氟化鈉護(hù)齒涂劑的體外細(xì)胞毒性和家兔皮膚刺激性研究

黨 歡，王 濟(jì)，王鵬遠(yuǎn)，王曉娟（第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院藥劑科，軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710032）

氟化鈉護(hù)齒涂劑的體外細(xì)胞毒性和家兔皮膚刺激性研究

黨 歡，王 濟(jì)，王鵬遠(yuǎn)，王曉娟＊（第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院藥劑科，軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710032）

目的 氟化鈉護(hù)齒涂劑是用于口腔齲齒預(yù)防的制劑，本文對(duì)其體外細(xì)胞毒和對(duì)家兔皮膚的刺激性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。方法 遵照GB／T 16886.5－2003《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第5部分：體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)》中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)原則，采用濾膜擴(kuò)散法進(jìn)行氟化鈉護(hù)齒涂劑的體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)；遵照GB／T 16886.10－2005《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第10部分：刺激與遲發(fā)型超敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)》，采用家兔對(duì)氟化鈉護(hù)齒涂劑進(jìn)行皮膚刺激性評(píng)價(jià)。結(jié)果 體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氟化鈉護(hù)齒涂劑細(xì)胞毒性為1級(jí)，具有輕度細(xì)胞毒性；對(duì)家兔皮膚無(wú)明顯刺激。結(jié)論 氟化鈉護(hù)齒涂劑具有相對(duì)較低的毒性，可用于口腔齲齒的預(yù)防。

氟化鈉護(hù)齒涂劑；濾膜擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)；細(xì)胞毒性；刺激性

齲齒是一種嚴(yán)重影響人類(lèi)口腔健康的常見(jiàn)病和多發(fā)病，尤其是少年兒童的齲病發(fā)生率正在逐年上升。在國(guó)內(nèi)由于經(jīng)濟(jì)條件不佳及意識(shí)缺乏等原因，大部分齲齒得不到有效地治療，而在西方國(guó)家近年來(lái)齲齒的發(fā)病率已有了大幅下降。氟化物的應(yīng)用被認(rèn)為是多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)齲病明顯降低的重要原因［1］。在世界衛(wèi)生組織和口腔界權(quán)威機(jī)構(gòu)的推薦下，目前已有多種氟化物防齲技術(shù)在世界范圍內(nèi)被廣泛應(yīng)用，并取得了巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益［2］。氟保護(hù)劑是局部用氟防齲的方法之一，具有濃度低、操作簡(jiǎn)便、使用安全、高效、病人易于接受等優(yōu)點(diǎn)，在國(guó)內(nèi)外得到越來(lái)越多地關(guān)注和應(yīng)用［2－3］。

氟化鈉護(hù)齒涂劑的有效成分氟化鈉是一種用于齲齒前的材料，當(dāng)把本品涂抹在牙齒上時(shí)，能夠在牙齒表面形成一層薄膜，進(jìn)而形成一個(gè)持久的氟化鈣保護(hù)層，使附著在牙釉質(zhì)上的氟化鈉小球在幾個(gè)月內(nèi)持續(xù)分解釋放氟且滲透至牙齒深部，為牙齒提供長(zhǎng)期抵抗齲齒的保護(hù)。此外，氟化鈉能抑制某些口腔致病菌包括對(duì)變形鏈球菌葡萄糖的攝取、轉(zhuǎn)化和利用，從而影響胞外多糖的合成、胞內(nèi)多糖的貯存，干擾細(xì)菌和菌斑在牙面上的堆積和黏附［4］。

本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)氟化鈉護(hù)齒涂劑間接接觸哺乳類(lèi)細(xì)胞后其生物學(xué)反應(yīng)，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察動(dòng)物長(zhǎng)時(shí)間外敷氟化鈉護(hù)齒涂劑后，是否有局部不良反應(yīng)的發(fā)生，以期為臨床廣泛應(yīng)用提供借鑒和指導(dǎo)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（Thermo Electron公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）；倒置光學(xué)顯微鏡（美國(guó)Nikon公司）；直徑約45mm孔徑0.45μm的醋酸纖維素濾膜（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；直徑60mm的組織培養(yǎng)皿（上?？婆d商貿(mào)有限公司）。

1.2 試藥 氟化鈉護(hù)齒涂劑，注冊(cè)證號(hào)：陜食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2009第2630139；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；胰蛋白酶和青鏈霉素混合液購(gòu)自北京Solarbio公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；琥珀酸脫氫酶染色液購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司。

1.3 細(xì)胞系 小鼠成纖維細(xì)胞L929購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)組織工程中心。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 濾膜擴(kuò)散法測(cè)氟化鈉護(hù)齒涂劑體外細(xì)胞毒性濾膜擴(kuò)散法測(cè)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)是通過(guò)體外培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞ATCC CCL（NCTC clone 929），用于細(xì)胞毒性定性評(píng)價(jià)的一種方法，具有準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)是將護(hù)齒涂劑通過(guò)醋酸纖維素濾膜與特定的細(xì)胞系接觸，檢測(cè)其非特異性細(xì)胞毒性，評(píng)價(jià)其對(duì)細(xì)胞的毒性作用程度。

2.2 培養(yǎng)基、樣品及對(duì)照材料的制備 瓊脂培養(yǎng)基的配制：將已滅菌的瓊脂在水浴中加熱至100℃，冷卻至48℃。將一份瓊脂與一份新配制的預(yù)熱至48℃的2×生長(zhǎng)培養(yǎng)基（含有2×抗生素和體積分?jǐn)?shù)20%小牛血清）混合，使瓊脂培養(yǎng)基的最終濃度為1 ×生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

浸提液制備：浸提介質(zhì)含體積分?jǐn)?shù)10%血清的細(xì)胞培養(yǎng)液。浸提比例：每0.1g樣品加1mL浸提介質(zhì)。浸提條件：37℃，24h。實(shí)驗(yàn)樣品：吸取0.1 mL浸提液，置于直徑約5mm的醫(yī)用明膠海綿載體上。陰性對(duì)照：選用直徑約5mm、厚約1mm的高密度聚乙烯圓片，樣本表面光滑；陽(yáng)性對(duì)照：選用直徑約5 mm、體積分?jǐn)?shù)20%的苯酚溶液浸濕的濾紙片，樣本表面光滑；空白對(duì)照：含單層細(xì)胞但無(wú)實(shí)驗(yàn)材料的濾膜。

2.3 實(shí)驗(yàn)步驟

①細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期末，用培養(yǎng)基配成2.5× 105／mL懸液。

②培養(yǎng)皿底部放置滅菌的醋酸纖維素膜（孔徑0.45μm，無(wú)表面活性劑），吸取混合均勻的細(xì)胞懸液6mL，水平轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使細(xì)胞均勻分散。另一皿加不含細(xì)胞的培養(yǎng)液6mL作空白對(duì)照。置于37±2℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

③吸取保存在48℃新制備的瓊脂培養(yǎng)基5mL于足夠數(shù)量新的空培養(yǎng)皿，并在室溫使其凝固。

④從經(jīng)過(guò)24h培養(yǎng)含醋酸纖維素濾膜的平皿中吸除多余的培養(yǎng)液，用37±2℃的磷酸鹽緩沖液清洗濾膜。取出濾膜，放于瓊脂培養(yǎng)基表面，細(xì)胞面朝下。

⑤在每一平皿的濾膜上放4個(gè)試樣（其中試樣組放置3個(gè)樣品及1個(gè)陰性對(duì)照），置于37±2℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24h（應(yīng)保證試樣與濾膜表面緊密接觸）。培養(yǎng)24h后評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性。

⑥ 孵育后，去除試樣，輕輕將濾膜與瓊脂分開(kāi)，取出濾膜。

⑦用琥珀酸脫氫酶染色液浸泡濾膜，37℃下培養(yǎng)3h。

⑧用100ml·L－1中性甲醛溶液浸泡15min，以固定細(xì)胞。用蒸餾水沖洗濾膜，空氣中干燥。

2.4 濾膜擴(kuò)散法細(xì)胞毒性評(píng)價(jià) 結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 濾膜擴(kuò)散法實(shí)驗(yàn)結(jié)果與細(xì)胞毒性分級(jí)的關(guān)系Tab.1 Relation about filter membrane diffusion result and cell cytotoxicity grade

2.5 家兔皮膚刺激性實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)采用家兔皮膚局部給藥，觀察受試皮膚長(zhǎng)時(shí)間接觸氟化鈉護(hù)齒涂劑所產(chǎn)生的不良反應(yīng)。該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)認(rèn)證審核通過(guò)。

2.5.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭大白兔3只，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雄性，體質(zhì)量控制在2.5～3.0kg，一級(jí)動(dòng)物，許可證號(hào)為SCXK－（軍）2012－0007。實(shí)驗(yàn)前將3只實(shí)驗(yàn)用兔置于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房環(huán)境中喂養(yǎng)3d以適應(yīng)環(huán)境，給予同質(zhì)同量飲水。

2.5.2 給藥方法 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前1d，分別將3只實(shí)驗(yàn)兔背部脊柱兩側(cè)去毛、備皮，面積均為5cm×15cm。取氟化鈉護(hù)齒涂劑約5g，以雞蛋清適量調(diào)勻，均勻涂抹在每只兔脊柱一側(cè)前部的皮膚上，后部涂雞蛋清作為對(duì)照。在每只兔脊柱的另一側(cè)前部的皮膚上涂雞蛋清作為對(duì)照，后部涂以雞蛋清調(diào)勻的氟化鈉護(hù)齒涂劑。每天涂抹1次，保持4h，連續(xù)涂抹14d。從第2天開(kāi)始，每次涂藥前均先剪毛，對(duì)照區(qū)和實(shí)驗(yàn)區(qū)同樣處理。

2.5.3 家兔皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià) 受試動(dòng)物涂藥后4h，以溫?zé)?g·L－1氯化鈉溶液清洗對(duì)照區(qū)和實(shí)驗(yàn)區(qū)，靜置實(shí)驗(yàn)兔1h，肉眼觀察對(duì)照區(qū)和實(shí)驗(yàn)區(qū)的皮膚改變。根據(jù)表2皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分，計(jì)算各只動(dòng)物每天的最高積分。

表2 皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分Tab.2 Skin irritation scores

按以下公式計(jì)算各只動(dòng)物每天平均積分，按表3判定皮膚刺激強(qiáng)度。

表3 皮膚刺激強(qiáng)度分級(jí)Tab.3 Skin irritation intensity grade

2.5.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)后，均以建立數(shù)據(jù)庫(kù)形式，錄入統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0，計(jì)量資料采用Student－t檢驗(yàn)。假設(shè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞毒性反應(yīng)為3級(jí)，重度細(xì)胞毒性；空白對(duì)照組細(xì)胞毒性反應(yīng)為0級(jí)，無(wú)細(xì)胞毒性；陰性對(duì)照組細(xì)胞毒性反應(yīng)為0級(jí)，無(wú)細(xì)胞毒性；陽(yáng)性對(duì)照組、空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的反應(yīng)符合規(guī)定，本實(shí)驗(yàn)成立。實(shí)驗(yàn)樣品組細(xì)胞毒性反應(yīng)為1級(jí)，輕度細(xì)胞毒性。見(jiàn)圖1。

圖1 濾膜擴(kuò)散法測(cè)氟化鈉護(hù)齒涂劑細(xì)胞毒性琥珀酸脫氫酶染色前后A.陽(yáng)性對(duì)照；B.空白對(duì)照；C.陰性對(duì)照；D.樣品Fig.1 The cytotoxicity of Sodium Fluoride Varnishes tested by a filter membrane diffusion assay before and after succinate dehydrogenase dyedA.positive control；B.blank control；C.negative control；D.sample

3.2 家兔皮膚刺激性實(shí)驗(yàn) 結(jié)果見(jiàn)表4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氟化鈉護(hù)齒涂劑涂敷于家兔背部4h／次，連續(xù)2周，無(wú)1只出現(xiàn)水腫。每只動(dòng)物實(shí)驗(yàn)區(qū)總積分為0.429±0.242，每只動(dòng)物每天積分為0.031±0.017，而對(duì)照區(qū)分別為0.333±0.346和0.024±0.025，兩者比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明氟化鈉護(hù)齒涂劑局部較長(zhǎng)時(shí)間涂敷對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚無(wú)明顯刺激。

表4 氟化鈉護(hù)齒涂劑對(duì)家兔皮膚長(zhǎng)時(shí)間刺激性實(shí)驗(yàn)評(píng)分Tab.4 Rabbits skin irritation test scores of Sodium Fluoride Varnishes

4 討論

齲齒是在以細(xì)菌為主的多因素影響下，牙齒硬組織發(fā)生慢性進(jìn)行性破壞的一種疾病。兒童齲齒是常見(jiàn)的兒童口腔疾病，病變主要以牙齒脫礦為主。菌斑中未解離的乙酸與乳酸形成H＋的儲(chǔ)備庫(kù)，H＋可使Ca2＋自晶格內(nèi)移走，導(dǎo)致牙齒硬組織脫礦［5］。

氟保護(hù)劑是濃度較低的含氟涂劑之一，適合各年齡段的齲齒預(yù)防，是世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的兒童群體防齲的適宜技術(shù)之一［6］。它不僅能夠減少牙釉質(zhì)脫礦［7］，增加牙釉質(zhì)的再礦化［8］，牙釉質(zhì)表面高濃度的氟也可導(dǎo)致氟化鈣的沉積，增加牙釉質(zhì)的表面硬度，提高牙齒的抗腐蝕能力［9］；同時(shí)沉積的氟化鈣可以在牙釉質(zhì)－菌斑界面緩慢溶解并持續(xù)釋放氟離子，還能夠有效地抑制口腔唾液變形鏈球菌的生長(zhǎng)和代謝，抑制并減少牙菌斑的形成［10］。

氟保護(hù)劑具有較高的安全性。Murray J J等［11］通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了氟保護(hù)劑安全可靠、不良反應(yīng)少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和家兔的皮膚刺激實(shí)驗(yàn)［12－15］也證明了其較高的安全性。本實(shí)驗(yàn)采用醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中推薦的間接細(xì)胞毒性測(cè)定法即濾膜擴(kuò)散法［16］來(lái)進(jìn)行氟化鈉護(hù)齒涂劑的體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)，操作簡(jiǎn)便，穩(wěn)定可靠。

目前，我國(guó)關(guān)于氟保護(hù)劑方面的研究報(bào)告仍然較少，臨床使用范圍局限，濃度單一，不具有代表性，并且都是由專(zhuān)業(yè)人員負(fù)責(zé)完成涂氟工作。期待隨著科學(xué)研究及臨床研究的深入，氟保護(hù)劑能深入到社區(qū)和學(xué)校等范圍內(nèi)進(jìn)行大規(guī)模的推廣使用，從而有效降低我國(guó)少年兒童齲病的發(fā)生率。

［1］Wong M C，Schwarz E，Lo E C.Patterns of dental caries severity in Chinese kindergarten children［J］.Community Dent Oral Epidemiol，1997，25（5）：343－347.

［2］Beltran－Aguilar E D，Goldstein J W，Lockwood S A.Fluoride varnish：a review of their clinical use，cariostatic mechanism，efficacy and safety［J］.J Am Dent Assoc，2000，131（5）：589－596.

［3］唐莉紅，袁爽，施樂(lè).氟保護(hù)漆預(yù)防齲齒研究進(jìn)展［J］.上海預(yù)防醫(yī)學(xué)，2013，25（7）：413－414.

［4］卞金有.口腔預(yù)防醫(yī)學(xué)［M］.3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：110－112.

［5］Autio－Gold J T，Courts F.Assessing the effect of fluoride varnish on early enamel carious lesions in the primary dentition［J］.J Am Dent Assoc，2001，132（9）：1247－1253.

［6］Bawden J W.Fluoride varnish：a useful new tool for public health dentistry［J］.J Public Health Dent，1998，58（4）：266－269.

［7］Hu W，F(xiàn)eatherstone J D.Prevention of enamel demineralization：an in－vitro study using light－cured filled sealant［J］.Am J Orthod Dentofacial Orthop，2005，128（5）：592－600.

［8］Sawyer K K，Donly K J.Remineralization effects of a sodium fluoride bioerodible gel［J］.Am J Dent，2004，17（4）：245－248.

［9］Munshi A K，Reddy N N，Shetty V.A comparative evaluation of three fluoride varnishes：an in－vitro study［J］.J Indian Soc Pedod Prev Dent，2001，19（3）：92－102.

［10］Johnson G，Almqvist H.Non－invasive management of superficial root caries lesions in disabled and infirm patients［J］.Gerodontology，2003，20（1）：9－14.

［11］Murray J J，Rugg－gumn A J.Fluorides in caries prevention［D］.Oxford OUP，2003，3：187－192.

［12］Hoang－Dao B T，Tu H H，Hung L T，et al.Evaluation of a natural resin－based new material（Shellac F），as a potential desensitizing agent［J］.Dental material，2008，24：1001－1007.

［13］胡志飛，李勤，李鵬.中藥美膚散對(duì)家兔皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)報(bào)告［J］.西南國(guó)防醫(yī)藥，2013，23（7）：785－786.

［14］王堅(jiān)成，劉曉巖，呂萬(wàn)良，等.新型阿霉素抗耐藥性隱形脂質(zhì)體的體外細(xì)胞毒和體內(nèi)毒性研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2005，40（5）：475－480.

［15］李得堂，唐洪梅，蔡慶群，等.療筋涂膜劑的皮膚給藥安全性評(píng)價(jià)［J］.西北藥學(xué)雜志，2011，26（2）：118－120.

［16］王昕，施燕平，朱雪濤.濾膜擴(kuò)散法測(cè)試齒科美白劑的細(xì)胞毒性［J］.齊魯藥事，2006，25（2）：99－100.

In vitro cytotoxicity and rabbit skin irritation of Sodium Fluoride Varnishes

DANG Huan，WANG Ji，WANG Pengyuan，WANG Xiaojuan＊（State Key Laboratory of Military Stomatology，Department of Pharmacy，Stomatology Hospital，the Fourth Military Medical University，Xi′an 710032，China）

Objective Sodium Fluoride Varnish was used for caries prevention.Its cytotoxicity in vitro and rabbit skin irritation were evaluated in this study.Methods According to the experimental principle of national biological appraising standard on medical apparatus，the in vitro cytotoxicity was tested by a filter membrane diffusion method and the safety of Sodium Fluoride Varnish was evaluated by rabbit skin irritation test.Results Sodium Fluoride varnish had mild cell toxicity and no obvious skin irritation was observed on rabbits.Conclusion Sodium Fluoride Varnish had a relatively low toxicity and was appropriate for caries prevention.

Sodium Fluoride Varnishes；filter membrane diffusion test；in vitro cytotoxicity；irritation

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.04.019

R965

A

1004－2407（2015）04－0386－04

2015－03－10）

黨歡，女，碩士研究生

＊通信作者：王曉娟，女，主任藥師，教授，碩士生導(dǎo)師