葛根異黃酮類化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用及構效分析

馬錦錦， 林娟娜， 魏崧丞， 葉開和， 劉清霞， 王小康， 葉春玲

（暨南大學藥學院藥理學教研室，廣東廣州510632）

葛根異黃酮類化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用及構效分析

馬錦錦， 林娟娜， 魏崧丞， 葉開和， 劉清霞， 王小康， 葉春玲*

（暨南大學藥學院藥理學教研室，廣東廣州510632）

目的觀察葛根異黃酮類化合物對α-葡萄糖苷酶活性的影響，并分析其構效關系。方法以蔗糖作為底物，優化反應條件，建立α-葡萄糖苷酶-蔗糖篩選模型，觀察葛根異黃酮類化合物 （0.1、1、10、100μmol/L）對α-葡萄糖苷酶的抑制作用。結果大豆素、刺芒柄花素、大豆苷、3＇-甲氧基大豆素、葛根素、3＇-甲氧基葛根素對α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，其中大豆素、刺芒柄花素在100μmol/L時對α-葡萄糖苷酶的抑制作用明顯強于阿卡波糖（P＜0.01），其抑制率分別達37.56%和32.11%。3＇-羥基葛根素在0.1μmol/L時的抑制作用較強，但在100μmol/L的作用減弱。經構效分析發現：在大劑量時，異黃酮母核的3位和5位的取代基為羥基且其他位未被取代時，其抑制作用增強；4位取代基為糖氧基，活性將減弱；若為多糖氧基，其活性會更弱；6位為取代基為羥基，在低濃度時有較強的抑制作用，而在高濃度下作用很弱；若6位為甲氧基時，且4位被糖氧基取代時，活性減弱。結論葛根異黃酮類化合物對α-葡萄糖苷酶活性具有一定抑制作用，其中大豆素、刺芒柄花素對α-葡萄糖苷酶的抑制作用較強。

葛根；異黃酮類化合物；α-葡萄糖苷酶；抑制；構效關系

葛根（Pueraria Radix）為豆科植物野葛Pueraria Lobata（wild）Ohwi或甘葛藤Pueraria Thomsonii Benth的干燥根。葛根化學成分中的異黃酮類包括大豆素、大豆苷、3＇-甲氧基葛根素、3＇-羥基葛根素、刺芒柄花素、葛根素等［1］?，F代藥理學研究表明，異黃酮類化合物具有抗氧化，降血糖，降血脂，保護心肌，擴張冠狀血管以及抗血栓等藥理作用［2-3］。異黃酮類化合物對α-葡萄糖苷酶活性是否有影響，目前均尚未清楚，因此，本實驗建立α-葡萄糖苷酶-蔗糖篩選模型，觀察葛根異黃酮類化合物對α-葡萄糖苷酶活性的影響，并對其進行構效分析。

1 材料

1.1 藥物與試劑 葛根異黃酮類化合物大豆素、大豆苷、刺芒柄花素、3＇-甲氧基大豆素、葛根素、3＇-羥基葛根素、大豆苷元-8-C-芹糖 （1→6）葡萄糖、3＇-甲氧基葛根素，均由暨南大學中藥與天然藥物化學研究所提供。α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase）、DMSO均購自美國Sigma公司，蔗糖（Sucrose）購自廣州化學試劑廠，阿卡波糖（Acarbose）購自拜耳醫藥保健有限公司，無水碳酸鈉購自天津市大茂化學試劑廠，PBS購自博士德生物工程有限公司，葡萄糖測定試劑盒購自上海榮盛生物藥業有限公司。

1.2 儀器 BL255型電子天平 （北京賽多利斯儀器系統有限公司）；Tecan safire2全波長多功能酶標儀（瑞士Tecan集團）；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋 （上海精宏實驗設備有限公司）；QL-901型渦旋混合器 （海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；96孔細胞培養板 （美國Corning公司）；單道移液器（德國Eppendorf公司）；PHS-3C數字式酸度計（上海雷磁儀器廠）。

2 方法

2.1 葡萄糖的測定 葡萄糖經葡萄糖氧化酶作用生成葡萄糖酸和過氧化氫，后者在過氧化物酶的作用下，將還原性4-氨基安替比林與酚偶聯合成可被分光光度計測定的醌類化合物。用0.1 mol/L PBS（pH 6.8）將葡萄糖測定試劑盒中5.55 mmol/L葡萄糖標準液稀釋成1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 mmol/L，分別取不同濃度的葡萄糖溶液50μL，加入150μL葡萄糖工作液，充分混勻，置于37℃水浴15min，于酶標儀為505 nm波長處，以空白調零，檢測吸光度 （A），實驗重復3次。以吸光度為縱坐標，葡萄糖濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2.2 α-葡萄糖苷酶活性反應體系的建立 反應體系總體積為200μL，在70μL PBS（pH 6.8）中加入α-葡萄糖苷酶20μL，37℃預熱10 min，加入蔗糖10μL，37℃反應30 min，再加入0.1 mol/L Na2CO3溶液100μL終止反應，取上述反應液50μL，加入150μL葡萄糖工作液充分混勻，于37℃水浴15 min，于505 mm波長檢測吸光度 （A）。以不加酶液作為空白對照組，其他組分保持不變，分別改變蔗糖濃度、酶濃度，優化反應體系。確定反應體系后，以阿卡波糖作為陽性藥物，觀察阿卡波糖在濃度為10～104μmol/L時對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。

2.3 葛根異黃酮類化合物對α-葡萄糖苷酶活性的測定按 “2.2”項方法優化反應體系，結果為：PBS（pH 6.8）50μL，待測樣品20μL，1 U/mLα-葡萄糖苷酶20μL，37℃預熱10 min，加入0.8mmol/L蔗糖10μL，37℃反應30 min，再加入Na2CO3溶液100μL終止反應。觀察葛根異黃酮類化合物 （終濃度分別為 0.1、1、10、100 μmol/L）對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。實驗分組及操作過程見表1，每個濃度做4個復孔，重復3次實驗。

表1 α-葡萄糖苷酶活性反應體系

取上述反應液50μL，加入150μL葡萄糖工作液充分混勻，于37℃水浴15 min，于505 min波長檢測吸光度（A）。樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制作用的計算公式：抑制率=（A酶活性對照組-A樣品）/（A酶活性對照組-A酶空白組） ×100%。

2.3 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件分析，實驗數據以 （）表示。不同濃度葛根異黃酮類化合物與阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率進行配對t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 反應體系的建立 按 “2.1”項方法以吸光度為縱坐標，葡萄糖濃度為橫坐標，繪制葡萄糖的標準曲線 （y= 0.570 5x+0.000 7，r2=0.999 6），見圖1。確定α-葡萄糖苷酶的濃度后發現，當蔗糖的濃度為0.8 mol/L時，OD值到達最高值。因此，選擇0.8 mol/L蔗糖作為反應體系的底物濃度，見圖2。以0.8mol/L蔗糖作為底物，當酶濃度為1.0 U/mL時，OD值開始到達平臺期，葡萄糖生成量也較平緩。因此，選擇1.0 U/mL的α-葡萄糖苷酶作為反應體系的酶濃度，見圖3。確定蔗糖濃度和酶濃度后，改變阿卡波糖的濃度，結果發現在濃度為10～1×104μmol/L的范圍內，阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用呈劑量依賴關系，隨著濃度增加，其抑制率逐漸增大，其IC50為623μmol/L，見圖4。

3.2 葛根異黃酮類化合物對α-葡萄糖苷酶活性的影響

圖1 葡萄糖標準曲線

圖2 反應體系蔗糖的濃度

葛根異黃酮類化合物對α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，阿卡波糖在100μmol/L時的抑制率為15.82%。大豆素、刺芒柄花素、大豆苷、3＇-甲氧基大豆素、葛根素、3＇-甲氧基葛根素對α-葡萄糖苷酶的抑制作用很強，其中大豆素、刺芒柄花素在100μmol/L時對α-葡萄糖苷酶的抑制作用明顯強于阿卡波糖 （P＜0.01），其抑制率分別達37.56%和32.11%。而大豆苷、3＇-甲氧基大豆素、葛根素、3＇-甲氧基葛根素在100μmol/L時的抑制作用增強，與阿卡波糖相比無顯著性差異（P＞0.05）。3＇-羥基葛根素在0.1μmol/L時的抑制作用較強，但在100μmol/L的作用減弱。詳見圖5。

圖3 反應體系酶濃度

圖4 阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活性的影響

圖5 葛根異黃酮類化合物對α-葡萄糖苷酶活性的影響

3.3 葛根異黃酮類化合物抑制α-葡萄糖苷酶的構效關系葛根異黃酮類化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用可能存在以下的構效關系。

本次實驗發現，在大劑量時，異黃酮母核的3位和5位取代基均為羥基且其它位未被取代時，其抑制作用增強，大豆素比刺芒柄花素或大豆苷的抑制作用更強。若4位取代基為糖氧基，活性將減弱；若為多糖氧基，其活性會更弱，大豆素的抑制作用強于葛根素，而葛根素又強于大豆苷元-8-C-芹糖 （1→6）葡萄糖；若6位取代基為甲氧基時，且4位被糖氧基取代時，活性減弱，3＇-甲氧基大豆素的抑制作用強于3＇-甲氧基葛根素，見表2、圖6。

表2 異黃酮類化合物的化學結構

圖6 異黃酮的結構式

4 討論

糖尿病是以高血糖為顯著特征的慢性代謝性疾?。?-5］，餐后高血糖是2型糖尿病早期糖代謝異常的指標［6］，因此，降低餐后血糖是防治糖耐量受損 （IGT）、2型糖尿病以及其并發癥的重要因素［7-8］。α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）存在于小腸黏膜細胞刷狀緣，是食物中絕大部分碳水化合物消化的一種關鍵酶，將多糖、雙糖水解成單糖，然后被機體吸收［9-10］。

α-葡萄糖苷酶抑制劑通過抑制α-葡萄糖苷酶的活性，減少淀粉和蔗糖的水解，延緩糖的吸收，降低餐后血糖和HbA1c水平，進而改善餐后高血糖和高胰島素血癥，這對糖尿病并發癥的預防及治療具有重要的意義［11-12］。一個理想的葡萄糖苷酶抑制劑往往具有以下幾個特征：含陽離子、三角形的異頭碳中心、并且有一個共價連接的環形成半椅狀或椅狀構型，以及恰當的羥基構象。因此，帶有可以質子化基團的抑制劑可以與酶優先結合，并且這個質子一般是處于環內氧的位置或取代異頭碳，或是在糖苷鍵連接的位點［13-14］。目前上市的 α-葡萄糖苷酶抑制劑具有以上特征，主要有阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇，具有作用溫和持久、毒副作用小的優點［15］。

本實驗發現，大多數葛根異黃酮類化合物對α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，其中大豆素、刺芒柄花素在100 μmol/L的作用較強，甚至強于阿卡波糖。葛根異黃酮類化合物對α-葡萄糖苷酶有不同程度的抑制作用，這可能與葛根異黃酮類化合物的化學結構有關。葛根異黃酮類化合物的基本母核為3-苯基色原酮，經構效分析發現：在大劑量時，異黃酮母核的3位和5位取代基均為羥基且其他位未被取代時，其抑制作用增強；4位取代基為糖基，其活性減弱；若為多糖基，其活性會更弱；6位取代基甲氧基時，且4位被糖氧基取代時，活性減弱。這與良好的葡萄糖苷酶抑制劑所具有的特征有些差別，但大豆素、刺芒柄花素抑制作用較強，有可能成為潛在的葡萄糖苷酶抑制劑，其有待進一步研究。本實驗結果也提示，抑制α-葡萄糖苷酶，降低餐后血糖，可能也是葛根異黃酮類化合物的降血糖的作用機制之一。

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1001-1528（2015）04-0858-05

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2014-01-10

廣東省高等學?？萍紕撔轮攸c項目 （cxzd1111）

馬錦錦（1988—），女，碩士生，研究方向為內分泌藥理學。Tel：13719425254，E-mail：majin569@163.com

*通信作者：葉春玲 （1963—），博士，教授，碩士生導師，研究方向為內分泌藥理學。Tel：（020）85223843，E-mail：yechunling2005@163.com