長春胺大鼠在體腸吸收特性

相 琳， 曾 佳， 黃 婷*， 魏 莉

（1.大連大學，遼寧大連，116622；2.上海市計劃生育科學研究所，國家人口和計劃生育委員會計劃生育藥具重點實驗室，上海生殖健康藥具工程技術研究中心，上海200032；3.上海中醫藥大學，上海201203）

長春胺大鼠在體腸吸收特性

相 琳1， 曾 佳2， 黃 婷2*， 魏 莉3

（1.大連大學，遼寧大連，116622；2.上海市計劃生育科學研究所，國家人口和計劃生育委員會計劃生育藥具重點實驗室，上海生殖健康藥具工程技術研究中心，上海200032；3.上海中醫藥大學，上海201203）

目的研究長春胺在大鼠腸道的吸收特性。方法以酚紅為標示物，酒石酸調節大鼠在體腸灌流液pH至4.5，采用HPLC-UV測定長春胺在大鼠各腸段的質量濃度變化。結果長春胺在大鼠十二指腸、空腸、回腸、結腸中2.5 h內累積吸收百分率 （P a）分別為 （54.66±2.37）%、（54.21±2.48）%、（53.04±4.83）%、（53.78±4.86）%，吸收速率常數 （Ka）依次為 （0.248±0.020）/h、（0.183±0.058）/h、（0.231±0.046）/h、（0.200±0.069）/h。P a與Ka在各腸段均無顯著性差異，說明無特殊吸收部位。結論加入酒石酸調節長春胺pH可促進其腸黏膜通透性，從而提高其口服生物利用度。

長春胺；pH依賴性；酒石酸；在體腸吸收；HPLC-UV

長春胺（vincamine）是從夾竹桃科植物小蔓長春花（Vinca minor L.）中提取的吲哚類生物堿［1］，具有良好的改善大腦血液循環功能，擴張腦血管和毛細血管，而不影響心臟血流量和全身血循環，可用于由腦供血不足而引起的多種疾病，以及伴發的各種精神異常和衰老期行為障礙等［2］。長春胺的半衰期僅為2 h［3］，如設計成普通制劑則每天需要頻繁服藥，因此臨床上大多以其口服緩控釋制劑為主，如商品名為奧勃蘭的長春胺緩釋膠囊等。另一方面，長春胺為典型的 pH依賴性藥物［4］，即在酸性條件下可溶，中性及堿性環境難溶，溶解度隨pH升高呈逐步下降趨勢，該特點將導致長春胺口服制劑吸收差，生物利用度低。目前國內尚無長春胺腸道吸收研究的相關報道，本實驗采用在體腸循環灌流模型法［5-10］，以酒石酸調節灌流液pH使長春胺溶解于其中，考察其在大鼠不同腸段的吸收特性，為研究開發長春胺口服制劑提供生物藥劑學基礎。

1 材料

1.1 儀器 HL-2恒流泵（上海滬西分析儀器有限公司）；HHS-2指針式電熱恒溫水浴鍋 （上海錦凱科學儀器有限公司）；Agi1ent8453紫外分光光度計（美國安捷倫公司）；Agi1ent 1200 series高效液相色譜儀 （美國安捷倫公司）。

1.2 藥物與試劑 長春胺原料藥（批號CV/ VC070515，純度100.3%，西班牙考維克斯公司）；苯酚紅 （AR F20070906，國藥集團化學試劑有限公司）；烏拉坦 （CP T20061101，國藥集團化學試劑有限公司）；Krebs-Ringer's試液（自制）；乙腈（色譜純，德國默克公司）；酒石酸 （AT 50/80，法國羅蓋特公司）；其他試劑均為分析純 （國藥集團化學試劑有限公司）。

1.3 動物 雄性Wister大鼠，20只，體質量（200±20）g，上海中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號SYXK（滬）2008-0016。

2 方法與結果

2.1 腸循環液中長春胺的HPLC測定方法

2.1.1 Krebs-Ringer緩沖液與空白腸循環液的制備

稱取NaC17.8 g，KC10.35 g，CaC120.37 g，NaHCO31.37 g，NaH2PO40.32 g，MgC120.02 g和葡萄糖1.4 g，加水溶解并稀釋至1 L，即得Krebs-Ringer緩沖液。Krebs-Ringer緩沖液按“2.3.2”項下方法，經大鼠在體腸灌流后即得空白腸循環液。

2.1.2 色譜條件 Kromasi1C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5μm）；流動相為0.02 mo1/L磷酸二氫鉀溶液-乙腈 （70∶30），用磷酸調節pH至2.3；柱溫25℃；體積流量1.0 mL/min；二極管陣列檢測器，檢測波長268 nm；進樣量為10μL。在上述色譜條件下，空白腸循環液對長春胺的測定無干擾，色譜圖見圖1。

圖1 長春胺腸灌流液HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of vincam ine in intestinal perfusion

2.1.3 標準曲線的制備 取長春胺原料藥約100 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加入經酒石酸調節pH至4.5的空白腸循環液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質量濃度為1.00 mg/mL的長春胺貯備液。精密量取該溶液以pH 4.5的空白腸循環液分別稀釋配成質量濃度為10、20、40、60、80、100μg/mL的系列標準溶液，按 “2.1.2”項下方法測定，以峰面積 （A）為縱坐標，質量濃度（C）為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程為A= 13.657C-7.432（r=0.999 9），表明長春胺在10～100μg/m L質量濃度范圍內線性關系良好。

2.1.4 回收率試驗 精密量取長春胺貯備液分別配成10、40、80μg/mL 3個質量濃度的樣品溶液，按 “2.1.2”項下方法測定，計算樣品回收率分別為 （103.68±0.99）%、（99.22±0.77）%、（99.89±0.46）%，符合測定要求。

2.1.5 精密度試驗 取10、40、80μg/mL 3個質量濃度樣品溶液，按 “2.1.2”項下方法測定，分別在一天內測定5次，計算日內精密度，及每天測定1次共測定3 d，計算日間精密度。結果低、中、高3個質量濃度樣品日內精密度的RSD分別為0.28%、0.56%、0.11%；日間精密度的RSD分別為1.29%、0.95%、1.16%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復性試驗 配制質量濃度為40μg/mL的樣品溶液共5份，按 “2.1.2”項下方法測定，結果RSD為1.37%，表明樣品重復性良好。

2.1.7 穩定性試驗 取10、40、80μg/mL 3個質量濃度的樣品溶液，于37℃恒溫水浴中放置2.5 h，分別于0、2.5 h取樣，按 “2.1.2”項下方法測定，2.5 h后樣品含量分別為 （99.32± 0.57）%、（99.25±1.85）%、（99.95±0.11）%，表明長春胺在pH 4.5的空白腸循環液中2.5 h內穩定性良好。

2.2 腸循環液中酚紅的UV測定方法 用Krebs-Ringer緩沖液配制質量濃度分別為10、15、20、30、40、50μg/mL的系列酚紅溶液，各精密吸取酚紅溶液0.5 m L，加入0.2 mo1/L的氫氧化鈉溶液5 m L，于559 nm處測定吸光度 （A），以A為縱坐標，質量濃度 （C）為橫坐標，得回歸方程A= 16.482C+0.011 8（r=0.999 9），線性范圍為10～50μg/mL。取質量濃度分別為10、20、50 μg/mL的酚紅溶液置于37℃恒溫水浴中放置2.5 h后，測定吸光度，結果酚紅濃度分別為0 h的（100.76±1.18）%、（101.88±0.61）%、（100.59± 1.02）%，表明酚紅溶液在2.5 h內穩定。

2.3 大鼠在體腸吸收特性研究

2.3.1 供試液的制備 取酚紅約100 mg，精密稱定，置于100mL量瓶中，以Krebs-Ringer緩沖液溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質量濃度為1.00 mg/mL的酚紅標準溶液。分別精密吸取該標準溶液2.0 mL和質量濃度為1.00 mg/mL長春胺貯備液4.0 mL至100 mL量瓶，用pH4.5的Krebs-Ringer緩沖液稀釋至刻度，搖勻，制得長春胺質量濃度為40μg/mL且酚紅質量濃度為20μg/mL的供試液。

2.3.2 不同腸段的藥物吸收 取雄性Wister大鼠20只，按不同腸段分為4組，每組5只。試驗前禁食18 h，稱定質量后，用20%烏拉坦溶液以10 mL/kg大鼠的劑量腹腔注射麻醉，背位固定于手術板上，以紅外燈照射保持37℃體溫，沿腹中線切開腹部約3 cm。選擇所需要考察的腸段：十二指腸自幽門1 cm處開始，空腸段離幽門15 cm開始，回腸段為距離盲腸20 cm處開始，結腸段為緊鄰盲腸端至直腸，各段均取10 cm左右。在兩端剪切后插管，結扎，先用37℃生理鹽水將腸管充分洗滌后，再以空氣排出生理鹽水，用供試液以 2.0 m L/min的體積流量回流，分別于回流0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5 h取樣5 mL，同時補加質量濃度為20μg/mL的酚紅供試液5 m L。樣品經0.45μm超濾膜濾過，取續濾液按 “2.1.2”項下色譜條件測定長春胺，同時取續濾液0.5 mL按“2.2”項下方法測定酚紅。根據酚紅質量濃度的變化矯正由于循環液體積的改變造成的藥物質量濃度差。

長春胺在大鼠各腸段的吸收百分率 （P a）與吸收速率常數 （Ka）見表1，計算公式如下：P a= 1-（Cout/Cin）×（Vout/Vin）；Ka=（P a×Qin）/ V。其中，Cin和Cout分別為腸灌入液、腸流出液中藥物的質量濃度 （μg/mL）；Vin和Vout分別為灌入和流出收集的灌流液體積 （m L）；Qin為腸道入口灌流液的體積流量（m L/min），V為灌流腸段體積（mL，V=πR2L）；L灌流腸段長度 （cm）。長春胺不溶于普通的Krebs-Ringer緩沖液，加入酒石酸調節pH至4.5后，長春胺可溶解。溶解狀態的長春胺在大鼠十二指腸、空腸、回腸、結腸的吸收百分率均在50%以上 （見表1）；采用SPSS 9.0軟件對不同小腸吸收部位進行方差分析可知 （見表2和表3），P a與Ka均無顯著性差異，說明溶解狀態下，長春胺在腸道內吸收較好，且無特殊吸收部位，提示在長春胺口服制劑設計過程中，應采用適當的制劑手段如加入pH調節劑來促進藥物溶解，以提高其口服生物利用度。

表1 長春胺在不同腸段中的吸收百分率和吸收速率常數Tab.1 Percent absorption and absorption rate constant of vincam ine in different intestinal segments

表2 長春胺在不同腸段的吸收百分率方差分析Tab.2 Percent absorption variance analysis of vincam ine in differen t intestinal segmen ts

表3 長春胺在不同腸段的吸收速率常數方差分析Tab.3 Absorption rate constant variance analysis of vincam ine in different intestinal segments

3 討論

藥物在胃腸道吸收特性的研究是制劑處方前研究的重要部分，根據藥物的吸收特征設計合理劑型，可以延長藥物在吸收部位的滯留時間，從而提高其口服生物利用度。小腸是藥物消化吸收的主要部位，研究藥物在腸道部位的吸收特征對于指導制劑的處方設計，尤其是緩控釋制劑具有十分重要的意義。目前，研究藥物腸道吸收的試驗方法可分為體外試驗法、在體試驗法和體內試驗法。其中，在體腸灌流法保證了試驗時各種體液的供應，可保持腸道環境較完整的生理特征，以提高試驗的生物活性，在體吸收特點與人體吸收的相關性也已有試驗證實，因此本研究采用大鼠在體腸灌流法對長春胺在腸道的吸收特性進行了初步研究。

口服固體制劑在體內需經崩解、分散、溶出的過程，才能被生物膜吸收，其吸收速度主要受藥物的溶出與跨膜轉運過程的限制。當藥物溶解或溶出速率足夠快時，跨膜轉運是藥物吸收的限速過程；但當藥物的溶解或溶出速率較慢時，溶解或溶出則成為藥物吸收的限速過程。藥物進入人體后需經過食道、胃以及整個腸段，在此期間藥物的外環境pH變化較大 （各腸段的 pH分別為：十二指腸4.0～5.0、空腸5.0～6.0、回腸6.0～8.0、結腸7.0～8.0），如果藥物溶解受環境pH影響，則其溶出會不穩定，從而導致藥物無法透過腸道生物膜而被人體吸收。前期平衡溶解度試驗表明，長春胺在0.1mo1/LHC1中溶解度為29.64 mg/mL，在pH 1.5 PBS中溶解度為10.31 mg/mL，在蒸餾水中溶解度為0.017 3 mg/m L，在pH6.8 PBS和pH 7.8 PBS中溶解度分別為0.042 mg/mL和0.009 6 mg/mL，以上結果提示長春胺為pH依賴性藥物，隨pH升高其溶解度呈下降趨勢，這意味著環境因素對藥物的釋放、溶解存在很大制約。腸吸收預試驗結果顯示，不調節溶液pH根本無法檢測到腸循環液中的長春胺，因此推斷這是由于長春胺在堿性環境下不溶的緣故（Krebs-Ringer緩沖液的pH約為7.4，長春胺無法溶解于該pH環境），這為其大鼠在體腸吸收特性的研究帶來一定困難。本實驗研究結果表明，長春胺具有腸黏膜通透性，只要突破溶解這一限速環節，其在腸道內則具有較好的吸收能力 （溶解狀態下的長春胺在整個腸段的吸收均在50%以上），提示在其制劑設計過程中，應考慮采取適當的措施如加入酒石酸調節處方微環境pH［11-14］等方法來增加藥物溶解度，從而促進其口服制劑的體內吸收。

［1］鄭璐俠，邵 泓.高效液相色譜電化學法測定長春胺的有關物質表長春胺［J］藥物分析雜志，2009，29（1）：118-120.

［2］侯恩太，李多偉.小蔓長春花中長春胺藥學研究進展［J］.西北藥學雜志，2010，25（4）：314-316.

［3］Juan Y P，Tsai T H.Measurement and pharmacokinetics of vincamine in rat b1ood and brain using microdia1ysis［J］.J Chromatogr A，2005，1088（1-2）：146-151.

［4］Yang Y，Lou K，Gong W.Simu1taneous estimation of vinpocetine and itsmetabo1ite，apovincaminic acid，in beag1e p1asma by LC-MS-MS［J］.Chromatographia，2011，73（7-8）：775-779.

［5］孫啟文，陳 軍，陳明磊，等.高車前苷油水分配系數的測定及大鼠在體腸吸收動力學研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18（24）：193-197.

［6］何明珍，梁起棟，歐陽輝，等.α-常春藤皂苷大鼠在體腸吸收特性研究［J］.中草藥，2014，45（6）：807-812.

［7］李俊松，楊欣文，彭穩穩，等.蓮子心生物堿類成分的大鼠在體單向灌流腸吸收［J］.中國藥學雜志，2014，49（6）：490-495.

［8］陳金佩，汪珊珊，汪電雷，等.新藤黃酸大鼠在體腸吸收動力學研究［J］.中國臨床藥理學與治療學，2014，19（2）：166-170.

［9］黃 勇，唐 麗，劉 躍，等.野黃芩素在體腸吸收動力學研究［J］.中國新藥雜志，2014，23（4）：457-461.

［10］朱玲玲，李 娟，王廣基.地西泮的大鼠在體腸吸收機理研究［J］.中國藥科大學學報，2006，37（6）：507-511.

［11］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版二部［S］北京：中國醫藥科技出版社，2010.

［12］Taniguchi C，Kawabata Y，Wada K，et al.Microenvironmenta1pH-modification to improve disso1ution behavior and ora1absorption for drugs with pH-depent so1ubi1ity［J］.Expert Opin Drug Deliv，2014，4（11）：505-516.

［13］Korber M，Ciper M，Hoffart V，et al.Enteric po1ymers as acidifiers for the pH-independent sustained de1ivery of a weak1y basic drug sa1t from coated pe11ets［J］.Eur JPharm Biopharm，2011，78（3）：447-454.

［14］Wu1ff R，Leopo1d C S.Coatings from b1ends of Eudragit RL and L55：A nove1approach in pH-contro11ed drug re1ease［J］. Int JPharm，2014，476（1-2）：78-87.

Characteristics of intestinal vincam ine absorption in rats in vivo

XIANG Lin1， ZENG Jia2， HUANG Ting2*， WEILi3

（1.Dalian University，Dalian 116622，China；2.Shanghai Instituteof Planned Parenthood Research，Key Laboratory of Contraceptives and Devices Research，Shanghai Engineer and Technology Research Center of Reproductive Health Drug and Devices，Shanghai200032，China；3.ShanghaiUniversity of Traditional Chinese Medicine，Shanghai201203，China）

ABSTRACT：AIMTo investigate the intestina1absorption of vincamine in rats for the design of vincamine ora1 formu1ations.METHODSWith pheno1 red as the indicator，and tartaric acid as the pH-va1ue（pH 4.5）adjustor for the perfusion so1ution，in vivo intestina1 perfusion mode1was thus formed.And HPLC-UV was app1ied to measuring the vincamine concentrations in different intestina1segments.RESULTSPercent absorption（P a）of vincamine within 2.5 h in duodenum，jejunum，i1eum and co1on were（54.66±2.37）%，（54.21±2.48）%，（53.04±4.83）%，（53.78±4.86）%，with the absorption rate constants（Ka）being（0.248±0.020）/h，（0.183±0.058）/h，（0.231±0.046）/h，（0.200±0.069）/h，respective1y.No significant difference either in P a or Kawas indicative of specia1absorption sites.CONCLUSIONT artaric acid use can spike the intestina1vincamine permeabi1ity，and improve the ora1bioavai1abi1ity of the formu1ations.

vincamine；pH-dependent；tartaric acid；in vivo intestina1absorption；HPLC-UV

R966

A

1001-1528（2015）08-1695-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.013

2014-10-18

相 琳（1983—），女，碩士，講師，從事藥物新劑型與新技術研究。Te1：（0411）82829759，E-mai1：1ynnxiang@126.com

黃 婷 （1983—），女，碩士，助理研究員，從事藥物新技術、新劑型研究。Te1：（021）64034614，E-mai1：ting-1emon@ 163.com