非布司他原料2種含量測定方法的比較研究

沈衛陽，郭靜沫，施 睿，沈圃毅，金祥飛（1.中國藥科大學理學院，南京 210009；2.藥物質量與安全預警教育部重點實驗室，南京 210009；.南京師范大學附屬中學，南京 21000）

·藥物分析·

非布司他原料2種含量測定方法的比較研究

沈衛陽1，2＊，郭靜沫1，2，施 睿3，沈圃毅3，金祥飛1，2（1.中國藥科大學理學院，南京 210009；2.藥物質量與安全預警教育部重點實驗室，南京 210009；3.南京師范大學附屬中學，南京 210003）

目的 建立并比較滴定法和高效液相色譜法測定原料中非布司他含量。方法 化學分析法，用乙醇作為溶劑，氫氧化鈉溶液為標準溶液，酚酞為指示劑進行滴定。高效液相色譜法，采用Inertsil ODS－SP（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱；流動相為1 mL·L－1磷酸溶液（三乙胺調pH值至2.4）－乙腈（45∶55）；流速為1.5mL·min－1；柱溫為30℃；檢測波長為315nm。結果 2種方法均符合方法學驗證要求，測定同一樣品，測量值差異無統計學意義（P＜0.05）。結論 2種分析方法均能快速、有效地測定原料中非布司他的含量，均可作為非布司他原料質量控制的分析方法。

非布司他；含量測定；容量分析；高效液相色譜法

非布司他是一種非嘌呤、非競爭性的黃嘌呤氧化酶（XO）抑制劑［1］，用于治療痛風，2009年2月獲美國食品藥品管理局（FDA）批準，同年3月在美國上市。該藥2010年獲歐盟批準，先后在法國、英國和德國等多個國家上市［2］，在中國于2013年2月上市［3］。與別嘌醇和安慰劑相比，非布司他在降低患者血尿酸水平方面更有效。輕中度肝功能損害及輕中度腎功能損害對非布司他的藥動學參數無顯著影響［4］。本文建立了酸堿滴定法和高效液相色譜法對非布司他原料的含量進行了測定，并對2種方法進行了比較［4－6］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC－2010AHT高效液相色譜儀（包括LC－10AT泵、LC－20ADAD檢測器和LC solution色譜工作站，日本島津公司）；UV－1800紫外分光光度儀（日本島津）；BS124S電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）。

1.2 試藥 非布司他（批號20110612，20110616，20110620，由福州辰星藥業有限公司提供）；非布司他對照品（批號20110529，質量分數99.8%，由福州辰星藥業有限公司提供）；乙腈（色譜純，Merck公司）；超純水（優普超純水制造儀）；其余試劑除注明外均為分析純。

2 方法與結果

2.1 滴定法

2.1.1 滴定方法選擇 非布司他在乙醇中略溶，在水中幾乎不溶。從結構式（見圖1）可以看出，非布司他中含有一個羧基官能團，可與堿發生酸堿中和反應，故選擇乙醇作為溶劑，氫氧化鈉為滴定液進行滴定。

取本品約0.65g，精密稱定，加中性乙醇50mL溶解后，加酚酞指示液3滴，用氫氧化鈉滴定液（0.1 mol·L－1）滴定。每1mL氫氧化鈉滴定液（0.1 mol·L－1）相當于31.64mg的C16H16N2O3S。

2.1.2 滴定曲線的繪制與指示劑的選擇 在滴定分析中，我們用電位滴定法進行了滴定終點的判斷，并考察了酚酞作為指示劑，化學計量點前后溶液顏色的變化情況。滴定曲線如圖2所示。

圖1 非布司他的結構式Fig.1 Chemical structure of febuxostat

圖2 滴定曲線Fig.2 Titration curve

由圖2可知，該法滴定突躍大，終點顏色變化明顯（從無色→淡紅色），指示劑法判斷滴定終點與電位滴定二階微商線性內插法結果相一致。

2.1.3 成比例的系統誤差、額外的系統誤差與精密度實驗 稱取7份不同質量的非布司他供試品（0.163 4，0.337 9，0.415 3，0.495 9，0.571 2，0.653 5和0.730 8g），加中性乙醇50mL溶解后，加酚酞指示液3滴，用氫氧化鈉滴定液（0.1mol·L－1）滴定，使滴定終點消耗的滴定液體積為所用滴定管體積（25mL）的20%，40%，50%，60%，70%，80%和90%，記錄供試品的滴定體積。以滴定體積為因變量對供試品質量進行回歸。實驗結果見表1。

表1 滴定的線性方程Tab.1 Linear equation of titration

2.1.3.1 成比例的系統誤差 按公式（1）和（2）進行計算。

bobs為表1中線性方程計算得到的斜率；btheor為滴定常數；Mr為相對分子質量；Z為化學反應的計量系數；Cr為滴定液的濃度，本實驗Cr＝0.099 06 mol·L－1。

結果表明，成比例的系統誤差為－0.06%，滿足定量分析法中含量測定對成比例系統誤差的絕對值小于0.5%的要求。

2.1.3.2 額外的系統誤差 按公式（3）和（4）進行計算。

aobs為線性方程的截距；mT為供試品的預期稱樣量，本實驗mT＝0.65g；VT為預期或目標滴定體積。

結果表明，額外的系統誤差為－0.32%，滿足絕對值小于0.6%的要求。

2.1.3.3 精密度（統計學誤差） 按公式（5）和（6）進行計算。

sdv（V）是標準偏差的估計值；Vi為消耗滴定液的體積；mi為供試品的實際稱樣量；n為滴定的次數。

結果表明，該方法的精密度為0.24%，滿足小于0.5%的要求。

2.1.4 重復性實驗 精密稱取本品（批號20110612）6份，按2.1.1項下的方法進行操作，測定其含量，結果含量平均值為99.58%，RSD為0.12%，Δx值為－0.42%，符合含量限度99%～101%、重復性RSD＜0.33%、相對準確度±0.67%的要求［7］，因此，用酸堿滴定法測定非布司他含量是可行的。

2.2 高效液相色譜法

2.2.1 色譜條件 采用Inertsil ODS－SP（250mm ×4.6mm，5μm）色譜柱；流動相為乙腈－1mL·L－1磷酸溶液（三乙胺調pH值至2.4）（55∶45）；檢測波長為315nm；流速為1.5mL·min－1；進樣體積20 μL；柱溫為30℃。

2.2.2 對照品溶液及供試品溶液的配制 精密稱取非布司他自制對照品約3mg，置于10mL量瓶中，加乙腈溶解并用流動相稀釋至刻度，搖勻，精密量取5mL，置于50mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。精密稱取非布司他供試品約15mg，置于50mL量瓶中，加乙腈溶解并用流動相稀釋至刻度，搖勻，精密量取5mL，置于50mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.2.3 線性范圍考察 精密稱取非布司他自制對照品14.90mg，置于50mL量瓶中，用乙腈溶解并用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得質量濃度為300 μg·mL－1的非布司他標準儲備液。分別吸取該標準儲備液0.10，0.20，0.50，1.00，2.00和5.00mL，置于10mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，制成質量濃度分別為2.98，5.96，14.90，29.80，59.60和149.00μg·mL－1的非布司他標準系列溶液。精密量取各標準系列溶液20μL，注入高效液相色譜儀，以峰面積（Y）為縱坐標、非布司他質量濃度（X）為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：Y＝65 016 X－2 176，r＝0.999 9。結果表明，非布司他質量濃度在2.98～149.00μg·mL－1范圍內，與峰面積具有良好的線性關系。

2.2.4 精密度實驗 取標準系列溶液中14.90 μg·mL－1的對照品溶液，連續進樣6次，記錄峰面積，計算其RSD為0.032%；取同一批原料（批號20110612），由不同分析人員在不同日期，在2臺高效液相色譜儀上進行含量測定，結果平均含量為99.50%，RSD為0.50%（n＝8），可見該方法進樣精密度和中間精密度均良好。

2.2.5 重復性實驗 取同一批號原料（批號20110612），平行測定6次，外標法計算含量，結果平均含量為99.67%，RSD為0.52%（n＝6），表明重復性良好。

2.2.6 檢測限與定量限 取標準系列溶液中2.98 μg·mL－1的對照品溶液，用稀釋法測其檢測限（S／N＝3）和定量限（S／N＝10），實驗結果表明，在本色譜系統條件下，檢測限約為0.07ng，定量限約為0.2ng。

2.2.7 穩定性實驗 取1份非布司他含量測定供試品溶液（批號20110612）于0，2，4，8和24h分別進樣，測得峰面積RSD為0.053%（n＝6），可見其在24h內穩定性較好，能夠滿足測定要求。

2.2.8 方法專屬性 非布司他原料（批號20110612）經酸、堿、高溫、氧化和光照破壞后，配制成供試品溶液，各取20μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分保留時間的3倍。結果降解產生的雜質均能與非布司他完全分離，分離度（R）均＞1.5；主峰峰純度均為1.000，表明非布司他主峰中不包含其他雜質峰。以上實驗結果表明，本法專屬性強，可用于原料中非布司他的含量測定。色譜圖見圖3。

圖3 高效液相色譜圖A.未破壞樣品；B.酸破壞樣品；C.堿破壞樣品；D.氧化破壞樣品；E.高溫破壞樣品；F.強光破壞樣品Fig.3 HPLC chromatogramsA.non－destruction sample；B.acid destruction sample；C.alkali destruction sample；D.oxidative destruction sample；E.high temperature destruction sample；F.light destruction sample

3 滴定法與高效液相色譜法的比較

取非布司他原料藥（批號20110612）用滴定法和高效液相色譜法分別平行測定6次，并對結果進行F檢驗和t檢驗，結果見表2。

表2 2種含量測定方法結果比較Tab.2 The results determined by the two methods （n＝6）

由此認為，這2種方法精密度不存在顯著差異（P＜0.05）。

4 討論

4.1 檢測波長的選擇 非布司他紫外吸收譜在217和315nm處有吸收峰，考慮217nm處接近末端吸收，干擾較大，基線噪聲大，不易平衡，且315nm處吸收大，干擾小，故高效液相色譜法選擇315nm為檢測波長。

4.2 流動相的選擇 本實驗分別考察了磷酸體系、甲酸體系和乙酸體系，結果磷酸體系基線穩定，與最近雜質分離度較好。非布司他結構中含有羧基官能團，應將流動相調節為酸性，使其呈游離狀態，考察結果表明，pH從4.0降到2.4，峰形有明顯改善，pH繼續從2.4降低到2.0，峰形幾乎沒有變化，pH過低對色譜柱傷害較大，所以最終選定pH為2.4。

4.3 含量測定方法的選擇 原料藥的純度要求高，限度要求嚴格，含量測定注重方法的準確性。酸堿滴定法為容量分析法，操作較簡單，準確度較高，可以不用對照品，并且避免了使用貴重儀器［8］，在有關物質檢查同時控制的條件下，可以首先考慮用滴定法；高效液相色譜法是進行新藥包括原料藥研發與質量控制的理想方法，分離效率高，精確度高，檢測靈敏度高，操作自動化，應用廣泛［9－11］。此2種方法均能準確有效地檢測原料中非布司他的含量，可以根據分析目的和實驗室條件，選擇適宜的方法。

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Comparitive study on two assay methods of febuxostat

SHEN Weiyang1，2＊，GUO Jingmo1，2，SHI Rui3，SHEN Fuyi3，JIN Xiangfei1，2（1.School of Sciences of China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China；2.Key Laboratory of Drug Quality Control and Pharmacovigilance Ministry of Education，Nanjing 210009，China；3.the Affiliated Senior High School of Nanjing Normal University，Nanjing 210003，China）

Objective To establish and compare the titration method and high performance liquid chromatography（HPLC）method for determining the content of febuxostat.Methods For chemical analysis，ethanol was used as the solvent，sodium hydroxide as the volumetric solution and phenolphthalein as an indicator for titration.The HPLC was carried out on an Inertsil ODS－SP（250 mm×4.6mm，5μm）column；the mobile phase consisted of 1mL·L－1phosphoric acid solution（adjust pH value to 2.4by triethylamine）－acetonitrile（45∶55）with a flow rate of 1.5mL·min－1；the column temperature was set at 30℃；the detection wavelength was 315nm.Results The 2methods both met the requirements of methodology validation，and there was no significant difference between the results obtained from the titration method and HPLC method（P＜0.05）.Conclusion The two methods can detect febuxostat content effectively and suitable for the quality control of febuxostat.

febuxostat；content determination；volumetric titrations；HPLC

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.02.009

R927.2

A

1004－2407（2015）02－0134－04

2014－09－10）

＊通信作者：沈衛陽，男，博士，副教授

郭靜沫，女，在讀碩士研究生