反相－混合柱色譜串聯MS法探索中藥半夏的化學成分

徐文英，劉春生，馮孟鑫，馬愷悅，高山山，侯文珍，王佳宇，馬長華（北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102）

反相－混合柱色譜串聯MS法探索中藥半夏的化學成分

徐文英，劉春生，馮孟鑫，馬愷悅，高山山，侯文珍，王佳宇，馬長華＊（北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102）

目的 對中藥半夏中在C18色譜柱上保留較弱的化學成分進行分離與鑒定。方法 首先采用Waters X－Bridge C18色譜柱（150mm×4.6mm，5μm）對半夏藥材酸水提取液進行分離，然后對半夏提取液中在C18柱上保留較弱的成分采用Tech MateTX色譜柱（120A，150mm×2.0mm，5μm）（SCX與反相C18混合填料色譜柱）進行進一步分離分析，最后采用LC－MS對所分離成分進行鑒定，ESI正離子模式掃描分析。結果 根據正離子模式下獲得的各色譜峰的質譜數據，共檢測到13個主要的化學成分，其中3個通過與文獻對照或根據質譜裂解規律得到了確認，分別為：纈氨酸，腺嘌呤，精氨酸；化合物1，2，4，5，7，8和13推測為：5－羥甲基糠醛，6 H－purin－6－1，2－amino－1，9－dihydro－8－（1－naphthalenylamino），環－（纈氨酸－酪氨酸），環－（亮氨酸－酪氨酸），亮氨酸－異亮氨酸，（－）－pohakulin pohakuline，N－（1－（苯基乙?；璍－脯氨酰）甘氨酸乙酯，化合物9推測為某種環肽；化合物10和11由于缺乏相關對照品和相關文獻報道，其結構有待進一步分析鑒定。結論 在C18柱上死時間內流出而不能很好分離的物質，在混合填料柱上得到了進一步分離，這說明在某種程度上，采用單一固定相不能很好分離的某些化合物可以采用混合固定相色譜柱達到進一步分離，尤其是在對復雜體系樣品的分離及鑒定過程中，混合固定相色譜柱將具有良好的應用前景。

半夏；混合固定相；高分辨質譜

半夏為天南星科半夏屬植物半夏（Pinellia ternate（Thunb.）Breit.）的干燥塊莖，已有2 000多年的用藥歷史［1－2］。據統計，在558個中藥處方中，半夏的使用頻率居第22位。在傳統用藥中，半夏可用于燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結，外用可用于急性乳腺炎等。進一步研究還發現，半夏還具有抗腫瘤、護肝、抗生育、治療冠心病、降血脂等多種重要作用［3］。目前，2010年版《中國藥典》采用電位滴定法測定其總酸含量［4］，對半夏藥材進行質量控制，此法靈敏快速，能在一定程度上反映半夏的質量。但半夏成分復雜，指標性成分不明確，本課題組在半夏藥材一維色譜指紋圖譜建立的過程中，發現某些在C18為固定相的色譜柱上死體積內流出的物質往往會被忽略，而這些物質中亦可能含有與藥效相關的成分。

研究表明，采用2種選擇性差別較大的固定相填料混合后裝柱，混合固定相色譜柱具有不同于2種單一固定相的選擇性［5］。為將半夏藥材中在單純C18色譜柱上保留較弱的成分進行進一步的分離分析，本實驗采用C18色譜柱及Tech MateTX色譜柱（SCX與反相C18混合填料色譜柱）構建離線二維色譜，將半夏藥材中在單純C18色譜柱上保留較弱的成分（前5min內流出的成分）進一步采用Tech MateTX色譜柱進行分離分析，并采用LC－MS對所分離的成分進行鑒定，以期獲得半夏藥材中盡可能多的化學成分信息，同時對混合固定相填料的色譜柱在中藥分離分析中的適用性進行初步探索。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 1525高效液相色譜儀（Waters 2707自動進樣器，柱溫箱，Waters 2998二極管陣列檢測器，Waters 1525泵，breeze TM2色譜工作站）；LTQ Orbitrap XL質譜儀與Accela高效液相色譜儀（Thermo公司）；分析天平（上海越平科學儀器有限公司）；pH計（PB－10）；KQ－300GVDV型超聲儀（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 半夏藥材，購自北京華邈醫藥公司，經北京中醫藥大學劉春生教授鑒定為天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit.的干燥塊莖；乙腈（Fisher公司）為色譜純；流動相用水為娃哈哈純凈水；甲酸、甲酸銨（分析純，北京化工廠）。

2 實驗方法

2.1 第一維色譜分析條件

2.1.1 供試品溶液的制備 取60℃干燥至恒質量的樣品粉末（60目）5g，精密稱定，加入體積分數75%的酸性乙醇（體積分數1%鹽酸）溶液50mL，冷浸過夜，超聲提取30min，放冷，稱質量，過濾，用體積分數75%酸性乙醇（體積分數1%鹽酸）5mL，洗滌濾渣和濾器，合并濾液及洗液，備用。

2.1.2 色譜條件 色譜柱：Waters X－Bridge C18色譜柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇（B）：水（A），梯度洗脫：0～10min99.5%～99%A，10～15 min99%～98.5%A，15～30min98.5%～94.5%A，30～35min94.5%～90%A，35～45min90%～85% A，45～50min85%～74%A，50～62min74%～67% A，62～87min50%～50%A，87～92min50%～99.5%A；流速：1mL·min－1；檢測波長：254nm。2.1.3 樣品測定 供試品溶液過0.45μm濾膜后，按2.1.2項下色譜條件進樣50μL，記錄其色譜圖，如圖1所示。

2.2 第二維混合色譜柱串聯MS分析條件

2.2.1 供試品溶液制備 SunFireTMPrep C18色譜柱（150mm×10mm，10μm）；按2.1.2項下梯度洗脫條件進樣100μL，流速：2.17mL·min－1；收集前5min內流出的組分，冷凍干燥，加入10mL體積分數30%的乙腈甲酸水（pH＝3.0）溶液溶解，備用。

2.2.2 色譜條件 色譜柱（120A，150mm×2.0 mm，5μm）；流動相：乙腈－甲酸水溶液（pH＝3.0）30∶70（A），50mmol·L－1甲酸銨水溶液（甲酸調pH＝3.0）50∶50（B），梯度洗脫：0～30min100%～50% A，30～50min50%～50%A，50～60min50%～0% A，60～80min0%～0%A，80～83min0%～100% A；柱溫：20℃，流速：0.2mL·min－1，進樣量：20μL。

2.2.3 質譜條件 檢測模式為：ESI＋，毛細管溫度為275℃，噴霧電壓為4.5kV，霧化氣（N2）壓力40 Psi，干燥氣（N2）流速10.0L·min－1，掃描范圍為m／z＝50～1 500，數據采集系統為Xcalibur v2.0.7。2.2.4 樣品測定 供試品溶液過0.45μm濾膜后，按2.2.2項下色譜條件進樣20μL，按照2.2.3項下質譜條件進行檢測，記錄其總離子流圖及各個時間點對應的色譜圖，部分樣品的提取離子流圖見圖2，所鑒定化合物的保留時間與一級和二級質譜以及相關分子式信息見表1。

3 實驗結果

半夏第一維色譜C18色譜柱色譜圖見圖1；部分化合物提取離子色譜圖見圖2。

圖1 半夏第一維色譜C18色譜柱色譜圖Fig.1 The first dimension chromatography on C18column of Pinellia ternata

圖2 部分化合物提取離子色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatograms of the components

由圖1可以看出，當流動相中水的比例高達99%時，半夏藥材在C18色譜柱上前5min內流出的化合物仍未能得到較好分離，而此部分化合物中可能也含有與其藥效相關的化合物。為此，本實驗進一步采用Tech MateTX混合填料的色譜柱對此部分化合物進行進一步分離，以期探索得到半夏中更多的化合物信息。半夏第一維色譜前5min流出物質的HPLC－MS－MS分析的部分提取離子色譜圖如圖2所示。對比兩圖可知，在C18柱上前5min內被洗脫而未被很好分離的物質，在混合固定相的色譜柱上有了進一步分離。其中有6個色譜峰得到較好分離，結合HPLC的保留時間值以及參考文獻報道，并根據所得到的一級質譜給出的準分子離子峰信息和所得到的二級質譜推測出的結構碎片信息，共推測出13個化學成分的可能結構，這些成分在前期文獻中都曾有報道［6－7］，通過對比文獻中相關化合物的一級和二級質譜信息，化合物3，6和12得到了確證，分別為：纈氨酸，腺嘌呤，精氨酸；化合物1，2，4，5，7，8和13推測為5－羥甲基糠醛，6 H－purin－6－1，2－a－mino－1，9－dihydro－8－（1－naphthalenylamino），環－（纈氨酸－酪氨酸），環－（亮氨酸－酪氨酸），亮氨酸／異亮氨酸，（－）－pohakulin pohakuline，N－（1－（苯基乙酰基）－L－脯氨酰）甘氨酸乙酯，化合物9推測為某種環肽；化合物10和11由于缺乏相關對照品和相關文獻報道，因此其結構有待進一步分析鑒定。表1給出了所有化合物的保留時間與一級和二級質譜以及相關分子式信息。

表1 被鑒定化合物的保留時間、一級質譜、二級質譜和分子式Tab.1 The retention time and formula and MS1－MS2of the identification compounds

4 結論

由以上結果可以發現，采用C18色譜柱及混合填料色譜柱搭建離線二維液相色譜可以簡單快速地分離鑒別半夏酸水提取液中極性較大的化學成分。此外，在C18填料色譜柱上保留較弱的物質（死時間內流出的物質）在混合填料色譜柱上有了進一步的分離，這說明，相比于單一C18填料而言，混合填料的色譜柱可以大大提高色譜柱的選擇性，使樣品的分析更有針對性，分離性能也優于單一固定相，進而改善HPLC分離。而且，將此種混合填料的色譜柱與MS串聯使用時，還可以克服在實際分析檢測工作中，尤其是復雜樣品（如中藥）的分析中的流動相不兼容的缺點，因此，混合填料的色譜柱在分析工作中具有良好的應用前景。本文僅初步探索了混合填料SCXC18＝1∶4的色譜柱，復雜的樣品體系也只選擇了中藥材半夏中在C18色譜柱上死時間內較難很好分離的化合物體系，今后可以嘗試諸如C8－SCX和C8－HILIC等更多的混合固定相體系，研究對象也可以放大為更多的成分復雜的中藥材，進而對該類型的體系進行更深入地研究。可以相信，基于混合填料色譜原理不斷優化出的色譜柱及其色譜體系會更好地應用于中藥成分的分離分析及化合物的分離鑒定等分析領域。

［1］陳宏.半夏研究進展［J］.現代農業科技，2010，（5）：80－81.

［2］陳鋼，崔小兵，談獻和，等.半夏藥材中鳥苷和尿苷的含量測定及半夏指紋圖譜研究［J］.西北藥學雜志，2011，26（5）：313－316.

［3］姚軍強.半夏的藥理作用及其臨床配伍運用［J］.中醫研究，2013，26（2）：3－5.

［4］國家藥典委員會.《中國藥典》2010年版［S］.一部.北京：中國醫藥科技出版社，2010：89.

［5］傅若農.氣相色譜混合固定相和其中的“協同效應”［J］.國外分析儀器，1997，7（1）：29－32.

［6］徐劍錕，張天龍，易國卿，等.半夏化學成分的分離與鑒定［J］.沈陽藥科大學學報，2010，27（6）：429－433.

［7］張之昊，戴忠，胡曉茹，等.半夏化學成分的分離與鑒定［J］.中藥材，2013，36（10）：1620－1622.

Study on the chemical composition of traditional Chinese medicine Pinellia ternate by C18－mixed－stationary phase column LC－MS

XU Wenying，LIU Chunsheng，FENG Mengxin，MA Kaiyue，GAO Shanshan，HOU Wenzhen，WANG Jiayu，MA Changhua＊
（School of Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

Objective To separate and identify the chemical compositions of Pinellia ternate which is slightly reserved on the C18column.Methods Firstly a Waters X－Bridge C18column was used to separate the acidic water extract of Pinellia ternate，and then the Tech MateTXcolumn（120A，150mm×2.0mm，5μm）（SCX－C18mixed stationary phase column）was used to separate the components that slightly retained on the C18column，and finally the components that slightly retained on the C18column were separated and identified by LC－MS－ESI in a positive ion mode.Results According to the positive ion mode available mass spectral data for each chromatographic peak，13major chemical constituents were detected，3of which were confirmed by literature or under the control of MS fragmentation mechanism.They were adenine，valine，and arginine.Compounds 1，2，4，5，7，8and 13were：5－hydroxymethyl furfural，6 H－purin－6－1，2－amino－1，9－dihydro－8－（1－naphthalenylamino），ring－（Val Tyr），cyclo（leu－tyr），leucine－isoleucine，（－）－pohakulinpohakuline，and N－（1－（phenylacetyl）－L－prolyl）glycine ethyl ester.Compound 9was presumed to be a cyclic peptide；due to the lack of control and related literatures，the structure of compounds 10and 11need to be identified for further analysis.Conclusion The substances which were flowed out in the dead time on the C18column can be separated on the mixed－stationary phase column.The mixed－stationary phase will has a good application prospects.

Pinellia ternate；mixed－stationary phase；high－resolution mass spectrometry

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.04.008

R284

A

1004－2407（2015）04－0354－04

2015－04－10）

北京市自然科學基金項目（編號：7142101）

徐文英，女，在讀碩士研究生

＊通信作者：馬長華，男，教授，碩士生導師