慢性丙型肝炎中醫證型與HCV 1b亞型NS5A aa變異、IL28B SNP的關系

李京濤，魏海梁，席 奇，劉亞珠，閆曙光，惠 毅，宋春榮，寧春茜，常占杰

(1.陜西中醫學院附屬醫院，陜西咸陽712000;2.陜西中醫學院，陜西咸陽712000)

聚乙二醇化干擾素(pegylated interferon，PEGIFN)聯合利巴韋林(Ribavirin，RBV)治療是目前慢性丙型肝炎(CHC)患者的標準抗病毒方案。但此方案對HCV lb亞型的療效不佳，持續病毒學應答率(SVR)僅約55%［1］。結合病毒和宿主兩方面的關鍵因素分析，HCV 1b亞型病毒株基因NS5A蛋白多個區域的氨基酸(amino acid，aa)序列突變數目與IFN、IFN/RBV 的療效 有關，這 些 區域 包 括 ISDR［2］、PKRBD［3］、V3［4］、IRRDR［5-6］;而 人 19 號 染 色 體，IL28B上游rs12979860和rs8099917基因位點單核苷酸多態性(SNP)與抗病毒治療的SVR密切相關［7-9］。中醫藥在慢性丙型肝炎的臨床診療中發揮著重要作用［10-11］。傳統的中醫辨證論治是通過對四診所收集的資料，進行歸納分析、綜合，概括、判斷為某種證，并確立相應的治療方法。但是，慢性肝病的證候演化復雜多變，在眾多“顯性證候”之外，更多的是“隱性證候”［12］，因此，開展慢性肝病的證候客觀量化研究符合現代中醫藥臨床和科研發展的趨勢。筆者探索性地將慢性丙型肝炎的傳統中醫分型與影響HCV 1b亞型抗病毒療效的NS5A aa變異、IL28B SNP檢測結果進行統計分析，探討其是否存在相關性。現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 58例慢性丙型肝炎患者均為2012年7月—2014年7月在陜西中醫學院附屬醫院門診及住院的患者。納入標準和排除標準參考《丙型肝炎防治指南》［1］中的慢性丙型肝炎:HCV感染超過6個月，或發病日期不明、無肝炎史，但肝臟組織病理學檢查符合慢性肝炎，化驗結果顯示HCV RNA＞1 000 U/mL(深圳匹基)，抗-HCV陽性。入組的患者均需經過治療前評估:包括患者的年齡、性別、感染途徑等。

1.2 研究方法 慢性丙型型病毒性肝炎中醫辨證標準參照“國家十一五科技重大專項課題”結果［13］，將慢性丙型肝炎患者中醫證型概括為以下6種:正虛邪戀、脾腎陽虛、濕熱中阻、肝郁脾虛、肝腎陰虛和瘀血阻絡。辨證分型結論由2位主治醫師共同判斷，并由1位主任醫師審核確定。

1.3 觀察指標 1)肝臟生化指標:谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、總膽紅素(TBIL)。由HITACHI 7600-020全自動生化分析儀完成。2)HCV RNA:采用實時熒光定量PCR法檢測血清HCV RNA定量，儀器為ABl7300，試劑由深圳匹基基因公司提供，檢測下限為1 000 U/mL。3)HCV基因分型:HCV-1b亞型按文獻［14］方法確定。4)HCV NS5A的擴增和序列比對:RT-PCR檢測患者血清中HCV NS5A片段，RT-PCR反應條件和引物采用筆者已經建立的方法［15］。陽性產物經純化后送上海英駿公司測序。測序結果經MEGA 4軟件進行DNA序列比對，參考序列為HCV 1b原始株(HCV J，Gen-Bank 90208)，繼之轉換成 NS5A aa序列(aa 2209-2379)，分析 ISDR、PKRBD、V3、IRRDR 和 NS5A(ISDRV3)區突變情況。5)IL28B SNP檢測:采用四引物擴增受阻突變體系聚合酶鏈反應(tetra-primer amplification refractory mutation system polymerase chain reaction，TARMS-PCR)擴增rs8099917，擴增產物結果進行電泳鑒定，具體PCR引物和反應條件采用已建立的方法［16］。

1.4 統計學方法 采用SPSS 19.0進行統計分析，計量資料采用均數±標準差(±s)表示，中醫分型多組的差異比較采用One WAY-ANOVA檢驗，進一步的多重比較采用LSD法。方差不齊時，選擇近似F檢驗Welch法;計數資料采用頻數和百分數描述，其差異比較采用χ2檢驗;所有統計采用雙側檢驗，P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 慢性丙型肝炎中醫證型分布情況，本研究結果和陳建杰等［14］多中心、大樣本流行病學研究數據基本一致，見表1。

表1 慢性丙型肝炎中醫證型分布 例

2.2 慢性丙型肝炎中醫證型與患者基線情況、肝功能、HCV RNA比較情況 見表2。

2.3 不同證型與NS5A蛋白各區段aa變異、IL28B SNPs比較情況 見表3。

表2 不同證型的基線情況比較

表3 不同證型的NS5A aa變異和IL28B SNPs比較(±s)

表3 不同證型的NS5A aa變異和IL28B SNPs比較(±s)

證 型 例數 ISDR PKRBD V3 IRRDR NS5A(ISDR-V3)IL28B(TT/TG)正虛邪戀 25 0.88 ±0.73 5.52 ±1.20 4.72 ±1.28 5.80 ±1.50 17.20 ±2.06 18/7脾腎陽虛 5 0.60 ±0.89 5.60 ±0.89 5.00 ±1.00 5.80 ±1.79 17.60 ±2.89 3/2濕熱中阻 9 1.44 ±1.74 6.22 ±2.22 5.22 ±1.09 6.00 ±1.41 18.00 ±3.00 9/0肝郁脾虛 13 0.77 ±0.73 5.46 ±1.33 4.38 ±1.04 5.15 ±1.57 15.46 ±3.36 11/2肝腎陰虛 3 1.00 ±0.00 6.00 ±0.00 5.00 ±0.00 6.00 ±0.00 18.67 ±1.15 3/0瘀血阻絡 3 1.33 ±0.58 5.67 ±1.16 6.00 ±1.00 6.67 ±1.16 18.00 ±2.65 3/0 F/χ2 0.842 0.434 1.322 0.719 1.549 7.221 P 0.526 0.823 0.269 0.612 0.191 0.205

3 討論

慢性丙型肝炎本虛邪戀型的主要癥狀為乏力、面色無華、小便黃、口干、腹脹等，弦脈、淡紅舌、白苔或膩苔，而慢性丙型肝炎的臨床特點是大多數患者無明顯臨床癥狀，且血清丙氨酸轉移酶(ALT)正常或輕度升高，但是HCV在肝細胞內持續復制，造成肝組織學的炎癥損害和纖維化緩慢進展［17］。由于這些臨床表現均為非特異性的癥狀和體征，所以常常容易被忽視和漏診。本研究顯示慢性丙型肝炎的中醫證型中，本虛邪戀型占43.1%，提示應該重視對丙型肝炎的臨床篩查和研究。

本研究結果顯示慢性丙型肝炎中醫證型與患者年齡和球蛋白有關。不同中醫證型組間患者的年齡從小到大依次排列為:肝郁脾虛＜濕熱中阻＜正虛邪戀＜脾腎陽虛＜瘀血阻絡＜肝腎陰虛，提示肝郁脾虛型多見于年輕患者，瘀血阻絡型和肝腎陰虛型多見于中老年患者。肝病患者球蛋白水平升高說明HCV感染存在的時間長，累積的肝纖維化程度較重［18］。不同中醫證型組間患者的球蛋白水平從低到高依次排列為:肝郁脾虛＜正虛邪戀＜肝腎陰虛＜濕熱中阻＜脾腎陽虛＜瘀血阻絡，提示肝郁脾虛型的肝纖維化較輕，而脾腎陽虛和瘀血阻絡型肝纖維化較重。

HCV 1b亞型NS5A aa變異以及IL28B SNPs均與以干擾素為基礎的抗病毒治療應答效果密切相關。HCV NS5A位于HCV基因組nt 6258-7601區域，編碼447個氨基酸，是高度磷酸化的非結構蛋白，其中ISDR、PKR、V3、IRRDR 和 NS5A(ISDR-V3)區的氨基酸突變可以影響抗病毒治療的SVR［2-6］。本研究發現中國陜西地區HCV 1b亞型CHC患者的NS5A氨基酸突變與中醫分型無相關性。2009年，Ge.D等［7］采用全基因組關聯分析(Genome Wide Association Studie，GWAS)方法，發現人19號染色體，IL28B上游的SNP位點rs12979860基因型明顯與基因1型抗病毒治療的 SVR 有關。同年 Suppiah，V［9］和 Tanaka.Y等［10］在nature發表IL28B另一 SNP位點 rs8099917的研究結果。由于此兩個SNP位點具有很強的連鎖不平衡［16］，所以檢測任一個位點即可。本研究顯示中國陜西地區IL28B SNP位點rs8099917以TT型為主，占81.03%(47/58)，TG 型占 18.97%(11/58)，未發現GG型，數據與之前對華南地區的研究一致［16］。但未發現慢性丙型肝炎患者中醫分型與NS5Aaa突變和IL28B SNP具有相關性。

總之，慢性丙型肝炎的中醫證候客觀量化研究有利于現代中醫、中西醫的臨床實踐和科研創新［19-20］。本研究結果顯示慢性丙型肝炎中醫證型中，正虛邪戀型最多，結合年齡和球蛋白水平分析，肝郁脾虛型多見于年輕患者，且肝纖維化程度較輕，而瘀血阻絡型和脾腎陽虛型多見于中老年患者，肝纖維化程度較重，而慢性丙型肝炎中醫證型與HCV RNA、NS5A aa變異以及IL28B SNP無關，限于例數較少，這一結論需要后續大樣本的研究進一步證實。

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