多指標綜合評分法優選甘草抗氧化活性成分閃式提取工藝

闞俊明，雷岱虹，宗 穎，查榮博，張 輝*，孫佳明*

(1.黑龍江中醫藥大學，哈爾濱150000;2.長春中醫藥大學，長春130117;3.吉林農業大學，長春130118)

甘草(Glycyrrhiza)為多年生草本植物，屬豆科，主要有烏拉爾甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)、脹果甘草(Glycyrrhiza inflataBatal.)和光果甘草(Glycyrrhiza glabraL.)。甘草味甘甜，性平，歸心、肺、脾、胃經，具有補脾益氣，清熱解毒，緩急止痛，祛痰止咳，調和諸藥的功效［1］。研究［2-7］表明，甘草具有抗炎、抗菌、抗過敏、抗氧化、抗疲勞、抗焦慮和抗心律失常等生理功能。尤其甘草中黃酮類成分能夠明顯的清除或抑制體內自由基，并且對食用油脂也具有良好的抗氧化效果，所以甘草除藥用外，也多應用于食品和化妝品行業。目前，甘草活性成分的提取方法有快速溶劑萃取法、超聲波法、微波法、超臨界CO2萃取法、高速逆流色譜法、超高壓法、回流提取法等［8-13］。閃式提取法是在適當溶劑條件下，利用內外刀刃間形成的超速動態分子的滲透作用和強力振動作用，從而破壞植物細胞組織，使組織細胞內部的有效成分迅速達到組織內外平衡，進而達到快速提取目的的一種方法，具有高效節能、操作簡便、節能經濟等優點［14-15］。本實驗采用正交試驗設計，利用閃式提取法提取甘草抗氧化活性成分，以甘草總黃酮含量、DPPH自由基清除率和浸膏得率的綜合評分為指標，考察甘草抗氧化活性成分閃式提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 甘草藥材購于吉林大藥房，均經長春中醫藥大學張輝教授鑒定為甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)的干燥根;蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所);DPPH自由基(美國Sigma公司);甲醇、無水乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH等均為國產分析純試劑。

1.2 儀器與設備 閃式提取器(北京金鼐科技發展有限公司);BP211D型電子天平(德國賽多利斯股份公司);紫外可見分光光度計(Cary 50 UV-VIS)(美國瓦里安公司);KQ5200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);酶標儀Bio-Rad;數顯鼓風干燥箱(上海博迅實業有限公司);DZF-6050型真空干燥箱(上海一恒科技有限公司);電熱恒溫水浴鍋(北京華恒萬儀儀器有限公司);旋轉式恒溫振蕩器(蘇州培英實驗設備有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 浸膏得率的測定 定量量取甘草提取液，置已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干后，置真空干燥箱內干燥24 h，將干燥后的提取物取出，精密稱定質量。

1.3.2 甘草總黃酮含量測定 取蘆丁對照品40 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加入甲醇5 mL，置水浴上微熱使溶解加甲醇至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，加水至刻度，制得蘆丁對照品溶液(0.40 mg/mL)。精密量取對照品溶液0、1、2、3、4、5 mL置于25 mL 容量瓶中，加水至5 mL，各加入5%NaNO2溶液1 mL混勻，放置等待6 min，再加入10%Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻后放置等待6 min后，此時溶液顏色加深，最后加入濃度為4%NaOH溶液10 mL，加水至刻度，搖勻，放置等待15 min。以70%的乙醇為空白，用紫外分光光度法于510 nm波長處測定不同濃度蘆丁對照品溶液的吸光度。以吸光度(Y)為縱坐標，蘆丁對照品溶液的濃度(X)為橫坐標，進行直線回歸，制備標準曲線［16］，回歸方程為A=10.010 2 C+0.012 6(r=0.999 9，n=5)，結果表明蘆丁在0.008～0.040 mg/mL濃度范圍內呈良好的線性關系。吸取相應的甘草閃式提取液適量，分別置于容量瓶中，按以上方法，于510 nm處測定吸光度，以不加供試品的平行樣為空白。根據標準曲線計算出供試品中總黃酮的含量。

1.3.3 對DPPH自由基清除活性的測定 運用抑制DPPH的方法［17］，對甘草提取物進行體外抗氧化活性評價。精密量取濃度為26.4 mg/L的DPPH 70%乙醇溶液2 mL，分別加入至2 mL以70%乙醇為溶劑已配制好的不同濃度的樣品液中，充分混勻，避光條件下反應30 min，在517 nm測定其吸光度。同時以2 mL 70%乙醇溶液作為空白對照A0，以樣品溶液2 mL與2 mL7 0%乙醇溶液混合作為樣品對照Aj，并以VitE作為陽性對照，以樣品液對DPPH溶液清除率Y計算公式。

1.3.4 正交試驗 以乙醇為提取溶媒，以提取時間、醇濃度、提取次數、固液比為考察因素，進行L9(34)正交試驗，并以甘草總黃酮含量、DPPH自由基清除率和浸膏得率為評價指標，篩選最佳工藝條件，結果見表1。評分時以各指標的最大值為參照將數據進行歸一化，再給出不同的權重。從生物活性和化學成分兩個角度來分析，將DPPH自由基清除率的權重系數設為0.5，總黃酮含量的權重系數設為0.3，浸膏得率的權重系數設為0.2。以綜合值進行統計分析，結果見表2和表3。其中綜合評分Y=0.3X1×100/7.16+0.5X2×100/55.77+0.2X3×100/29.00。

表1 因素水平表

表2 工藝優化正交試驗方案設計及結果

表3 方差分析表

2 結果與分析

直觀分析表明，以綜合評分為標準，在所選因素水平范圍內，醇濃度對甘草抗氧化有效成分的提取效果影響最大。方差分析表明，因素B(醇濃度)為主要影響因素，具有顯著性，因素A、C、D不顯著。故選取最佳提取條件為A2B1C3D2，即90%乙醇，料液比為1∶20(g/mL)，提取次數3次，每次2 min。

為進一步考察優選工藝的可靠性及穩定性，取3分藥材按上述最佳提取工藝進行驗證實驗，甘草生藥量總黃酮含量為7.24%;DPPH自由基清除活性為60.26%;對浸膏得率為16.30%。驗證實驗結果表明，該優選工藝穩定、可靠。

3 小結

本文針對甘草中抗氧化有效成分的提取，重點考察了其DPPH自由基清除能力，并結合總黃酮含量、浸膏得率綜合評分，從而得到富含抗氧化活性成分的甘草閃式提取工藝，更有效地控制生產過程，從根本上保證甘草在食品、藥品方面的質量。

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