新鮮，用干倍子水漬為之”［1］，這也是我國較早時期用以制備沒食子酸的方法。目前對于百藥煎的制備工藝沒有規范性標準， 《中藥大辭典》［2］等文獻資料收載有百藥煎炮制方法，原料都是由 “五倍子、茶、酵曲發酵”［3-5］。歷代 《中國藥典》以及全國中藥炮制技術規范中沒有收錄百藥煎，僅 《江西省中藥炮制規范》1991年版［6］和 《浙江省中藥炮制規范》2005年版［7］收載，且對于綠茶加入方法描述不一。已有文獻對發酵過程中酒曲的篩選和發酵工藝［8］進行過報道，但綠茶及其不同加入方式對五倍子發酵的影響尚無研究。本實驗通過比較不同加入方式的綠茶發酵五倍子后鞣質和沒食子酸的含量變化，探索綠茶對百藥煎質量的影響，期望能對傳統工藝進行優化，推動傳統中藥炮制的現代化。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜分析儀（島津LC-2010A HT，日本島津公司）；KQ-500DV型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；METTLER AE 240型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；BS 210S電子天平 （北京賽多利斯天平有限公司）；DHG-9076A型電熱恒溫鼓風干燥箱 （上海精宏實驗設備有限公司）；UV-3200S紫外可見分光光度計 （上海美譜達儀器有限公司）；FW-100高速萬能粉碎機 （北京中興偉業儀器有限公司）；SZ-93自動雙重純水蒸餾器 （上海亞榮生化儀器廠）；8002型溫控水浴鍋 （北京永光明醫療儀器廠）。

1.2 試劑 甲醇 （天津四有精細化學品有限公司，批號140112，一級色譜純）；雙蒸水 （自制）；磷酸 （天津市登科化學試劑有限公司，批號20121107，分析純）；沒食子酸對照品 （中國食品藥品檢定研究院，批號110831-200803）；磷鉬鎢酸試劑 （自制）；無水碳酸鈉 （北京化工廠，分析純）；安琪釀酒曲 （湖北宜昌安琪有限公司，批號20130528）；綠茶 （中國農業科學院茶葉專業市場）。

1.3 藥材 五倍子購于安徽亳州中藥飲片廠，批號20130812，經鑒定為漆樹科植物鹽膚木Rhus chinensis Mill.等樹上寄生倍蚜科昆蟲角倍蚜或倍蛋蚜后形成的蟲癭，符合 《中國藥典》2010年版“五倍子”項下的各項規定。

2 方法與結果

2.1 樣品的制備

2.1.1 五倍子 將五倍子藥材洗凈，80℃干燥4 h，粉碎，過80目篩。

2.1.2 五倍子、酒曲發酵 取以上五倍子粉末10 g，酒曲3 g，混勻，加水4.5 mL，攪拌均勻，切成小方塊，置于表面皿中。

2.1.3 五倍子、酒曲加綠茶發酵 取以上五倍子粉末10 g，酒曲3 g，綠茶粗粉 （過三號篩）1 g，混勻，加水4.8 m L，攪拌均勻，切成小方塊，置于表面皿中。

2.1.4 五倍子、酒曲與煎煮后的茶渣、茶汁混合發酵 取以上五倍子粉末10 g，酒曲3 g，混勻備用，另取1 g茶葉粗粉置于30 mL沸水中煎煮15 min，放至室溫，過濾，煎煮液茶汁體積為10.2 mL，取4.8 mL茶汁連同茶渣一起加入上述五倍子酒曲粉末中，攪拌均勻，切成小方塊，置于表面皿中。

2.1.5 五倍子、酒曲與綠茶煎煮液混合發酵 取以上五倍子粉末10 g，酒曲3 g，混勻備用。另取1 g茶葉粗粉置于30 mL沸水中煎煮15 min，放至室溫，濾去茶渣，煎煮液茶汁體積為10.5 mL，取4.8 mL茶汁加入上述五倍子酒曲粉末中，攪拌均勻，切成小方塊，置于表面皿中。

將以上制備的樣品放入恒溫恒濕箱 （溫度35℃；相對濕度75%）中發酵48 h，取出，于60℃烘箱中烘10 h，粉碎，過四號篩，備用。

2.2 外觀性狀 外觀性狀比較，4種制備方法都具有發酵作用，在發酵48 h時，五倍子、酒曲與煎煮后的茶渣、茶汁混合發酵樣品表面已經布滿銀白色的菌絲，且體積發膨，故從外觀性狀來看，以五倍子、酒曲與煎煮后的茶渣、茶汁混合發酵效果最好。

2.3 不同發酵品含水量測定 按 《中國藥典》2010年版一部附錄水分含量測定項下的烘干法，分別取不同發酵品各0.5 g，平鋪于干燥至恒定質量的扁形稱量瓶中，精密稱定，打開瓶蓋在105℃烘箱中干燥5 h，將瓶蓋蓋好，移至干燥器中，冷卻30 min，精密稱定質量，再在上述溫度下干燥1 h，冷卻，稱定質量，至連續兩次稱重的差異不超過5 mg為止。根據減失的質量，計算供試品中的含水量。

2.4 五倍子不同發酵品中沒食子酸測定

2.4.1 對照品溶液的制備 取沒食子酸對照品2.0 mg，精密稱定于25 mL量瓶中，用50%甲醇溶解，定容至刻度，得0.08 mg/m L對照品溶液。

2.4.2 供試品溶液的制備 精密稱取樣品0.1 g，置100 mL錐形瓶中，加入50%甲醇20 mL，浸泡過夜，次日超聲提取40 min，提取兩次，每次20 m L，過濾，合并濾液，加甲醇定容至100 m L量瓶中，搖勻，用0.45μm即得。

2.4.3 色譜條件 Agilent HC-C18（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相甲醇-0.1%磷酸（10：90）；體積流量0.8 mL/min；檢測波長270 nm；柱溫30℃。

2.4.4 方法學考察

2.4.4.1 線性關系考察 精密吸取 “2.4.1”項下沒食子酸對照品溶液1、2、4、6、8、10μL注入高效液相色譜儀，測定其峰面積。以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，結果表明在0.08～0.8μg范圍內線性關系良好，回歸方程為y=4 287 380.26x+13 110.74，r2=0.999 9。

2.4.4.2 精密度試驗 精密吸取“2.4.1”項下沒食子酸對照品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，重復進樣6次，測定其峰面積，計算得RSD為0.8%，儀器精密度良好。

2.4.4.3 穩定性試驗 取0.1 g五倍子、酒曲發酵樣品，精密稱定，按照 “2.4.2”項下供試品溶液的制備方法制得供試品溶液，分別在0、4、8、12、24 h進樣，每次進樣量6μL，測得沒食子酸峰峰面積，計算得RSD為0.4%，表明樣品溶液在24 h內穩定。

2.4.4.4 重復性試驗 取0.1 g五倍子、酒曲發酵樣品6份，精密稱定，按照 “2.4.2”項下供試品溶液的制備方法制得供試品溶液，分別進樣6 μL，測定沒食子酸峰面積，計算得RSD為2.2%，表明其重復性良好。

2.4.4.5 加樣回收率試驗 取9份已知沒食子酸含有量的五倍子、酒曲發酵樣品，精密稱定，分別加入沒食子酸標準溶液（2.98 mg/mL）1.5、1.5、1.5、1.8、1.8、1.8、2.1、2.1、2.1 m L，按照“2.4.2”項下供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，分別進樣6μL，測定沒食子酸峰峰面積，計算結果見表1。

表1 加樣回收率試驗Tab.1 Results of recovery tests

2.4.4.6 五倍子不同炮制品中沒食子酸測定結果分別精密吸取五倍子不同炮制品的供試液6μL，注入高效液相色譜儀，測定沒食子酸峰峰面積，以干燥品計算含量。見表3。

2.5 五倍子不同發酵品鞣質測定

2.5.1 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對照品50 mg，置100 mL棕色量瓶中，加水溶液并稀釋至刻度，精密量取5 mL，置50 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得 （每1 mL中含沒食子酸0.05 mg）。

2.5.2 供試品溶液的配制 精密稱取五倍子不同發酵品藥材粉末0.2 g置于250 mL棕色量瓶中，加水150 mL，放置過夜，超聲處理30 min，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，靜置，濾過，棄去初濾液50 mL，精密量取續濾液20mL置100mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.5.3 供試品的測定

2.5.3.1 總酚 精密量取供試品溶液2 m L，置25 mL棕色量瓶中，加入磷鉬鎢酸試液1 mL，加水10 mL，用29%碳酸鈉溶液的定容至刻度，放置1 h，依法測定吸光度，從標準曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量 （mg），計算，即得。

2.5.3.2 不被吸附的多酚 精密量取供試品溶液25 mL，加至已盛有干酪素0.6 g的100 mL具塞錐形瓶中，密閉，置30℃水浴中保溫1 h，時時振搖，取出放冷，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密量取續濾液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，加磷鉬鎢酸1 mL，加水10 mL，用29%的碳酸鈉溶液定容至刻度，放置1 h，測吸光度值。

2.5.4 方法學考察

2.5.4.1 標準曲線的制備 精密量取對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置25 mL棕色量瓶中，各加入磷鉬鎢酸試液1 mL，分別加水11.5、11、10、9、8、7 mL，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置60 min以相應的試劑為空白，照紫外可見分光光度法，在760 nm的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。得回歸方程：A= 0.092 463C+0.063 4（r2=0.999 5）樣品溶液在1～10μg/mL之間呈線性關系。

2.5.4.2 精密度試驗 精密吸取對照品溶液1 mL，按 “2.5.3.1”項總酚的定量測定方法，重復測定6次，于760 nm處測定吸光度，結果吸光度的RSD值為1.4%，儀器精密度良好。

2.5.4.3 穩定性試驗 精密吸取五倍子、酒曲與煎煮后的茶渣、茶汁混合發酵溶液2 mL，按“2.5.3.1”項照總酚的測定方法，顯色1 h后，每隔10min測定一次吸光度，共6次，計算RSD為0.3%，表明五倍子鞣質在顯色終止反應后1 h內測結果穩定。

2.5.4.4 重復性試驗 取6份五倍子、酒曲與煎煮后的茶渣、茶汁混合發酵粉末0.2 g，精密稱定，按照上述供試品的制備方法，制備供試品溶液，進行鞣質測定，結果平均含有量為11.80%，RSD為1.5%，表明該方法重復性良好。

2.5.4.5 加樣回收率試驗 取6份五倍子、酒曲與煎煮后的茶渣、茶汁混合發酵粉末50 mg，精密稱定，分別加入沒食子酸（2.95 mg/mL）對照品1.6、1.6、1.6、2.0、2.0、2.0、2.4、2.4、2.4 mL。按照供試品溶液制備方法制備，并按照鞣質測定方法測定，結果平均回收率為99.5%，RSD為0.7%，說明該測定方法測定的結果準確，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗Tab.2 Results of recovery tests

2.5.4.6 計算方法 鞣質含有量=總酚-不被吸附的多酚，結果見3。

表3 五倍子不同發酵品鞣質和沒食子酸測定結果Tab.3 Contents of tannins and gallic acid in different fermetation products of chinese gall

3 討論

本實驗結果顯示，五倍子、酒曲和煎煮后的茶渣、茶汁混合發酵品與不加茶葉的五倍子、酒曲發酵樣品相比，鞣質含有量降低9.8%，沒食子酸含有量增加5.09%，表明鞣質分解的最多，其原因可能是茶葉煎煮后蛋白質氨基酸等含有量增高，更有利于發酵菌種的生長，產生的分解酶類能夠更加有效的對鞣質進行作用，但具體機理尚需實驗證明。

有文獻利用電子鼻檢測系統監測不同發酵時間的百藥煎樣品以及發酵過程中氣體成分的變化，來確定最佳發酵時間［9］。表觀分析來看，百藥煎最佳發酵時間為72 h，而前期預實驗發現，五倍子發酵72 h時，發酵樣品表面已長出大量黑色霉菌，而發酵48 h時，表面布滿銀白色的白霜，故本實驗選取48 h為發酵終止時間。

查閱文獻發現［8］，在水和乙醇提取液中，沒食子酸的峰形較寬且有肩峰出現，而在甲醇提取液中，沒食子酸峰的峰形對稱，適合定量，故選取甲醇作為提取溶劑。在提取方法選擇方面，采用超聲提取法所測得的沒食子酸的量明顯高于冷浸法和回流提取法，故本實驗選取超聲提取。

目前百藥煎的傳統炮制工藝研究方面還不完善［10-11］，盡管五倍子、茶、酵曲用量比例已有研究，但是不同文獻中具體的操作方法不一，如何操作才能使發酵效果更好尚有待于深入研究。百藥煎現代炮制工藝的制定，菌種的篩選，質量標準的確定，系統的研究其化學成分和藥理作用，有無新成分的產生，都是我們下一步的研究方向。

［1］陳嘉謨 （明）.本草蒙筌［M］.北京：人民衛生出版社，1988：252.

［2］江蘇新醫學院.中藥大辭典［M］.上海：上海人民出版社，1977：865.

［3］鄭利華.五倍子發酵炮制簡介［J］.中藥雜志，1998，23（1）：26-27.

［4］王和英.五倍子的發酵炮制［J］.基層中藥雜志，2000，14（4）：40.

［5］李京生，付萬敏.加工類中藥的制備與應用［J］.首都醫藥，2011，（19）：40-41.

［6］范崔生，王魚門，毛振榮.江西省中藥炮制規范：1991年版［M］.上海：上海科學技術出版社，1991：515.

［7］鄭尚金，陳時飛，陸光照，等.浙江省中藥炮制規范：2005年版［M］.杭州：浙江科學技術出版社，2005：539.

［8］瞿 燕.五倍子發酵工藝及藥理實驗研究［D］.成都：成都中醫藥大學，2002：53-63.

［9］李雪春，韓小敏，禹玉洪，等.電子鼻監測百藥煎的固態發酵 ［C］//全國中藥創新與研究論壇論文集.北京：中華中醫藥學會中藥制劑分會，2009：120-122.

［10］王 寧，鄭紅平，朱 丹，等.《本草蒙筌》中有關藥物炮制加工方法考釋［J］.遼寧中醫藥大學學報，2013，15（12）：31-32.

［11］張麗霞，高文遠，王海洋，等.微生物技術在中藥炮制中的應用［J］.中國中藥雜志，2012，37（24）：3695-3699.

Effect of green tea on fermented Galla chinensis

SHILian-lian， DENG De-ying， ZHANG Zhen-ling*， CUIYa-ping

（Collaborative Innovation Center for Respiratory Disease Diagnosis and Treatment&Chinese Medicine Development of Henan Province，Henan University of Tradrtional Chinese Medicine，Zhengzhou 450008，China）

Gall chinensis；chinese gall leaven；fermatation；green tea；tannins；gallic acid

R283

A

1001-1528（2015）04-0836-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.032

2014-06-09

六神曲等6種中藥發酵技術規范與應用研究—百藥煎 （201407009-05）

史蓮蓮，女，碩士生，研究方向為中藥飲片及新藥開發。Tel：15837149352，E-mail：15837149352@163.com

*通信作者：張振凌 （1957—），女，教授，博士生導師，研究方向為中藥飲片及新藥開發。Tel：（0371）65680970，E-mail：zhangzl6758@163.com