培美曲賽二鈉與奧沙利鉑在Beagle犬體內的藥動學相互作用

鄭 鑫，李 茜，尤海生，于 佳（西安交通大學第一附屬醫院，西安 710061）

培美曲賽二鈉與奧沙利鉑在Beagle犬體內的藥動學相互作用

鄭 鑫，李 茜，尤海生，于 佳（西安交通大學第一附屬醫院，西安 710061）

目的 探討在Beagle犬體內，培美曲賽二鈉和奧沙利鉑聯合用藥前后藥動學變化規律。方法 采用自身對照隨機交叉法，將9只Beagle犬隨機分成培美曲賽二鈉組、奧沙利鉑組以及培美曲賽二鈉和奧沙利鉑聯合給藥組，經靜脈給藥后，于不同時間點采集血樣，LC－MS／MS法測定二者的血藥濃度，DAS3.2.1統計矩法計算藥動學參數，AUC和Cmax用“生物等效性與生物利用度”模塊下的90%可信區間法進行統計。結果 與單獨給藥比較，聯合使用培美曲賽二鈉和奧沙利鉑的主要藥動學參數t1／2、CLint和MRT均無顯著性差異（P＞0.05）；藥物單用與合用組的AUC和Cmax在90%可信區間的生物等效性統計結果合格，tmax檢驗結果差異無統計學意義（P＞0.05）。結論 Beagle犬同時注射培美曲賽二鈉和奧沙利鉑不存在顯著的藥動學相互作用。

培美曲賽二鈉；奧沙利鉑；藥動學相互作用

培美曲賽二鈉（pemetrexed disodium）是一種結構上以吡咯嘧啶基團為核心的抗葉酸藥物，它可以作用于葉酸代謝過程的多個酶，包括胸苷酸合成酶（TS）、二氫葉酸還原酶（DHFR）和甘氨酰胺核苷酰基轉移酶（GARFT）等，可以從多個途徑抑制嘧啶和嘌呤的合成，造成葉酸代謝和核苷酸合成過程的異常，通過破壞細胞內這些依賴性的正常代謝過程，抑制細胞復制，從而抑制腫瘤的生長［1－2］。臨床前及臨床研究證實，其有明確的抗多種實體腫瘤的活性，包括肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌等，對惡性胸膜間皮瘤（MPM）的治療尤為有效，具有良好的療效和輕微的毒副作用［3－4］。鉑類金屬藥物是當前抗腫瘤藥物最為活躍的研究開發領域之一。鉑類配合物具有許多獨特的理化性質，其在腫瘤治療方面的療效顯著，被廣泛應用于臨床，成為腫瘤聯合用藥方案中的重要組成部分。統計數據表明，我國所有的化療方案中有70%～80%以鉑類為主或有鉑類藥物參與配伍［5］。奧沙利鉑（草酸鉑，oxaliplatin，L－OHP）是繼卡鉑、順鉑后的第三代鉑類廣譜抗癌藥物，是一種突破性的、獨特的鉑類化合物，毒性較低，使用安全性良好［6］，主要是使腫瘤細胞內DNA形成鏈間和鏈內交連，從而中斷DNA合成，最終產生細胞毒和抗腫瘤活性［7］。目前，奧沙利鉑已成為治療結腸、直腸癌的一線藥物［8］，與培美曲賽二鈉聯合應用治療惡性間皮瘤、晚期非小細胞肺癌、晚期胃癌、結腸癌、晚期肺腺癌等受到推崇，可明顯延長患者的生存時間并改善癥狀［912］。本實驗采用LC－MS／MS法檢測，首次探討了培美曲賽二鈉和奧沙利鉑聯合用藥時的藥動學相互作用，為臨床用藥提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC－30A高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；Xevo TQ質譜儀（美國Waters公司）；Xw－80A旋渦混合器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；ME104電子天平（瑞士梅特勒－托利多集團）；Sigma 13K15高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；Elix 20水純化系統（18.2M，德國MERCK MILLIPORE公司）。

1.2 試藥 培美曲賽二鈉對照品（上海酶聯生物科技有限公司，批號100897－200601，規格：100mg，質量分數：98%以上）；奧沙利鉑對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號100584－200401）；注射用培美曲賽二鈉（江蘇奧賽康藥業有限公司，批號080901，規格：0.5g／支）；注射用奧沙利鉑（揚州奧賽康藥業有限公司提供，批號20091202，規格：50mg／支）；甲酸、乙腈（色譜純，美國J.T.Baker公司）；去離子水（18.2MQ，實驗室自制）；其他試劑為分析純。

1.3 動物 健康成年Beagle犬，普通級，體質量12±2kg，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供。

2 實驗方法

2.1 色譜和質譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Shim－pack XR－ODS（100 mm×2.0mm，2.2μm）；保護柱：Shim－pack GVPODS（2.0mm×5mm，2.2μm）；流動相為A相（0.02mmol·L－1醋酸銨，pH3.6）和B相（乙腈），采用梯度洗脫方式；柱溫40℃；流速：0.6mL·min－1；進樣量：30μL。

2.1.2 質譜條件 采用電噴霧離子源：離子噴霧電壓為4.6kV；毛細管溫度為450℃；霧化氣壓55psi；輔助氣壓為60psi；氣簾氣壓為30psi。定量分析監測的離子對為：培美曲賽二鈉m／z 536→336，碰撞電壓為35V；奧沙利鉑m／z 435→125；內標順鉑m／z 468→212，碰撞電壓為45V。

2.2 標準儲備液的配制 精確稱取培美曲賽二鈉和奧沙利鉑對照品各10mg，置于10mL量瓶中，加甲醇定容配制成1 000mg·L－1的標準儲備液，4℃條件下保存。精密稱取內標物順鉑對照品5mg，置于10mL量瓶中，加甲醇定容配制成500mg·L－1的順鉑儲備液，4℃條件下保存。精密吸取儲備液適量，用去離子水逐級稀釋配制成質量濃度約為350μg·L－1的內標工作溶液。

2.3 血漿樣品的處理 在1.5mL離心管中分別加入400μL血漿樣品、10mg·L－1順鉑乙腈溶液500μL，渦旋震蕩混勻，以15 000r·min－1離心10min，取上清液，進樣30μL進行分析。

2.4 基質效應 分別按2.3配制含培美曲賽二鈉10，100和600μg·mL－1和奧沙利鉑20，200，1 200μg·mL－1的低、中、高質量濃度血漿質控樣品（QC）各5份，其峰面積作為基質效應中的分子。另用純凈水替代血漿，按上述處理后進樣，其峰面積作為基質效應分母。

2.5 動物體內的藥代動力學實驗

2.5.1 給藥及采血方法 采用自身對照隨機交叉的實驗方法，選擇三制劑三周期的3×3拉丁方設計，即9只Beagle犬隨機分成3組，每組3只。第一周期3組動物分別經靜脈給予注射用培美曲賽二鈉（A）、注射用奧沙利鉑（B）、注射用培美曲賽二鈉和注射用奧沙利鉑（C）；第二周期實驗3組動物分別給予B、C、A；第三周期實驗3組動物分別給予C、A、B。周期間隔為10d，每一周期實驗開始前，受試犬禁食過夜（禁食12h），自由飲水。分別于給藥前及給藥后各時間點采集犬一側前肢靜脈血3mL，置于肝素抗凝管中，5 000r·min－1離心15min，分離血漿，置于－70℃保存備用。采樣時間點：每日晨8時給藥，采血點為實驗周期的初次（第1天）給藥前及給藥后0.15，0.3，0.45，0.8，1，1.2，1.5，2，3，4，6，10，18和24h，末次（第7天）給藥前及給藥后0.15，0.3，0.5，0.8，1，1.2，1.5，2，3，5，7，8，18，24，36和48h。

2.5.2 數據分析 所有實驗數據均以x±s表示。藥動學參數t1／2、CLint和MRT采用DAS3.2.1統計學程序分別進行藥物間、個體間單因素方差分析，藥物單用與合用組的AUC和Cmax采用90%可信區間進行檢驗以判別培美曲賽二鈉與奧沙利鉑聯合用藥是否存在藥動學相互作用，tmax用配對Wilcoxon檢驗。分別對單劑量和多劑量的單用給藥的藥動學各參數與合用給藥的藥動學參數進行比較。

3 結果

3.1 實驗動物血漿中培美曲賽二鈉和奧沙利鉑的LC－MS／MS方法學考察 以藥物質量濃度為橫坐標（X）、藥物和內標的峰面積比值（Y）為縱坐標作線性回歸，采用加權最小二乘法求得：培美曲賽二鈉線性回歸方程：Y＝0.025 4 X＋0.063（R2＝0.998 1），定量下限為7μg·L－1，RSD為0.27%；奧沙利鉑標準曲線：Y＝6.98 X＋2.258（R2＝0.999 5），定量下限為80μg·L－1，RSD為0.89%。培美曲賽二鈉、奧沙利鉑分別在7～150μg·L－1和80～900μg·L－1范圍內線性關系良好，培美曲賽二鈉和奧沙利鉑的日內與日間精密度良好，RSD均＜15%（n＝5）；培美曲賽二鈉、奧沙利鉑提取回收率分別為92.5%～98.3%和98.5%～99.6%；含藥血漿室溫放置12h、反復凍融3次，并在－70℃下放置7，14和30d穩定。培美曲賽二鈉低、中、高質量濃度基質效應（ME）分別為105.6%，94.2%和82.3%；奧沙利鉑低、中、高質量濃度ME為110.2%，97.3%和86.2%。

3.2 實驗動物單次口服培美曲賽二鈉和奧沙利鉑藥代動力學相互作用 采用t檢驗對藥動學參數Cmax、AUC0～t等參數進行比較，tmax進行非參數檢驗（Wilcoxon符號秩法），以判別培美曲賽二鈉和奧沙利鉑聯合用藥是否存在藥動學相互作用。統計學分析結果顯示，藥物單用組與合用組的tmax經非參數檢驗（Wilcoxon檢驗）結果P＞0.05，差異無統計學意義。Cmax、AUC0～t經對數轉換后進行t檢驗，差異沒有統計學意義（見表1），結果判斷培美曲賽二鈉和奧沙利鉑聯合用藥不存在顯著的藥動學相互作用。給予Beagle犬培美曲賽二鈉和奧沙利鉑后的主要藥動學參數和平均血藥質量濃度－時間曲線分別見表2和圖1。與藥物單用相比，聯合培美曲賽二鈉和奧沙利鉑后，藥物間和個體間各主要藥動學參數t1／2、CLint、MRT差異均無統計學意義（P＞0.05）；Cmax、AUC0～t在90%可信區間的生物等效性統計結果合格。

表1 單用培美曲塞二鈉和奧沙利鉑在Beagle犬體內的生物等效性和生物利用度Tab.1 The bioequivalence and bioavailability of pemetrexed disodium and oxaliplatin in dogs after administation of a single dose （n＝9）

表2 單用培美曲塞二鈉和奧沙利鉑在Beagle犬體內的藥代動力學參數Tab.2 The pharmacokinetic parameters of pemetrexed disodium and oxaliplatin in dogs after administation of a single dose

圖1 單用培美曲塞二鈉（A）和奧沙利鉑（B）在Beagle犬體內平均血漿質量濃度與給藥后的時間曲線Fig.1 Mean plasma concentration vs time curves of pemetrexed disodium（A）and oxaliplatin（B）in Beagle dogs after administration of a single dose ±s，n＝9）

3.3 實驗動物多劑量給予培美曲賽二鈉和奧沙利鉑藥代動力學相互作用 采用t檢驗對藥動學參數Cmax、AUC0～t等參數進行比較，tmax進行非參數檢驗（Wilcoxon符號秩法），以判別培美曲賽二鈉和奧沙利鉑聯合用藥是否存在藥動學相互作用。統計學分析結果顯示，藥物單用組與合用組的tmax經非參數檢驗（Wilcoxon檢驗）結果P＞0.05，差異無統計學意義。Cmax、AUCss經對數轉換后進行t檢驗，差異沒有統計學意義（見表3），結果判斷：培美曲賽二鈉和奧沙利鉑聯合用藥不存在顯著的藥動學相互作用。給予Beagle犬培美曲賽二鈉和奧沙利鉑后的主要藥動學參數和平均血藥質量濃度－時間曲線分別見表4和圖2。與藥物單用相比，聯合培美曲賽二鈉和奧沙利鉑后，藥物間和個體間各主要藥動學參數t1／2、CLint、MRT差異均無統計學意義（P＞0.05）；Cmax、AUC0～t在90%可信區間的生物等效性統計結果合格。

表3 合用培美曲塞二鈉和奧沙利鉑在Beagle犬體內的生物等效性和生物利用度Tab.3 The bioequivalence and bioavailability of pemetrexed disodium and oxaliplatin in dogs after administation of multiple dose （±s，n＝9）

表3 合用培美曲塞二鈉和奧沙利鉑在Beagle犬體內的生物等效性和生物利用度Tab.3 The bioequivalence and bioavailability of pemetrexed disodium and oxaliplatin in dogs after administation of multiple dose （±s，n＝9）

項目培美曲塞二鈉AUC0～t Cmax奧沙利鉑AUC0～t Cmax等效區間 80%～125% 70%～143% 80%～125% 70%～143%可信區間 95.3%～103.5%92.3%～140.2%88.6%～115.2%84.5%～126.4%結論 合格 合格 合格 合格

表4 合用培美曲塞二鈉和奧沙利鉑在Beagle犬體內的的藥代動力學參數Tab.4 The pharmacokinetic parameters of pemetrexed disodium and oxaliplatin in dogs after administation of multiple dose

圖2 合用培美曲塞二鈉（A）和奧沙利鉑（B）在Beagle犬體內平均血漿質量濃度與給藥后的時間曲線Fig.2 Mean plasma concentration vs time curves of pemetrexed disodium（A）and oxaliplatin（B）in Beagle dogs after administration of multiple dose ±s，n＝9）

4 討論

藥物聯合使用即多藥合用時，可能出現藥效增強或不良反應減輕等現象；也可能出現藥效減弱或不應有的不良反應，甚至可能發生較嚴重的藥物合用毒性反應。因此，必須重視藥物配伍使用后的相互作用問題，在研發藥物和藥物臨床使用前期，就應該清楚該藥物與其他藥物合用時可能產生的藥物相互作用，以避免臨床用藥的不安全性［13］。

本研究對培美曲賽二鈉和奧沙利鉑藥動學相互作用進行了探討，所用的測定方法專屬性良好，精密度、準確度、提取回收率等符合測定要求。預處理方法根據已有文獻和實驗結果進行調整。對測定內標進行了考察，最終選擇順鉑作為測定的內標。

研究結果顯示，注射用培美曲賽二鈉和奧沙利鉑分別單獨給藥和聯合給藥后，注射用培美曲賽二鈉和奧沙利鉑在實驗犬體內的主要藥動學參數Cmax、AUC0－t和tmax經統計學分析，差異無統計學意義，這表明注射用培美曲賽二鈉和奧沙利鉑合用，2種藥物在實驗犬體內不存在顯著的藥動學相互作用，其合用的吸收速率、吸收程度及消除速率與單獨給藥基本一致，提示在注射用培美曲賽二鈉和奧沙利鉑藥物中，2種成分對彼此在實驗犬體內的吸收、分布和消除不產生顯著影響。本實驗研究了注射用培美曲賽二鈉和奧沙利鉑聯合用藥在實驗犬體內的藥動學相互作用，為臨床合理用藥提供了參考依據。

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Pharmacokinetic interaction of pemetrexed disodium and oxaliplatin in Beagle dogs

ZHENG Xin，LI Qian，YOU Haisheng，YU Jia（the First Affiliated Hospital of Xi′an Jiaotong University，Xi′an 710061，China）

Objective The purpose of this study is to investigate the pharmacokinetic interaction of pemetrexed disodium and oxaliplatin in healthy adult Beagle dogs following single and multiple oral dose administration.Methods Nine Beagle dogs were divided into pemetrexed disodium group，oxaliplatin group，pemetrexed disodium and oxaliplatin group.Blood samples were collected at intervals after each intervenous administration.Then the plasma concentration was determined by LC－MS／MS，and the pharmacokinetic parameters were calculated by DAS3.2.1statistical moment method.AUC and Cmaxwas calculated by using 90%confidence interval method of bioequivalence and bioavailability.Results Compared with the separate administration，the main pharmacokinetic parameters（t1／2，CLintand MRT）had no significant difference（P＞0.05）；The 90%confidence intervals for bioequivalence statistics of drugs alone and in combination group were qualified，and tmaxtest showed no significant difference（P＞0.05）.Conclusion Pemetrexed disodium and oxaliplatin have no pharmacokinetic interaction in Beagle dogs.

pemetrexed disodium；oxaliplatin；pharmacokinetic interactions

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.02.020

R945

A

1004－2407（2015）02－0169－04

2014－07－28）