疏肝健脾方醇水雙提物對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠的保護(hù)作用

秦秀娟， 高家榮， 姜 輝， 陳金鋒， 王 婷， 張 婷

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230031）

疏肝健脾方醇水雙提物對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠的保護(hù)作用

秦秀娟1， 高家榮2*， 姜 輝2， 陳金鋒1， 王 婷1， 張 婷1

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230031）

目的探討疏肝健脾方 （柴胡、黃芪、白芍、白術(shù)等）醇水雙提物對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化大鼠的保護(hù)作用。方法除正常組外，其余各組采用皮下注射50%四氯化碳，每周2次，持續(xù)12周，復(fù)制肝纖維化大鼠模型。造模后第7周，分別灌胃給予疏肝健脾方醇水雙提物 （1.5、3.0、6.0 g/kg）劑量組和陽(yáng)性藥秋水仙堿組，每天1次，連續(xù)6周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，Masson染色觀察肝臟組織膠原沉積；放射免疫法檢測(cè)血清中透明質(zhì)酸 （hya1uronic acid，HA）、層黏蛋白（1aminin，LN）、Ⅲ型前膠原肽（proco11agen-Ⅲ-peptide，PⅢNP）、Ⅳ型膠原（co11agen typeⅣ，Ⅳ-C）的水平；免疫組化染色檢測(cè)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth musc1e actin，α-SMA）、Ⅰ型膠原（co11agen typeⅠ，COL-Ⅰ）的表達(dá)。結(jié)果與模型組比較，疏肝健脾方醇水雙提物不僅可減輕膠原纖維的沉積，改善肝纖維化損傷程度，還可顯著降低血清中透明質(zhì)酸、層粘蛋白、Ⅲ型前膠原肽、Ⅳ型膠原的水平，抑制肝組織中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)。結(jié)論疏肝健脾方醇水雙提物對(duì)化學(xué)性肝纖維化大鼠具有很好的抗肝纖維化作用，其可能機(jī)制與抑制肝星狀細(xì)胞活化、減少細(xì)胞外基質(zhì)的合成有關(guān)。

疏肝健脾方；肝纖維化；四氯化碳；透明質(zhì)酸；層粘蛋白；Ⅲ型前膠原肽；Ⅳ型膠原；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白；Ⅰ型膠原；保護(hù)作用

肝纖維化以細(xì)胞外基質(zhì)在肝內(nèi)過(guò)度沉積［1］，導(dǎo)致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，肝臟結(jié)構(gòu)破壞和肝功能異常為特征，是慢性肝病發(fā)展成肝硬化的必經(jīng)階段［2］。疏肝健脾方 （又名肝樂(lè)顆粒）是我院特色醫(yī)院制劑，用于治療急慢性肝炎、肝纖維化，療效確切［3-4］。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上［5］，探討疏肝健脾方醇水雙提物對(duì)化學(xué)性肝纖維化大鼠的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物 柴胡 （內(nèi)蒙）、黃芪 （內(nèi)蒙）、白芍 （安徽）、白術(shù) （浙江）、茯苓 （安徽）、薏苡仁 （貴州）、豬苓 （山西）、澤蘭 （安徽）、板藍(lán)根 （甘肅）、甘草 （新疆）源于安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院草藥房，經(jīng)孟楣主任中藥師鑒定為正品。疏肝健脾方醇水雙提物工藝［6］為精確稱(chēng)取上述藥材，第一次加8倍量80%乙醇煎煮1 h，過(guò)濾煎液；第二次加8倍量水煎煮1 h，過(guò)濾煎液，合并濾液，濃縮成浸膏；秋水仙堿 （西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)20120125）。

1.2 動(dòng)物 雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)于安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK（皖）2011-002。

1.3 試劑 四氯化碳 （CC14）（天津市富宇精田化工有限公司）；兔抗大鼠Ⅰ型膠原蛋白多克隆抗體、兔抗大鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白 （α-SMA）多克隆抗體 （美國(guó)Abcam公司）；透明質(zhì)酸 （HA）、Ⅲ型前膠原氨端肽 （PⅢNP）、層粘連蛋白 （LN）、Ⅳ型膠原 （Ⅳ-C）試劑盒 （北京華英生物技術(shù)研究所）。

1.4 儀器 KDC-16H型高速離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司）；BS200S型電子天平 （北京賽多利斯天平有限公司）；Mu1tiskan1510型全波段酶標(biāo)儀（美國(guó)熱電公司）；Moticam2306型顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）。

2 方法

2.1 模型制備與給藥 SD大鼠分為正常組、模型組、疏肝健脾方醇水雙提物（1.5 g/kg，3.0 g/kg，6.0 g/kg）組和陽(yáng)性藥秋水仙堿 （1.0×10-4g/kg）組，每組10只。每周一、周四于大鼠背部皮下注射50%CC14（1.0 m L/kg），連續(xù)12周，正常組注射等量花生油。造模后第7周，灌胃給予不同劑量疏肝健脾方醇水雙提物、秋水仙堿，每天1次，連續(xù)6周，正常組、模型組給予等體積生理鹽水。

2.2 肝組織肉眼觀察 麻醉大鼠，分離肝臟，肉眼觀察其色澤、質(zhì)地、表面光滑度等。

2.3 肝臟組織膠原沉積的檢查 摘取相同部位肝臟組織，于10%甲醛溶液中固定，采用Masson染色，光鏡下觀察膠原在肝臟沉積情況。

2.4 大鼠血清中HA、LN、PⅢNP、IV-C水平的檢測(cè) 放射免疫法檢測(cè)血清中HA、LN、PⅢNP、IV-C的水平。

2.5 SP免疫組化測(cè)定肝組織中α-SMA、COL-Ⅰ的表達(dá) 采用SP法免疫組織化學(xué)染色，具體按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，并進(jìn)行半定量評(píng)分。具體方法如下［7］，以陽(yáng)性細(xì)胞百分比結(jié)合陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)弱兩個(gè)方面評(píng)分，a為陽(yáng)性細(xì)胞百分比 （0為無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞，1為陽(yáng)性細(xì)胞占1%～10%，2為11%～50%，3為51%～80%，4為81%～100%）；b為陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)弱 （0為陰性，1為弱陽(yáng)性，2為中度陽(yáng)性，3為強(qiáng)陽(yáng)性），a，b兩項(xiàng)乘積即為該例組織的免疫組化評(píng)分（IHS，immuno-histochemica1 score）。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)輸入SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以表示，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，以P＜0.05代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 疏肝健脾方醇水雙提物對(duì)肝纖維化大鼠肝組織肉眼觀察的影響 肉眼觀察各組肝臟形態(tài)學(xué)的變化，正常組大鼠的肝臟呈鮮紅色，表面光滑，質(zhì)地柔軟，邊緣銳利；模型組大鼠的肝臟呈灰白色，質(zhì)地變硬，易碎，表面呈顆粒狀凸起且無(wú)光澤，邊緣鈍圓；疏肝健脾方醇水雙提物各劑量組和秋水仙堿組大鼠的肝臟顏色、質(zhì)地、表面光滑度較模型組均有所好轉(zhuǎn)。

3.2 疏肝健脾方醇水雙提物對(duì)肝纖維化大鼠肝臟病理組織學(xué)的影響 Masson染色顯示，膠原纖維以藍(lán)染為主。正常組大鼠肝細(xì)胞核大、圓，匯管區(qū)及小葉間隔有少量膠原纖維沉積，且著色淺、細(xì)小；模型組大鼠肝細(xì)胞核溶解并消失，大量膠原纖維增生，呈粗大、彌漫型分布，且著色深，并將肝小葉分割成大小不等的假小葉；給予疏肝健脾方醇水雙提物和秋水仙堿灌胃后，各給藥組膠原纖維沉積均減少，且著色變淺，假小葉形成減少，肝纖維化程度均有所改善，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 疏肝健脾方醇水雙提物對(duì)化學(xué)性肝纖維化大鼠肝病理組織學(xué)的影響 （×200）Fig.1 Effects of ethanolic and aqueous extractsof Shugan Jianpi Formula on the pathological changes of rat liver fibrosis（×200）

3.3 疏肝健脾方醇水雙提物對(duì)化學(xué)性肝纖維化大鼠肝纖四項(xiàng)的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清中肝纖四項(xiàng)的水平均顯著升高；與模型組比較，疏肝健脾方醇水雙提物中、高劑量組可顯著降低HA、LN、PⅢNP和Ⅳ-C的水平，低劑量組雖能降低大鼠血清中HA、LN、PⅢNP和Ⅳ-C的水平，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見(jiàn)表1。

3.4 疏肝健脾方醇水雙提物對(duì)肝纖維化大鼠肝臟中α-SMA、COL-Ⅰ表達(dá)的影響 α-SMA、COL-Ⅰ免疫組化染色以棕黃色或深棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)，α-SMA廣泛分布于匯管區(qū)、纖維間隔內(nèi)；COL-Ⅰ主要表達(dá)于中央靜脈、匯管區(qū)內(nèi)。光鏡下可見(jiàn)，α-SMA、COL-Ⅰ在正常組呈低表達(dá)，模型組中α-SMA、COL-Ⅰ的表達(dá)顯著升高，疏肝健脾方醇水雙提物中、高劑量組α-SAM、COL-Ⅰ的表達(dá)顯著降低，低劑量組雖能一定程度抑制α-SMA、COL-Ⅰ的表達(dá)，但與模型組相比，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見(jiàn)圖2～3，IHS評(píng)分見(jiàn)表2。

表1 疏肝健脾方醇水雙提物對(duì)HA、LN、PⅢNP和Ⅳ-C的影響（，n=10）Tab.1 Effects of ethanolic and aqueous extracts of Shugan Jianpi Formula on HA，LN，PⅢNP andⅣ-C of rat liver fibrosis（，n=10）

表1 疏肝健脾方醇水雙提物對(duì)HA、LN、PⅢNP和Ⅳ-C的影響（，n=10）Tab.1 Effects of ethanolic and aqueous extracts of Shugan Jianpi Formula on HA，LN，PⅢNP andⅣ-C of rat liver fibrosis（，n=10）

注：與正常對(duì)照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01（下同）

組別 劑量/（g·kg-1） HA/（μg·L-1） LN/（μg·L-1） PⅢNP/（μg·L-1） Ⅳ-C/（μg·L-1）106.94±21.18 58.39±11.79 94.36±12.37 24.70±6.30模型組 - 209.99±28.78## 103.39±19.68## 148.40±27.19## 47.80±10.66##疏肝健脾方醇水雙提物 1.5 199.62±29.82 94.30±13.82 128.19±26.80 41.98±11.03疏肝健脾方醇水雙提物 3.0 184.93±21.68* 89.96±16.05* 121.68±21.97* 39.60±7.23*疏肝健脾方醇水雙提物 6.0 175.97±27.04** 85.28±13.64** 111.91±18.87** 36.81±6.69**秋水仙堿組 1.0×10-4 177.75±28.68** 88.87±14.38* 120.36±25.62** 38.69±9.69正常組-**

圖2 疏肝健脾方醇水雙提物對(duì)肝纖維化大鼠肝臟中α-SMA改變的影響 （×200）Fig.2 Effects of ethanolic and aqueous extracts of Shugan Jianpi Formula on theα-SMA of rat liver fibrosis（×200）

圖3 疏肝健脾方醇水雙提物對(duì)肝纖維化大鼠肝臟中COL-Ⅰ改變的影響 （×200）Fig.3 Effects of ethanolic and aqueous extracts of Shugan Jianpi Formula on COL-Ⅰin rat liver fibrosis（×200）

表2 疏肝健脾方醇水雙提物對(duì)α-SMA、COL-Ⅰ表達(dá)的IHS評(píng)分影響 （，n=8）Tab.2 E ffects of ethanolic and aqueous extracts of Shugan Jianpi Formula on IHS score ofα-SMA、COL-Ⅰexpression in rat liver fibrosis（，n=8）

表2 疏肝健脾方醇水雙提物對(duì)α-SMA、COL-Ⅰ表達(dá)的IHS評(píng)分影響 （，n=8）Tab.2 E ffects of ethanolic and aqueous extracts of Shugan Jianpi Formula on IHS score ofα-SMA、COL-Ⅰexpression in rat liver fibrosis（，n=8）

組別 劑量/（g·kg-1）α-SMA（IHS）COL-Ⅰ（IHS）正常組- 2.75±1.16 2.25±1.28模型組 - 8.38±1.06##7.38±1.85##疏肝健脾方醇水雙提物組 1.5 6.88±1.96 6.38±1.85疏肝健脾方醇水雙提物組 3.0 4.88±2.03**5.38±1.68*疏肝健脾方醇水雙提物組 6.0 4.25±1.16**4.75±1.75**秋水仙堿組 1.0×10-4 5.5±2.39**5.25±2.19*

4 討論

肝纖維化是不同損傷因素引起的肝臟炎癥或損傷后組織修復(fù)過(guò)程中的代償反應(yīng)，肝星狀細(xì)胞（hepatic ste11ate ce11）活化為其核心事件，是一切慢性肝病的共同病理學(xué)基礎(chǔ)，已成為嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的世界性問(wèn)題［8-10］。

疏肝健脾方以 “見(jiàn)肝知脾，知肝傳脾，當(dāng)先實(shí)脾”理論制成的特色院內(nèi)制劑［11］，具有疏肝解郁、健脾滲濕、活血化瘀的功效，主治急慢性肝炎，肝炎病毒攜帶者，肝纖維化，肝硬化活動(dòng)期。臨床應(yīng)用十余年，療效確切。本研究發(fā)現(xiàn)，CC14誘導(dǎo)的模型組大鼠肝臟有大量膠原纖維沉積，并將肝小葉分割成大小不等的假小葉，表明肝纖維化模型復(fù)制成功。疏肝健脾方醇水雙提物干預(yù)后，肝組織病理學(xué)損傷程度明顯減輕，提示對(duì)化學(xué)性肝纖維化有很好的保護(hù)作用。

研究發(fā)現(xiàn)，HA、LN、PⅢNP、Ⅳ-C的水平與肝纖維化的程度呈正相關(guān)，是肝纖維化重要的血清學(xué)指標(biāo)［12］。HA由細(xì)胞間質(zhì)合成，血清中HA的含量變化可以敏感的反應(yīng)出肝纖維化的程度；LN是基底膜透明層的結(jié)構(gòu)蛋白，肝纖維化形成時(shí)，HSC分泌大量LN，與Ⅳ-C形成肝竇毛細(xì)血管化，LN隨著肝纖維化的形成而增多，是反映肝纖維化增生的標(biāo)志物［13］；PⅢNP是血液中經(jīng)內(nèi)肽酶水解切下的氨基端，在形態(tài)學(xué)觀察到纖維增生之前，PⅢNP的含量就已經(jīng)升高，因此，PⅢNP能早期特異性地反映肝纖維化的形成［14］。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，與正常組比較，模型組大鼠血清中HA、LN、PⅢNP、Ⅳ-C水平明顯升高；疏肝健脾方醇水雙提物干預(yù)后，可降低HA、LN、PⅢNP、Ⅳ-C的水平。

α-SMA是公認(rèn)的肝星狀細(xì)胞（HSC）活化標(biāo)志物，在正常組織中，α-SMA僅在血管壁平滑肌中表達(dá)；在肝纖維化中，α-SMA可廣泛表達(dá)于匯管區(qū)、纖維間隔和門(mén)靜脈［15］。α-SMA表達(dá)增加，表明HSC活化增加［16］。當(dāng)HSC被激活后，可分泌大量的ECM，ECM主要成分包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型膠原，其中Ⅰ型膠原是肝纖維間隔的重要來(lái)源，Ⅰ型膠原的表達(dá)隨著肝纖維化的發(fā)展而增多［17］。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，模型組大鼠肝臟內(nèi)的α-SMA、COL-Ⅰ表達(dá)升高；疏肝健脾方醇水雙提物灌胃后，可抑制α-SMA、COL-Ⅰ的表達(dá)。

綜上，疏肝健脾方醇水雙提物對(duì)化學(xué)性肝纖維化大鼠具有很好的抗肝纖維化作用，其可能機(jī)制與抑制HSC活化、減少ECM的合成有關(guān)。

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Protective effects of ethanolic and aqueous extract of Shugan Jianpi Formula on CCl4-induced hepatic fibrosis in rats

QIN Xiu-juan1， GAO Jia-rong2*， JIANG Hui2， CHEN Jin-feng1， WANG Ting1， ZHANG Ting1

（1.AnhuiUniversityofChineseMedieine，Hefei230038，China；2.TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiUniversityofChineseMedicine，Grade3Labora-toryofTraditionalChineseMedicinePreparation，StateAdministrationofTCM，Hefei230031，China）

ABSTRACT：AIMTo exp1ore the protective effects of ethano1ic and aqueous extracts of Shugan Jianpi Formu1a（BupleuriRadix，AstragaliRadix，Paeoniae Radix alba，AtractylodismacrocephalaeRhizoma，etc.）on CC14-induced hepatic fibrosis in rats.METHODSRats with 1iver fibrosis weremode1ed by the injection of 50%CC14twice a week for twe1ve weeks except the contro1group.Ethano1ic and aqueous extracts of Shugan Jianpi Formu1a（1.5 g/kg，3.0 g/kg，6.0 g/kg）and co1chicine were used dai1y via 1avage in the 7th week for six weeks.Co11agen fibers depositions of hepatic tissueswere observed by Masson staining.The contents of HA（hya1uronic acid），LN（1aminin），PⅢNP（proco11agen-Ⅲ-peptide）andⅣ-C（co11agen typeⅣ）in serum were tested by the radioimmunoassaymethod.The expressions ofα-SMA（α-smooth musc1e actin），COL-Ⅰ（co11agen typeⅠ）were detected by immunohistochemica1.RESULTSCompared with the mode1 group，ethano1ic and aqueous extracts cou1d not on1y a11eviate the co11agen fibers deposition，significant1y decrease the contents of HA，LN，PⅢNP andⅣ-C in serum，but a1so inhibit the expressions ofα-SMA，COL-Ⅰin ratswith 1iver fibrosis.CONCLUSIONEthano1ic and aqueous extracts of Shugan Jianpi Formu1a havemarked effects on hepatic fibrosis and itsmechanism is possib1y re1ated to the inhibition of hepatic ste11ate ce11s and the decrease in synthesis of extrace11u1armatrix.

Shugan Jianpi Formu1a；hepatic fibrosis；CC14；hya1uronic acid（HA）；1aminin（LN）；proco1-1agen-Ⅲ-peptide（PⅢNP）；co11agen typeⅣ（Ⅳ-C）；α-smooth musc1e actin（α-SMA）；co11agen typeⅠ（COL-Ⅰ）；protective effect

R285.5

A

1001-1528（2015）08-1646-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.003

2014-12-02

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目 （81102874）

秦秀娟 （1990—），女，碩士，研究方向?yàn)橹兴幩幚怼e1：（0551）62838553，E-mai1：1036951872@qq.com

*通信作者：高家榮（1964—），男，主任藥師，研究方向?yàn)橹兴幹苿╅_(kāi)發(fā)。Te1：（0551）62838556，E-mai1：zyfygjr2006@163.com