新疆不同產地石榴皮品種優選

常占瑛，劉桂花，陳雪珊，高曉黎，古麗巴哈爾·卡吾力＊（.新疆醫科大學藥學院，烏魯木齊 8300；.新疆藥物研究所，烏魯木齊 830004）

新疆不同產地石榴皮品種優選

常占瑛1，劉桂花2，陳雪珊1，高曉黎1，古麗巴哈爾·卡吾力1＊（1.新疆醫科大學藥學院，烏魯木齊 830011；2.新疆藥物研究所，烏魯木齊 830004）

目的 通過綜合評分篩選出最優石榴皮品種。方法 采用高效液相色譜法測定沒食子酸、鞣花酸含量；紫外分光光度法測定總多酚含量。結果 沒食子酸在10.88～348μg·mL－1范圍內，線性關系良好（r＝0.999 8），鞣花酸在9.94～318μg·mL－1范圍內，線性關系良好（r＝0.999 9），沒食子酸在1.1～7.7μg·mL－1范圍內，線性關系良好（r＝0.999 9）。結論 通過綜合評分篩選出喀什市酸石榴皮為最優品種。

石榴皮；沒食子酸；鞣花酸；總多酚

石榴（Punica granatumL.）為石榴科石榴屬植物，是一種藥食同源的植物資源，石榴的汁、果皮、花、葉、籽、根皆可入藥，具有抗氧化、清除自由基、預防心腦血管疾病、調節血脂、抗病毒、抗癌及改善婦女更年期綜合征等多種生理和藥理活性［1］。石榴皮含有多酚、黃酮、氨基酸、微量元素等多種化學成分，1995年版《中國藥典》開始規定石榴皮主要成分鞣質的量不得低于10%。鞣質（tannins）又稱單寧，是存在于綠茶、葡萄、藍莓和石榴等植物中的一類多元酚類化合物，但石榴多酚比茶多酚、葡萄多酚等的抗氧化性、抗菌活性和抗動脈粥樣硬化作用更顯著［2］。石榴多酚主要存在于石榴果皮中，約為其干質量的10.4%～21.3%，石榴皮多酚主要成分包括安石榴苷（punicalagin）、鞣花酸、石榴皮鞣素和沒食子酸等，據大量文獻報道［3－5］，沒食子酸具有抗腫瘤、抗突變、抗氧化、殺蟲等多種功效。鞣花酸能與金屬離子螯合，并能與自由基反應，從而具有抗氧化功能［6］，鞣花酸同時還可以抗肺癌、食管癌［7］。藥理實驗也表明，石榴皮具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用。因此測定石榴皮中總多酚、沒食子酸、鞣花酸的含量，可以從一定程度上反映其內在質量。新疆氣候干燥，夏季酷熱，降水稀少，非常適宜種植石榴，但該地區石榴品種較多，地區與地區之間的差異較大，篩選出較優產地的石榴皮品種可以為以后的科學研究奠定一定的基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV－2550PC可見－紫外分光光度計（島津制作所）；Sartorius BS110S電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；HWS24型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；KQ3200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；EYELA N－1001旋轉蒸發器；循環水式多用真空泵（鄭州長城科教儀器有限公司）；LC－10ATVP高效液相色譜儀（日本島津）、SPD－10AVP檢測器。

1.2 試藥 沒食子酸對照品（批號為110831－200302，中國藥品生物制品檢定所，質量分數98%）；鞣花酸對照品（批號為110831－200302，中國藥品生物制品檢定所，質量分數為98%）；甲醇為色譜純；水為雙蒸水；磷酸、乙醚均為分析純。

2 方法與結果

2.1 石榴皮中沒食子酸的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB－C18（250mm ×4.6mm，5μm）；流動相：2mL·L－1磷酸－甲醇（97∶3）；流速：0.8mL·min－1；檢測波長：273nm；柱溫30℃［810］；進樣量：10μL。在此條件下，沒食子酸與供試品中其他組分色譜峰可達基線分離，分離度大于1.5，保留時間適中。對照品和樣品的色譜圖見圖1。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對照品8.7mg，置于25mL棕色量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻。制成每1mL含沒食子酸0.348mg的溶液，作為對照品溶液。

2.1.3 沒食子酸標準曲線的繪制 精密吸取沒食子酸對照品溶液5mL，置于10mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，依次稀釋，得不同系列質量濃度的溶液，分別吸取10μL進樣，以峰面積Y、沒食子酸含量X進行線性回歸，得回歸方程：Y＝69 602 X＋6 733.1，r＝0.999 8（n＝6），沒食子酸在10.88～348μg·mL－1范圍內線性關系良好。

2.1.4 供試品溶液的制備 精密稱取不同產地石榴皮粉末約20g，加HCl（1→9）250mL，乙醚250mL，回流水解2.0h，過濾，提取2次，合并濾液，蒸干，甲醇溶解，定容至100mL，搖勻，吸取1mL稀釋至50mL，用微孔濾膜（0.45μm）過濾，取續濾液，即得供試品溶液。

2.1.5 精密度實驗 精密吸取對照品溶液在同一天內重復進樣5次，連續測定3d，計算日內、日間標準差。結果表明，日內及日間標準差均小于2%，說明本法比較穩定，重復性好。

2.1.6 重復性實驗 精密稱定5份樣品，按2.1.4項方法制成供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件測定沒食子酸含量，平均含量為2.41mg·g－1，RSD為1.77%，表明本方法重復性符合分析要求。

2.1.7 穩定性實驗 取供試品溶液，分別于0，2，4，6，12，24，36和48h進樣測定，以峰面積計算，考察其48h內的穩定性。結果RSD為1.37%，表明樣品溶液在48h內穩定。

2.1.8 加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的樣品細粉適量，加入定量的沒食子酸對照品溶液，按2.1.4項方法制備溶液和測定，計算回收率，9次測得沒食子酸平均回收率為100.39%，RSD為1.19%，表明分析方法準確，見表l。

表1 沒食子酸加樣回收實驗結果Tab.1 The results of recovery tests of gallic acid （n＝9）

2.2 石榴皮中鞣花酸的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB－C18（250 mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇－乙酸乙酯－磷酸二氫鉀／磷酸（0.05mol·L－1）（32∶2∶66）；流速：1 mL·min－1；柱溫：30℃；檢測波長：254nm［11］；進樣量：10μL。在此條件下，鞣花酸與供試品中其他組分色譜峰可達基線分離，分離度大于1.5，保留時間適中。對照品和供試品的色譜圖見圖1。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取鞣花酸對照品15.9mg，置于50mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。制成每1mL含鞣花酸0.318mg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.3 鞣花酸標準曲線的繪制 精密吸取鞣花酸對照品溶液5mL，置于10mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，依次稀釋，得不同系列質量濃度的溶液，分別吸取10μL進樣，以峰面積Y、鞣花酸含量X進行線性回歸，得回歸方程：Y＝6 047.5 X＋7 516.3，r＝0.999 9（n＝6），鞣花酸質量濃度在9.94～318μg·mL－1范圍內線性關系良好。

2.2.4 供試品溶液的制備 精密稱取不同產地石榴皮粉末約1.0g，加體積分數70%丙酮100mL，浸漬約14h，超聲處理30min，濾過，殘渣用體積分數70%丙酮30mL洗滌，合并濾液和洗滌液，用旋轉蒸發儀蒸干丙酮溶液，加體積分數50%的甲醇溶液100 mL（內含1.2mol·L－1的鹽酸），90℃回流8h，再用旋轉蒸發儀濃縮至干，殘渣用甲醇溶解，定容于100 mL量瓶中。精密吸取10mL，置于50mL量瓶中，用甲醇定容，0.45μm的微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.2.5 精密度實驗 精密吸取對照品溶液在同一天內重復進樣5次，連續測定3d，計算日內、日間標準差，結果表明，日內及日間標準差均小于2%，說明本法比較穩定，重復性好。

2.2.6 重復性實驗 精密稱定5份樣品，按2.2.4項方法制成供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件測定鞣花酸含量，平均含量為89.30mg·g－1，RSD為1.43%，表明本方法重復性符合分析要求。

2.2.7 穩定性實驗 取供試品溶液，分別于0，2，4，6，12，24，36和48h迸樣測定，以峰面積計算，考察其48h內穩定性。結果RSD為1.26%，表明樣品溶液在48h內穩定。

2.2.8 加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的樣品細粉適量，加入定量的沒食子酸對照品溶液，按2.1.4項方法制備溶液和測定，計算回收率，9次測得沒食子酸回收率為99.89%，RSD為1.43%，表明分析方法準確，見表2。

表2 鞣花酸加樣回收實驗結果Tab.2 The results of recovery tests of ellagic acid （n＝9）

2.3 石榴皮中總多酚的含量測定

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對照品5.5mg，置于100mL棕色量瓶中，蒸餾水溶解至刻度，搖勻。制成每1mL含沒食子酸0.055mg的溶液，作為對照品溶液。

2.3.2 標準曲線的繪制 精確吸取上述沒食子酸對照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，3.0和3.5mL，置于25 mL棕色量瓶中，分別加入磷鉬鎢酸試液1mL，再分別加水10.5，10，9.5，9，8和7.5mL，用290g·L－1碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30min，以相應的試劑為空白，照紫外－可見分光光度法在760nm波長處測定吸光度［12］，以吸光度A和質量濃度C進行線性回歸，得回歸方程：A＝0.096 9 C＋0.060 8，r＝0.999 9（n＝6），沒食子酸在1.10～7.70μg·mL－1范圍內線性關系良好。

2.3.3 供試品溶液的制備 稱取20g石榴皮粉末，置于1 000mL圓底燒瓶中，加入體積分數60%乙醇200mL，回流提取1h，過濾，真空濃縮，得石榴皮總多酚提取物，蒸餾水定容至100mL，精密吸取1mL稀釋至25mL，精密吸取2mL溶液，置于25mL棕色量瓶中，加入磷鉬鎢酸試液1mL，加水9mL，用290g·L－1碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min，以相應的試劑為空白，照紫外－可見分光光度法在760nm波長處測定吸光度。

2.3.4 精密度實驗 精密吸取對照品溶液，在同一天內重復進樣5次，連續測定3d，計算日內、日間標準差，結果表明，日內及日間標準差均小于2%，說明本法比較穩定，重復性好。

2.3.5 重復性實驗 精密稱定5份樣品，按2.3.3項方法制成供試品溶液，測定總多酚含量，平均含量為179.80mg·g－1，RSD為1.23%，表明本方法重復性符合分析要求。

2.3.6 穩定性實驗 取供試品溶液，分別于0，2，4， 6，12，24，36和48h迸樣測定，以峰面積計算，考察其48h內的穩定性。結果RSD為1.43%，表明樣品溶液在48h內穩定。

圖1 HPLC圖A.沒食子酸對照品；B.供試品1；C.鞣花酸對照品；D.供試品2Fig.1 HPLC chromatogramsA.standard solution of gallic acid；B.test samples 1；C.standard solution of ellagic acid；D.test samples 2

2.4 實驗結果 新疆氣候干燥、光照時間充足，石榴產量較大，品種較多，我們采集了新疆石榴產量較大的13個品種，通過分別測定石榴皮中沒食子酸、鞣花酸、總多酚的含量，利用綜合評分篩選出最優石榴皮品種，綜合評分如下：石榴皮的綜合評分＝鞣花酸／最大鞣花酸×30＋沒食子酸／最大沒食子酸×30＋總多酚／最大總多酚×40，結果見表3。

表3 不同產地的石榴皮中有效成分的含量測定及綜合評分Tab.3 The content and comprehensive score of effective components in pomegranate peel from different regions

由表3可以看出，新疆不同地區出產的石榴皮中沒食子酸的含量差異較大，喀什市葉城縣酸石榴皮中沒食子酸的含量最高，達到4.64mg·g－1，和田皮亞曼石榴皮中沒食子酸的含量最低，只有1.30 mg·g－1，同一地區酸石榴比甜石榴沒食子酸含量高。石榴皮中鞣花酸的含量較高，喀什市酸石榴皮中鞣花酸含量高達104.5mg·g－1，石榴皮中總多酚以阿圖什松他克鄉酸石榴含量最高，達到185.02 mg·g－1，石榴皮中總多酚、沒食子酸、鞣花酸均是同一地區酸石榴高于甜石榴，提示酸石榴口感較差可能與石榴中鞣質含量較高有關。

通過對新疆不同石榴品種皮中沒食子酸、鞣花酸、總多酚進行測定和綜合評分比較，酸石榴評分均高于甜石榴，喀什市酸石榴皮綜合評分最高，表明喀什市酸石榴皮中鞣質含量較高，和田皮亞曼石榴皮綜合評分最低，皮中鞣質含量最低。

3 討論

本實驗比較了新疆不同產地的酸、甜石榴皮中有效成分，選取沒食子酸、鞣花酸、總多酚為指標，采用綜合評分法進行篩選，結果表明，不同石榴品種皮中有效成分存在差異，這主要與每一地區的光照、氣候、雨水以及田間管理可能有關。

曾嘗試用甲醇或丙酮提取石榴皮中沒食子酸，用乙腈－1mL·L－1磷酸（10∶90）、甲醇－1mL·L－1磷酸（8∶92）、甲醇－四氫呋喃－冰乙酸－水（0.1∶0.5∶2∶97.4）、甲醇－0.5mL·L－1磷酸（5∶95）等溶劑系統作流動相，結果分離度較差，干擾峰較多，采用水與乙醚進行提取，甲醇－2mL·L－1磷酸（3∶97）作為流動相進行分離，結果干擾峰較少，分離度較好，方法重復性好，測定結果穩定、可靠。

通過綜合評分篩選出喀什市酸石榴皮評分最高，和田市皮亞曼石榴皮評分最低，酸石榴皮評分普遍比甜石榴皮高，酸石榴酸澀，鞣質含量較高于甜石榴。

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Screening of pomegranate peel from different regions in Xinjiang

CHANG Zhanying1，LIU Guihua2，CHEN Xueshan1，GAO Xiaoli1，Gulibahar KAWUL1＊（1.College of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China；2.Xinjiang Institute of Meteria Medica，Urumqi 830004，China）

Objective Through the comprehensive score method to screen the optimal pomegranate variety.Methods The gallic acid and ellagic acid contents were analyzed by HPLC；The total polyphenol content was analyzed by ultraviolet spectrophotometry.Results The linear range of gallic acid was 10.88－348μg·mL－1（r＝0.999 8），ellagic acid was 9.94－318μg·mL－1（r＝0.999 9），and gallic acid was 1.1－7.7μg·mL－1（r＝0.999 9）.Conclusion Through comprehensive evaluation pomegranate from Kashi city was selected.

pomegranate；gallic acid；ellagic acid；total polyphenol

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.04.009

R284

A

1004－2407（2015）04－0358－04

2014－02－18）

新疆醫科大學2013年科研創新基金（編號：XJC201305）

常占瑛，男，實驗師

＊通信作者：古麗巴哈爾·卡吾力，女，副教授