復(fù)方丹參滴丸對(duì)2型糖尿病大鼠模型胰島β細(xì)胞功能的影響

周 嘉， 尋 英， 黃 松， 羅佐杰， 秦映芬*

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣西南寧530021；2.瀏陽市人民醫(yī)院，湖南瀏陽410300）

復(fù)方丹參滴丸對(duì)2型糖尿病大鼠模型胰島β細(xì)胞功能的影響

周 嘉1， 尋 英2， 黃 松1， 羅佐杰1， 秦映芬1*

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣西南寧530021；2.瀏陽市人民醫(yī)院，湖南瀏陽410300）

目的觀察復(fù)方丹參滴丸對(duì)2型糖尿病SD大鼠胰島β細(xì)胞氧化應(yīng)激與凋亡的影響。方法建立2型糖尿病大鼠模型，復(fù)方丹參滴丸干預(yù)12周后，檢測(cè)FBG、TC、TG及Insu1in，胰腺勻漿檢測(cè)MDA、SOD、GSH-Px，胰腺M(fèi)asson染色，免疫組化檢測(cè)Insu1in、α-SMA、CD31的表達(dá)，原位末端標(biāo)記法 （Tune1法）計(jì)算胰島β細(xì)胞凋亡率。結(jié)果復(fù)方丹參滴丸干預(yù)組MDA、SOD、GSH-Px含有量，α-SMA、CD31、Insu1in表達(dá)水平，β細(xì)胞凋亡及糖、脂代謝均有不同程度改善 （P＜0.05）。結(jié)論復(fù)方丹參滴丸可抑制胰島氧化應(yīng)激，減輕胰島纖維化、改善胰島微循環(huán)，減少β細(xì)胞凋亡，改善胰島功能。

復(fù)方丹參滴丸；2型糖尿病；氧化應(yīng)激；凋亡

復(fù)方丹參滴丸作為傳統(tǒng)中藥，其有效部分為水溶性的丹參素和脂溶性的丹參酮，均是良好的氧自由基清除劑，被廣泛用于冠心病和糖尿病微血管并發(fā)癥的預(yù)防和治療。胰島β細(xì)胞是體內(nèi)唯一易受到氧化損傷和極易凋亡的細(xì)胞。近年研究結(jié)果顯示，復(fù)方丹參滴丸可降低糖尿病動(dòng)物及患者的血糖［1-3］，推測(cè)其降血糖作用可能與潛在抗氧化作用有關(guān)，從而對(duì)胰島β細(xì)胞具有保護(hù)作用。因此，本研究擬觀察復(fù)方丹參滴丸對(duì)2型糖尿病SD大鼠模型胰島β細(xì)胞氧化應(yīng)激與凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 6～8周齡雄性健康SD大鼠40只，體質(zhì)量180～220 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（合格證號(hào)SCXK桂2009-0002）；普通標(biāo)準(zhǔn)飼料、高糖高脂飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供。鏈脲佐菌素（STZ，美國(guó)Sigma公司）；復(fù)方丹參滴丸 （天津天士力制藥股份有限公司，批號(hào)110105）；胰島素放射免疫分析藥盒 （北京北方生物技術(shù)研究所）；超氧化物歧化酶 （Superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（Ma1ona1dehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（G1utathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒 （南京建成生物工程有限公司）；胰島素抗體 （美國(guó)santa cruz biotechno1ogy公司）；CD31抗體（ABBIOTEC公司）；α-SMA抗體 （武漢博士德生物工程有限公司）；Tune1試劑盒（德國(guó)Roche公司）。

1.2 方法 40只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分組，其中10只為正常對(duì)照組給予普通標(biāo)準(zhǔn)飼料，其余30只給予高糖高脂飼養(yǎng)8周后，一次性腹腔注射小劑量現(xiàn)配的2%STZ溶液 （20 mg/kg），72 h后采尾部末梢血，優(yōu)越血糖儀（ACCU CHEK Advantage，瑞士羅氏診斷公司）測(cè)定隨機(jī)血糖（random b1ood g1ucose，RBG），以RBG≥16.7 mmo1/L為造模成功，1周后血糖穩(wěn)定，RBG≥16.7 mmo1/L者隨機(jī)進(jìn)入糖尿病模型組 （12只）、復(fù)方丹參滴丸組 （12只）。復(fù)方丹參滴丸組給予復(fù)方丹參滴丸180 mg/kg灌胃干預(yù)12周，同時(shí)其余2組予等量生理鹽水灌胃12周。實(shí)驗(yàn)過程中6只大鼠死亡，未納入最后統(tǒng)計(jì)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 生化指標(biāo)測(cè)定 葡萄糖氧化酶法測(cè)定空腹血糖（FBG），血清甘油三酯 （TG）、總膽固醇 （TC）采用Beckman X20全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定；放射免疫分析法測(cè)定空腹胰島素（FINS），計(jì)算HOMA-IR（胰島素抵抗指數(shù)）=FINS×FBG/22.5，ISI（胰島素敏感指數(shù)）=1/ FINS×FBG。

1.3.2 胰腺SOD、MDA、GSH-Px測(cè)定 各組灌胃干預(yù)12周取胰腺組織勻漿吸取上清液，按試劑盒說明書操作，分光光度儀測(cè)各組OD值，并根據(jù)公式計(jì)算SOD、MDA、GSH-Px含有量。

1.3.3 胰腺M(fèi)asson染色 根據(jù)Masson三色染色法染色，常規(guī)光鏡下觀察胰島及其周圍組織纖維增生程度，結(jié)果判定：膠原纖維呈綠色、肌纖維及紅細(xì)胞呈紅色。

1.3.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 胰島素 （Insu1in）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth musc1e actin，α-SMA）、CD31 SP法檢測(cè)，細(xì)胞胞漿見棕黃色顆粒聚集為陽性信號(hào)。每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野（40×）拍照，采用Image-Pro P1us 6.0病理圖像軟件分析系統(tǒng)，測(cè)定各組光密度值，分析胰腺Insu1in、α-SMA、CD31的表達(dá)水平。

1.3.5 Tune1法計(jì)算胰島β細(xì)胞凋亡率 按照試劑盒說明操作，正常細(xì)胞胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞胞核呈棕褐色。采用Image-Pro P1us 6.0病理圖像軟件分析系統(tǒng)，進(jìn)行半定量分析。每張切片計(jì)數(shù)5個(gè)不同視野中陽性細(xì)胞的比例判斷細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞凋亡率 （%） =凋亡細(xì)胞數(shù)目/（凋亡細(xì)胞數(shù)目+正常細(xì)胞數(shù)目）×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （）表示，多組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方丹參滴丸對(duì)糖脂代謝與胰腺氧化應(yīng)激水平的影響 與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠體質(zhì)量明顯下降，血清FBG、TC、TG、FINS、HOMA-IR水平顯著增高，ISI顯著降低；同時(shí)，胰腺M(fèi)DA含有量明顯升高，SOD、GSHPX含有量顯著降低 （P＜0.05）。與模型組相比，復(fù)方丹參滴丸組血清FBG、TC、TG、FINS、HOMA-IR均有不同程度下降，體質(zhì)量及ISI升高，胰腺SOD、GSH-PX含有量均表現(xiàn)為不同程度升高，MDA含有量明顯下降 （P＜0.05）（見表1、2）。

表1 各組大鼠FBG、TC、TG、FINS、ISI、IR比較（）

表1 各組大鼠FBG、TC、TG、FINS、ISI、IR比較（）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，●P＜0.05

ISI HOMA-IR正常對(duì)照組組別 FBG/（mmo1·L-1） TC/（mmo1·L-1） TG/（mmo1·L-1） FINS/（mU·L-1）4.82±0.51 1.69±0.34 1.34±0.34 8.56±0.40 -3.72±0.13 1.84±0.23模型組 9.69±0.64* 2.92±0.32* 2.78±0.33* 10.39±0.43* -4.61±0.07* 4.47±0.32*復(fù)方丹參滴丸組 8.26±0.71*● 2.01±0.38*● 2.06±0.29*● 9.85±0.21*● -4.40±0.08*● 3.61±0.29*●

表2 各組大鼠胰腺組織氧化應(yīng)激情況 （）

表2 各組大鼠胰腺組織氧化應(yīng)激情況 （）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，●P＜0.05

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2.2 復(fù)方丹參滴丸對(duì)胰島CD31、α-SMA與Insu1in蛋白表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組相比，模型組CD31、Insu1in蛋白表達(dá)明顯下降，α-SMA顯著增加，CD31表達(dá)量與Insu1in表達(dá)量呈正相關(guān)，α-SMA表達(dá)量與Insu1in表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。與模型組相比，復(fù)方丹參滴丸組CD31、Insu-1in蛋白表達(dá)明顯恢復(fù)，α-SMA表達(dá)明顯降低 （P＜0.05）（見表3）。胰腺組織SOD、GSH-Px含量與胰島CD31、Insu1in蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)，與α-SMA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)；MDA含量與胰島CD31、Insu1in蛋白表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，與α-SMA表達(dá)量呈正相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)合Masson染色結(jié)果 （染色模型組＞復(fù)方丹參滴丸組＞正常對(duì)照組），提示糖尿病大鼠胰島內(nèi)及周圍組織出現(xiàn)不同程度纖維化改變，使得胰島β細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能受損 （見圖1）。

表3 各組大鼠胰腺組織免疫組化染色情況 （）

表3 各組大鼠胰腺組織免疫組化染色情況 （）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，●P＜0.05

-SMA正常對(duì)照組組別 Insu1in CD31 α 10.65±0.99 6.65±0.84 3.51±0.53模型組 6.24±0.36* 2.98±0.41* 9.45±1.07*復(fù)方丹參滴丸組 7.46±0.70*●4.96±0.46*● 7.24±0.71*●

2.3 復(fù)方丹參滴丸干預(yù)對(duì)胰島β細(xì)胞凋亡的影響 模型組凋亡率顯著高于其他兩組，復(fù)方丹參滴丸組凋亡情況明顯改善（P＜0.05）（見圖2）。胰腺組織SOD、GSH-Px含有量與胰島細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān)，MDA含有量與胰島細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān) （P＜0.05）。

圖1 各組大鼠胰腺M(fèi) asson染色情況（40×）

3 討論

復(fù)方丹參滴丸是根據(jù)中醫(yī)傳統(tǒng)理論和現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)相結(jié)合而成的復(fù)合制劑，主要由丹參、三七、冰片組成。藥理及藥效學(xué)的研究證實(shí)，具有活血化瘀、消腫、涼血、止血功能，可擴(kuò)張冠脈血管、增加冠脈血流量、防治心肌缺血，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化等大血管病變有很好的效果；同時(shí)也可通過抗氧化、抗血小板活化和聚集、改善脂質(zhì)代謝、保護(hù)血管內(nèi)皮等多靶點(diǎn)作用，對(duì)糖尿病微循環(huán)障礙性疾病起到治療效果。近年研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方丹參滴丸在控制血糖方面也有一定的作用，可能與其改善微循環(huán)的作用有關(guān)［2］。陳頻等［3］報(bào)道復(fù)方丹參滴丸干預(yù)可顯著改善胰島素抵抗大鼠的糖脂代謝水平。而復(fù)方丹參滴丸對(duì)胰島β細(xì)胞影響的報(bào)道尚少。

圖2 各組大鼠胰島β細(xì)胞凋亡情況比較 （）

由于胰島細(xì)胞本身抗氧化能力較低，極易受氧化損傷，高血糖可通過誘導(dǎo)蛋白激酶C依賴的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸活化等途徑刺激胰島β細(xì)胞產(chǎn)生過多的活性氧簇分子。因此，氧化應(yīng)激已被證實(shí)是誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡和抑制胰島素分泌的重要因素，有效的抗氧化治療可減輕氧化應(yīng)激，保護(hù)胰島β細(xì)胞功能，減少其凋亡。本研究結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，2型糖尿病SD大鼠模型組存在高血糖、高血脂等代謝紊亂以及胰島素抵抗的狀態(tài)，同時(shí)，胰腺M(fèi)DA含有量明顯升高，SOD、GSH-Px含有量顯著降低，二者失衡提示胰腺組織處于明顯的氧化應(yīng)激狀態(tài)。而且，2型糖尿病SD大鼠模型組胰島β細(xì)胞凋亡率顯著高于正常對(duì)照組，胰腺組織SOD、GSH-Px含有量與胰島細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān)，MDA含有量與胰島細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)。本研究結(jié)果亦表明，給予復(fù)方丹參滴丸干預(yù)后，2型糖尿病SD大鼠模型組的糖脂代謝、胰島素抵抗及氧化應(yīng)激得到明顯改善，胰島細(xì)胞凋亡率減少。說明復(fù)方丹參滴丸可通過抗氧化應(yīng)激，減少胰島β細(xì)胞凋亡，保護(hù)胰島β細(xì)胞功能。同樣，任宏強(qiáng)等［4］報(bào)道，復(fù)方丹參滴丸干預(yù)的大鼠急性心肌缺血再灌注模型，心肌細(xì)胞凋亡顯著減少，凋亡相關(guān)蛋白Fas、Fas-L和p53mRNA的表達(dá)水平明顯下調(diào)。

胰島具有豐富的微循環(huán)系統(tǒng)，是維持胰島結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)，而胰島血管內(nèi)皮細(xì)胞是維持胰島生理功能的重要細(xì)胞之一。糖耐量異?；蛱悄虿?dòng)物模型中均存在不同程度的胰島微循環(huán)調(diào)節(jié)異常：在肥胖或糖尿病前期，胰島處于高灌注狀態(tài)，進(jìn)而引起胰島微血管高壓及胰島內(nèi)皮細(xì)胞損傷，內(nèi)皮功能損傷又進(jìn)一步導(dǎo)致胰島血流調(diào)節(jié)異常，最終使得胰島微循環(huán)灌注不足，胰島功能失代償，提示胰島微循環(huán)調(diào)節(jié)障礙可能參與了糖尿病胰島功能衰竭的發(fā)生發(fā)展過程［5］。研究顯示通過改善胰島微循環(huán)對(duì)胰島功能具有保護(hù)效應(yīng)［6-7］。考慮到復(fù)方丹參滴丸具有活血化瘀的功效，且陳巖等［8］報(bào)道，丹參干預(yù)后的家兔心肌梗死模型CD31表達(dá)明顯增加，梗死及其周圍區(qū)新生毛細(xì)血管數(shù)量增加、供血改善，梗死面積減少。因此，本研究采用CD31作為內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記評(píng)價(jià)胰島內(nèi)微血管結(jié)構(gòu)的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)復(fù)方丹參滴丸干預(yù)后能促進(jìn)糖尿病大鼠胰島內(nèi)微血管的生成，胰島供血明顯改善，β細(xì)胞功能較前明顯恢復(fù)，且胰腺組織SOD、GSH-Px含有量與胰島CD31、Insu1in蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)，MDA含有量與胰島CD31、Insu1in蛋白表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，提示可能與其良好的抗氧化活性相關(guān)。

進(jìn)一步的研究提示胰島纖維化是糖尿病進(jìn)程中的重要病理改變。胰島纖維化可破壞胰島的正常組織結(jié)構(gòu)并導(dǎo)致胰島功能惡化、β細(xì)胞數(shù)量減少、胰島素分泌降低?，F(xiàn)有的研究認(rèn)為氧化應(yīng)激是引起胰島纖維化的四大潛在因素之一，胰島內(nèi)氧化應(yīng)激的改善甚至是維護(hù)胰島形態(tài)和功能穩(wěn)定的最強(qiáng)標(biāo)志［9-10］。胰腺星狀細(xì)胞（pancreatic ste11ate ce11，PSC）是胰腺纖維化起始和發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，它與肝星狀細(xì)胞在諸多方面存在相似之處，在各自纖維化疾病中都發(fā)揮著重要作用。當(dāng)胰腺受損時(shí)，PSC被活化，由原來的儲(chǔ)脂細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維樣細(xì)胞，開始表達(dá)α-SMA，合成細(xì)胞外基質(zhì)，成為病理狀態(tài)下胰腺纖維化的主要功能細(xì)胞。因此，α-SMA是活化PSC的特異性表達(dá)標(biāo)志［11］。Hsu等［12］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丹參明顯抑制肝臟α-SMA的表達(dá)產(chǎn)生，對(duì)肝纖維化有抑制作用。類似的是，本研究結(jié)果提示2型糖尿病SD大鼠胰島的α-SMA顯著增加，與Insu1in表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，結(jié)合Masson染色結(jié)果（染色模型組＞復(fù)方丹參滴丸組＞正常對(duì)照組），提示糖尿病大鼠胰島內(nèi)及周圍組織出現(xiàn)不同程度纖維化改變，使得胰島β細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能受損。給予復(fù)方丹參滴丸干預(yù)后，α-SMA表達(dá)明顯降低，Insu1in蛋白表達(dá)增加，胰島纖維化程度較糖尿病組明顯改善。

近年來胰島局部微環(huán)境的重要性逐步得到研究者的重視。胰島微環(huán)境包括胰島內(nèi)部微血管結(jié)構(gòu)的數(shù)量和功能、胰島氧化應(yīng)激程度、胰島局部存在的旁分泌系統(tǒng)等，對(duì)胰島細(xì)胞增殖、凋亡、胰島素分泌功能和胰島素敏感性具有較大的影響［13-14］。作為傳統(tǒng)中成藥的復(fù)方丹參滴丸，其在臨床的應(yīng)用不斷被開發(fā)，而本研究結(jié)果提示復(fù)方丹參滴丸可通過抑制胰島氧化應(yīng)激，減輕胰島纖維化、改善胰島微循環(huán)，減少β細(xì)胞凋亡，從而改善胰島功能，值得更多的關(guān)注及進(jìn)一步研究。

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R285.5

B

1001-1528（2015）08-1807-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.038

2014-10-12

廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 （桂科青0832029）；廣西中醫(yī)藥民族醫(yī)藥資助項(xiàng)目 （GZZC14-42）

周 嘉 （1975—），女，副主任醫(yī)師，博士，從事內(nèi)分泌代謝病研究。Te1：（0771）5356517，E-mai1：ab0851@163.com

尋 英（1990—），女，住院醫(yī)師，碩士，從事內(nèi)分泌代謝病研究。Te1：（0731）83605752，E-mai1：inxun@foxmai1.com

*通信作者：秦映芬 （1968—），女，主任醫(yī)師，博士，從事內(nèi)分泌代謝病研究。Te1：（0771）5356517，E-mai1：yingfenq@126.com