丹皮酚對急性肝細胞損傷的保護作用

顏貴明， 戴 敏， 宣自華， 李月月

（新安醫學省部共建重點實驗室，安徽中醫藥大學，安徽合肥230012）

［科研報道］

丹皮酚對急性肝細胞損傷的保護作用

顏貴明， 戴 敏*， 宣自華， 李月月

（新安醫學省部共建重點實驗室，安徽中醫藥大學，安徽合肥230012）

目的在乙醇誘導的體外大鼠肝細胞急性損傷導致谷草轉氨酶 （AST）、谷丙轉氨酶 （ALT）、丙二醛 （MDA）水平升高的模型基礎上，探討丹皮酚對大鼠肝細胞的直接保護作用。方法分別將肝細胞接種于培養瓶中培養傳代，利用50mmol/L乙醇處理12 h建立急性大鼠體外肝細胞急性損傷模型，用含不同濃度丹皮酚（250、125、62.5、31.25、15.625μmol/L）的培養液與急性損傷肝細胞共孵育不同時間 （0.5、1、3、6、12、24 h），MTT比色法測定丹皮酚對肝細胞損傷的預防作用，賴氏法測定上清液ALT和AST的水平，硫代巴比妥法測定上清液MDA水平。結果丹皮酚（125μmol/L，12 h）可抑制乙醇對肝細胞的損傷，并明顯降低乙醇致急性損傷肝細胞的ALT、AST釋放量和MDA水平。結論丹皮酚體外給藥抑制乙醇誘導肝細胞的ALT、AST和MDA釋放，提示其具有對肝細胞損傷的直接保護作用。

乙醇；酒精性脂肪肝；丹皮酚（Pae）；ALT；AST；MDA；保護作用

酒精濫用與酒精依賴已經成為當今社會一個重要的社會和醫學問題。過量酒精的攝入嚴重影響肝臟的功能，鑒于此探索對酒精性肝細胞損傷具有保護作用的中藥顯得非常必要。任何新藥的研究都需要選擇合適的模型，現有報道的酒精性肝細胞損傷模型，慢性居多，并且大多數以酒精代謝指標、體內抗氧化指標、酶組織化學或病理學檢查作為衡量依據，但關于酒精對體外肝細胞膜急性影響的研究很少。建立在動物實驗的基礎之上實驗結果的實用性受一定的限制。

大量酒精進人機體后，在乙醇脫氫酶的作用下大量脫氫氧化，使三梭酸循環過程障礙和抑制脂肪酸氧化而影響脂質代謝。乙醇可致磷酸甘油增多導致甘油三酯合成增加，促進脂肪在肝細胞內沉積，同時乙醇能激活氧分子，氧自由基的產生導致肝細胞膜的脂質過氧化以及體內還原型谷胱甘肽的大量耗竭［1］。一般認為，氧化損傷、脂質過氧化損傷及免疫功能損傷等在乙醇導致肝細胞損傷機制中起主要作用，并且由乙醛所致的肝細胞氧化損傷更為突出，表現為GSH的耗竭及MDA增加［2］。

通常認為，酒精性肝細胞損傷實質上是由乙醇的氧化毒性所致，主要表現為乙醇能損害肝細胞利用氧的能力，促進細胞內的清道夫分子還原型谷胱甘肽耗竭，促進自由基介導的毒性作用和脂質過氧化作用［3-4］。但是，由于人類與動物的乙醇代謝酶以及乙醇的毒性反應種屬間差異很大，從而建立在動物實驗基礎之上的實驗結果的實用性受限制。由此，本研究以L-02細胞株為研究對象，排除其他因素，研究酒精對肝細胞的直接作用，以培養L-02細胞株上清液中谷丙轉氨酶 （ALT）、谷草轉氨酶 （AST）釋放量，肝細胞中丙二醛 （MDA）作為細胞氧化損傷的指標，進行酒精誘導體外急性肝細胞氧化損傷的研究。MDA作為脂質過氧化終產物具有較強的細胞毒性，可造成細胞能量代謝障礙，使細胞功能受損。肝細胞損傷的程度和體內脂質過氧化的程度均可通過MDA水平直接或間接反映出來［5-9］。

丹皮酚（paeonal，Pae）是芍藥科植物牡丹Paeonia Suffruticoas Andr.的干燥根皮及蘿摩科植物徐長卿Cynanchum paniculatum（Bge.）Kitag.的干燥根及根莖中的有效成分之一［10］。現代研究表明，丹皮酚具有解熱、鎮痛、抗炎、降脂、抗氧化、抗血栓、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化（AS）等廣泛的藥理作用［11］。本研究首次研究丹皮酚體外用藥對酒精誘導的肝細胞細胞膜損傷、過氧化反應等過程是否有直接抑制作用，從而進一步驗證丹皮酚對酒精性脂肪肝細胞保護作用的細胞學機制。

1 實驗材料

1.1 藥物 丹皮酚，宣城百草工貿有限公司提供，純度大于99.8%，批號：100216。

1.2 細胞株 BRL大鼠正常肝細胞株L-02（中科院上海生物化學與細胞研究所）。

1.3 主要試劑 乙醇 （純度 99%，批號 20100912）；DMEM培養基 （Gibco公司，批號20081123）；胰蛋白酶（Amersco公司，批號20090128）；胎牛血清（美國Gibco公司，批號12100-038）；二甲基亞砜DMSO（Sigma公司，批號20080324）；臺盼藍染色細胞存活率檢測試劑盒 （北京化學試劑廠，批號20081118）；鏈霉素針劑 （規格為每支100萬單位，華北制藥股份有限公司，批號20101218）；青霉素針劑 （規格為每支80萬單位，華北制藥股份有限公司，批號20101213）；MTT（Amersco進口分裝，武漢生命技術有限公司）。

1.4 主要溶液配制

1.4.1 PBS緩沖液的配制（pH 7.2） 精密稱取Na2HPO4· 12H2O 3.49 g、KCl 0.2 g、NaCl 8.0 g、KH2PO40.2 g，溶于1 000mL ddH2O中。經121℃高壓滅菌20min，4℃保存。

1.4.2 胎牛血清滅活 室溫解凍胎牛血清，置于56℃水浴滅活30min，20mL分裝，-20℃保存。

1.4.3 培養液的配制 DMEM培養液加1.8 g/L碳酸氫鈉，10萬IU/L青霉素，10萬U/L硫酸慶大霉素，加入20%的Defined FBS。

1.4.4 細胞消化液的配制 含0.2%胰蛋白酶，配制方法：稱取400mg胰蛋白酶，加入到200mL無鈣、鎂的PBS緩沖液中，振搖至全部溶解后濾過除菌，分裝，-20℃保存備用。

1.4.5 MTT貯存液制備 MTT粉50 mg，溶于10 mL PBS中，使終質量濃度為5 mg/mL，0.22μm微孔濾膜過濾。棕色瓶，4℃保存，半月內備用。

1.4.6 丹皮酚藥液的配制 精密稱取丹皮酚1.66 mg，加入20μL二甲基亞砜（DMSO）使其溶解，吸取20 mL DMEM培養基充分混勻，配成濃度為500μmol/L的溶液，再依次將藥液等比稀釋成250、125、62.5、31.25、15.625 μmol/L，置于4℃冰箱保存，1周內備用。

1.5 主要儀器 CO2培養箱（日本Sanyo公司）；培養/干燥箱 （上海一恒科技有限公司）；LD4-8型低速離心機 （北京醫用離心機廠）；艾科浦超純水系統 （重慶頤洋企業發展有限公司）；滅菌鍋（日本Tomy KOQYO公司）；培養瓶、培養皿、96孔培養板（美國Corning公司）；EIX50自動洗板機（美國Bio-Tek公司）；-20℃冰箱（榮事達電器有限公司）；-80℃冰箱 （日本Sanyo公司）；電子精密天平 （上海精密科學儀器有限公司）；水浴恒溫箱 （常州國華電器有限公司）；快速混勻器 （常州國華電器有限公司）；ELX800uv酶標儀（Bio-TEK公司）；潔凈工作臺（蘇凈集團安泰公司）；CK2型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；液氮罐 （成都金鳳液氮容器有限公司）。

2 實驗方法

2.1 肝細胞培養和傳代 培養基是DMEM培養基（含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 U/mL），將肝細胞接種于培養瓶中，置于37℃、5%CO2、相對飽和濕度培養箱中培養。肝細胞為單純貼壁生長，隔日換液，待細胞長至80%～90%的密度，用胰酶消化傳代，每2天傳代1次。

2.2 肝細胞計數方法 無水酒精清潔蓋玻片和計數板，晾干備用。肝細胞經胰酶消化后再用新鮮DMEM培養基分散成單個細胞懸液。用吸管適度吹打細胞懸液，吸取少量細胞懸液，在計數板蓋玻片的一端加微量細胞懸液，加樣時需要注意，不要溢出蓋玻片和兩邊的玻璃槽內，顯微鏡下，用10倍物鏡觀察計數板四大方格中的細胞數。細胞壓中線時，只計左側和上方者，右側和下方者不計。

2.3 酒精誘導肝細胞損傷模型的建立 將處于對數生長期的L-02細胞調整密度為4×104個/m L培養于96孔板中，培養24 h更換培養液，分別設立正常對照組，25、50、75、100 mmol/L 4個酒精誘導組，肝細胞懸液與不同濃度的酒精繼續培養0.5、1、3、6、12、24 h。用MTT比色法測定細胞活力，臺盼藍染色法計算細胞存活率。結合細胞形態觀察，選擇誘導肝細胞損傷的酒精最佳濃度。

2.4 丹皮酚對肝細胞損傷的保護作用

2.4.1 丹皮酚肝損傷保護作用量效時效關系 在乙醇誘導肝細胞損傷模型的基礎上，將細胞吹打成密度為4×104個/mL培養于96孔板中，貼壁生長24 h。分別加入不同濃度 （250、125、62.5、31.25、15.625μmol/L）的丹皮酚，用MTT比色法測定細胞活力，臺盼藍染色法計算細胞存活率。結合細胞形態觀察作為處理脂肪肝細胞的最佳濃度。結果顯示125μmol/L濃度作用12 h最佳。

2.4.2 ALT、AST和MDA的測定 將對數增殖期的L-02細胞調整成密度為4×104個/mL的細胞懸液，接種于96孔板，每孔100μL，接種24 h后，鏡下觀察確認細胞貼壁良好。試驗設正常對照組、繼續誘導組、丹皮酚治療組（62.5、125、250μmol/L），每組設6個復孔。各組給予50 mmol/L酒精處理12 h，Pae治療組加入不同濃度丹皮酚（62.5、125、250μmol/L）的培養液，正常對照組加不含酒精的培養液，繼續誘導組繼續給予50 mmol/L酒精培養液，繼續恒溫培養12 h。收集培養上清液，4℃1 000 r/min離心5 min，分別取100μL上清液測ALT、AST、MDA水平，按試劑盒說明書操作。此實驗重復3次。

2.5 統計處理方法 采用t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義，P＜0.01為差異具有顯著性。

3 實驗結果

3.1 酒精誘導急性肝細胞損傷 本研究顯示采用濃度分別為25、50、75、100 mol/L的酒精處理肝細胞0.5、1、6、12、24 h。結果顯示 （見表1），酒精對肝細胞的損傷作用有劑量依賴性，濃度25 mmol/L的酒精作用于肝細胞影響不明顯，光鏡下未見肝細胞形態異常，但隨著酒精濃度的增大，其存活率則逐步降低，其中，50 mmol/L乙醇處理12 h可使肝細胞損傷明顯。顯微鏡下觀察肝細胞明顯損傷，部分細胞固縮變圓，體積變小，少量細胞貼壁不牢，呈半貼壁狀態；12 h可觀察到多數細胞固縮變圓，較多細胞脫落，漂浮于培養液中，亦有少數細胞內出現空泡或體積增大，細胞腫脹、破裂呈壞死狀 （見圖1）；24 h可觀察到多數細胞脫落，漂浮于培養液中，部分細胞內出現空泡或體積增大，細胞腫脹、破裂死亡。吸取100μL細胞懸液到EP管內，加入100μL臺盼藍染色液，輕輕吹打混勻，3～5 min后，吸取適量加有臺盼藍染色液的細胞懸液，滴加血細胞計數板計數。于大方格內計數未被藍染的細胞總數（藍染細胞為死亡細胞）即為活細胞數，計算細胞存活率。隨著作用時間的延長，酒精濃度的增大，肝細胞存活率也隨之降低。25 mmol/L組對酒精誘導的肝細胞生長影響不大，因此不選為作用濃度。故選用50 mmol/L乙醇處理12 h作為誘導急性酒精性肝損傷模型的方法。

表1 不同濃度的乙醇對肝細胞存活率的影響 （）

表1 不同濃度的乙醇對肝細胞存活率的影響 （）

注：與空白組比較，★★P＜0.01，★P＜0.05

乙醇濃度/（mmol·L-1）0.5 h光密度值 存活率/% 1 h光密度值 存活率/% 3 h光密度值 存活率/%空白組0.431±0.013 100 0.432±0.018 100 0.411±0.024 100 25 0.405±0.016 99.5 0.398±0.024 99.5 0.402±0.026 98.5 50 0.397±0.018 98.0 0.377±0.027 98.0 0.363±0.021 95.0 75 0.399±0.029★ 89.5 0.372±0.034★ 89.5 0.366±0.028★ 89.5 100 0.373±0.022★ 90.0 0.366±0.021★ 90.0 0.363±0.029★ 90.0乙醇濃度/（mmol·L-1）6 h光密度值 存活率/% 12 h光密度值 存活率/% 6 h光密度值 存活率/%空白組38.6 0.401±0.023 100 0.394±0.019 100 0.388±0.031 100 25 0.395±0.036 98.5 0.335±0.025★ 85.8 0.371±0.039★ 95.6 50 0.371±0.025 94.0 0.322±0.032★★ 83.0 0.278±0.034★ 71.1 75 0.359±0.026★ 89.5 0.242±0.027★★ 61.4 0.226±0.031★★ 58.2 100 0.343±0.027★★ 86.0 0.178±0.038★★ 45.2 0.146±0.031★★

圖1 倒置顯微鏡下觀察肝細胞形態學改變 （×100）

3.2 丹皮酚保護肝細胞損傷的量效時效關系 用含不同濃度丹皮酚（250、125、62.5、31.25、15.625μmol/L）的培養液孵育不同時間 （0.5、1、3、6、12、24 h），加入含酒精（50 mmol/L）的培養液繼續孵育12 h后，MTT比色法測定丹皮酚對肝細胞損傷的預防作用 （細胞存活率檢測方法同前）。結果發現，丹皮酚 （125μmol/L）即可明顯抑制酒精對肝細胞的損傷 （P＜0.01）。12 h時丹皮酚 （125 μmol/L）抑制作用更明顯 （P＜0.001），見表2。

表2 MTT法檢測丹皮酚對肝細胞損傷的預防作用（）

表2 MTT法檢測丹皮酚對肝細胞損傷的預防作用（）

注：與空白組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，★★★P＜0.001，★★P＜0.01，★P＜0.05

組別 濃度/（μmol·L-1）0.5 h光密度值 存活率/% 1 h光密度值 存活率/% 3 h光密度值 存活率/% - 0.590±0.025 100 0.588±0.027 100 0.585±0.030 100模型組 - 0.402±0.021▲▲ 67 0.391±0.023▲▲ 67.1 0.390±0.026▲▲ 67.0丹皮酚 15.625 0.417±0.029 66 0.397±0.025 68.0 0.392±0.030 67.2 31.25 0.421±0.039 71 0.423±0.031 72.3 0.407±0.028 70.1 62.5 0.435±0.033★ 76 0.440±0.029★ 76.1 0.434±0.036★ 76.1 125 0.503±0.037★★ 84 0.490±0.032★★ 84.3 0.498±0.027★★ 84.3 250 0.431±0.027 69 0.499±0.019 68.5 0.421±0.028 68.5組別 濃度/（μmol·L-1）空白組6 h光密度值 存活率/% 12 h光密度值 存活率/% 24 h光密度值 存活率/% - 0.585±0.035 100 0.573±0.031 100 0.552±0.042 100模型組 - 0.391±0.027▲▲ 66.8 0.401±0.022▲▲ 70 0.385±0.034▲▲ 68.7丹皮酚 15.625 0.387±0.031 66.3 0.414±0.034 72.3 0.403±0.025 73 31.25 0.417±0.041 73.3 0.485±0.030★★ 84.6 0.436±0.029 80.7 62.5 0.445±0.043★ 76.1 0.517±0.041★★ 89.4 0.485±0.030★ 85.2 125 0.493±0.047★★ 84.3 0.557±0.034★★★ 97.2 0.535±0.031★★ 91.9 250 0.401±0.022 68.5 0.461±0.025 79.7 0.465±0.025★空白組80.6

3.3 丹皮酚對酒精致急性損傷的肝細胞釋放ALT、AST和MDA影響 收集正常對照組、繼續誘導組、Pae治療組（62.5、125、250μmol/L）培養上清液檢測ALT、AST、MDA水平。結果表明，50 mmol/L酒精作用于肝細胞后，明顯損傷肝細胞，導致肝細胞壞死，細胞內ALT、AST釋放量明顯升高，MDA水平升高，加重細胞炎性反應。而丹皮酚可明顯抑制ALT、AST釋放量的升高，降低MDA水平，提示Pae保護肝細胞與穩定肝細胞膜的結構和抗過氧化等作用有關，見表3。

表3 Pae對急性酒精肝細胞損傷ALT、AST和M DA的影響 （n=6，）

表3 Pae對急性酒精肝細胞損傷ALT、AST和M DA的影響 （n=6，）

注：與空白組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，★★P＜0.01，★P＜0.05

組別 濃度/（μmol·L-1）ALT/（U·mgprot-1）AST/（U·mgprot-1）MDA/（mmol·L-1）空白組 —30.18±3.45 29.25±1.21 36.34±2.19模型組 — 50.29±2.32▲▲ 57.31±2.11▲▲ 67.40±3.41▲▲丹皮酚 250 38.45±3.21★ 38.28±1.75★ 41.35±3.19★125 32.45±3.31★★ 30.29±2.27★★ 38.76±3.31★★62.5 41.77±4.35 41.40±2.750★ 45.54±4.56★

4 討論

酒精進入機體后，在肝細胞乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶、細胞色素P450等作用下產生氧自由基，而氧自由基不僅能直接使肝細胞損傷，而且可以通過促進肝細胞對脂質過氧化的敏感性，致使細胞膜和細胞器的破壞，酶系丟失，細胞死亡［12-17］。同時酒精本身和它的氧化物乙醛對肝細胞有直接毒性作用［18-19］。ALT、AST是肝細胞內主要酶系，在肝細胞膜受損時，胞內ALT、AST釋放增加，因此培養液中ALT、AST活性檢測是判斷肝細胞膜損傷最直接的標志［20-22］，肝細胞脂質過氧化的最終產物MDA，它的含量則反應膜脂質過氧化程度的強弱及肝細胞的受損程度［23］。肝細胞的存活情況利用MTT比色法檢測，直接反應肝細胞的損傷程度。

MTT比色法是一種具有簡、便、靈、驗用于檢測細胞存活和生長的方法，原理是存活的細胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT在細胞色素作用下還原為不溶于水的藍紫色（或藍色）的甲臜 （Formazan），并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。因此可以客觀、準確地反映活細胞數及其代謝強度［24-25］。利用臺盼藍染色鏡下觀察肝細胞的存活度：正常的活肝細胞，細胞膜結構完整，完全能夠排斥臺盼藍，使之不能夠進入胞內；而喪失活性或細胞膜不完整的細胞，胞膜的通透性增加，可被臺盼藍染成藍色。一般認為細胞膜喪失完整性，就可認為細胞死亡。因此，利用臺盼藍染色可以非常簡便、快速地區分活細胞和死細胞。臺盼藍是組織和細胞培養中最常用的死細胞鑒定染色方法之一。通過以上兩種方法更能客觀地評價細胞的存活情況。

為了充分證實丹皮酚對酒精性肝細胞損傷的抑制作用，本實驗選用L-02細胞株，以50 mmol/L乙醇處理12 h制備急性肝細胞損傷模型。通過MTT比色法、臺盼藍染色法和細胞形態學觀察中我們發現丹皮酚在62.5～250μmol/L劑量范圍內能夠抑制肝細胞的損傷，特別是125μmol/L劑量丹皮酚時，且作用12 h時，抑制肝細胞損傷的效應最為明顯。

實驗結果顯示：雖然低濃度酒精對肝細胞損傷不明顯，但是隨著酒精濃度的加大，肝細胞培養液中MDA、ALT、AST生化檢測結果逐漸升高，肝細胞存活率則逐漸下降，表明過量飲酒可引起肝細胞氧化損傷。與繼續誘導組相比，丹皮酚組ALT、AST的泄露量明顯降低，且MDA量降低兩組比較差異有統計學意義 （P＜0.05），說明丹皮酚可以減輕酒精對肝細胞膜的損害，從而改善肝細胞功能。與正常對照組相比，繼續誘導組各項指標明顯升高，提示肝細胞損傷嚴重。

在細胞水平實驗中出現的細胞損傷現象，與動物水平的實驗結果基本一致，并且相對動物實驗而言，細胞實驗的影響因素少，可行性高。故我們可以認為，細胞水平的實驗可以作為動物水平實驗的補充，兩者的有機結合，將為進一步研究酒精性脂肪肝的發病機制以及臨床治療藥物的篩選提供有效的途徑。

5 小結

丹皮酚體外給藥抑制酒精誘導肝細胞的ALT、AST和MDA釋放，提示其具有對肝細胞損傷的直接保護作用。

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R966

B

1001-1528（2015）04-0854-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.036

2014-11-08

安徽省優秀青年基金項目 （8040106905）

顏貴明 （1974—），男，碩士，副教授，主要從事丹皮酚抗脂肪肝作用及機制研究。Tel：（0551）68129301，E-mail：922-119@163.com

*通信作者：戴 敏 Tel：（0551）68129122，E-mail：daiminliao@163.com