NF-κB在胃癌組織中的表達與臨床病理的相關性研究

趙 煜 曾 杰

四川省人民醫院急診外科，四川成都 610072

我國胃癌的新發病例數和胃癌死亡率居惡性腫瘤之首，其發生、發展機制尚未完全明確。大約65%胃癌患者確診時已經出現局部或遠處轉移[1]。 故侵襲與轉移的機制成為胃癌研究的重要方向， 研究顯示，細胞信號轉導在腫瘤的發生、發展中起重要作用[2]。 NFκB 是一種細胞核內信號轉導的重要因子， 活化的NF-κB 能靶向調控腫瘤相關基因的轉錄[3]。NF-κB 與腫瘤發生發展關系密切， 但與胃癌的關系研究不多。我們通過免疫組化法分析NF-κB 在胃癌組織中的表達，探討其作為判斷胃癌預后指標的臨床意義，現將材料歸納如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2004 年1 月～2009 年1 月四川省人民醫院病理科收治的50 例胃癌根治標本， 其中男38 例，女12 例，年齡30～78 歲；高、中分化23 例，低、未分化27例；有淋巴結轉移32 例，無淋巴結轉移18 例；腫瘤直徑≥5 cm 者33 例，＜5 cm 者17 例； 患者術前均未接受放療和化療。 另取同期50 例非腫瘤患者胃黏膜組織作為對照，其中男35 例，女15 例，年齡30～75 歲。所有患者性別、年齡等一般資料比較差異無統計學意義（P ＞0.05），具有可比性。

1.2 實驗材料

RAW 264.7 細胞株（中國科學院上海細胞所產品）；重組質粒NF-κB 熒光素酶（NF-κB-LUC）（美國國立癌癥研究所提供）；Lipofectamine 2000 轉染試劑（美國Invitmgen 公司產品）；熒光素酶分析試劑（美國Promega公司產品）兔抗大鼠NF-κB p65 抗體一抗（武漢博士德）。 SA-1022 山羊抗兔IgG 二抗SABC 免疫組化試劑盒（武漢博士德）；核-胞漿蛋白制備試劑盒（Pierce公司）。

1.3 檢測方法

1.3.1 標本處理 RAW 264.7 細胞在37℃、5%CO2的條件下，在含10%小牛血清的RPMI 1640 培養基（GIBCO-BRL）中貼壁生長。用Lipofectamine 2000 介導NFκB-LUC 質粒轉染RAW 264.7 細胞。首先采集兩組研究對象的靜脈血標本，采集量為80 mL，分別取4.0 mL置于乙二胺四乙酸（EDTA）試管及BD 試管。將EDTA試管中血液樣本進行處理，以PBS 液進行混合，再以淋巴細胞液加入并離心，3500 r/min， 離心15 min，取上清液進行檢測，去沉淀物，然后以核-胞漿蛋白制備試劑盒進行檢測，依次再進行細胞胞漿提取液（CERI）加入、震蕩、冰浴，再進行CERI 加入、震蕩、冰浴及離心，取胞漿冷藏，沉淀層反復進行上述處理4 次，后離心進行上清液冷藏。

1.3.2 組織芯片的制備及免疫組化染色處理 由兩名資深病理科醫師進行相應的處理，將空白石蠟芯片放入組織，然后以鼠組織定位，并連續切片，后貼在載玻片上以HE 染色進行對照。 以SP 免疫組化染色試劑盒及DAB 酶底物顯色劑對標本進行染色處理， 嚴格按照說明書進行操作。

1.3.3 判斷標準NF-κB 主要在細胞漿內陽性表達，顏色成棕黃色。 每張切片隨機選取10 個視野（400 倍鏡下）,每個視野下計數100 個細胞。另以陽性細胞所在比例≥40%和＜40%分別表示高表達和低表達。

1.4 統計學方法

采用SPSS 16.0 統計學軟件進行數據分析， 計數資料用率表示， 組間比較采用χ2檢驗， 等級資料用Spearman 等級相關分析，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織、 癌旁組織和非腫瘤患者胃黏膜組織中NF-κB 的表達比較

胃癌組織、癌旁組織和非腫瘤患者胃黏膜組織中NF-κB 蛋白的表達, 表達陽性率分別為76.0%（38/50）、4.0%（2/50）和16.0%（8/50），三者相比差異均有統計學意義（P ＜0.05）。其中，胃癌組織與癌旁組織比較差異有統計學意義（χ2=20.404，P=0.000）；胃癌組織與正常胃黏膜組織比較差異有統計學意義 （χ2=43.51l，P=0.000）；癌旁組織與正常胃黏膜組織比較差異有統計學意義（χ2=6.655，P=0.010）。 見圖1（封三）。

圖1 不同胃黏膜組織中NF-κB 的表達（SP 染色，400×）

2.2 NF-κB 表達與胃癌患者臨床病理特征關系的比較

50 例胃癌組織中NF-κB 的表達與脈管侵犯呈正相關（r=0.318，P=0.002），與淋巴結轉移呈正相關（r=0.243，P=0.035），當腫瘤直徑＜5 cm 時，與腫瘤大小呈正相關（r=0.315，P=0.002），與浸潤程度呈正相關（r=0.350，P=0.001），與分化程度無相關性（r=0.119，P=0.242）。不同淋巴結轉移、浸潤程度、脈管侵犯情況的胃癌患者NF-κB 陽性表達例數比較， 差異均有統計學意義（P ＜0.05）。 見表1。

2.3 不同NF-κB 表達情況者5 年生存率比較分析

研究顯示，胃癌組織低表達的16 例患者中，達到5 年生存率的占68.75%（11/16），高表達的22 例患者中， 達到5 年生存率的占27.27%（6/22） NF-κB 低表達者的5 年生存率顯著高于高表達者（χ2=14.642，P ＜0.05），5 年生存率與NF-κB 表達關系分析結果顯示5 年生存率與NF-κB 表達呈負相關 （r=-0.337，P=0.003）。

3 討論

越來越多的證據表明，NF-κB 與腫瘤的發生有密切的關系，目前已證明在乳腺癌、甲狀腺癌、T 或B淋巴細胞白血病、 結腸癌及幾種病毒誘導的腫瘤中，均存在NF-κB 活性高表達[5-7]。 胃腺癌在男性常見癌癥中位于第4 位，在女性中為第5 位，并且與慢性炎癥密切相關[8]。 目前普遍認為幽門螺桿菌在胃炎到胃癌的惡性轉化過程中發揮重要作用， 但僅有約l%感染人群最終轉變為胃癌[9]。 這種差異的出現可能是因為受到局部炎癥因子的遺傳易感性的影響。幽門螺桿菌是慢性胃炎的主要病因，亦是第一類致胃癌因子[10]。幽門螺桿菌感染后，患者內皮細胞上的多種與癌通道受到影響，導致癌癥的發生，而這些受影響的指標即有NF-κB。 NF-κB 表達與胃癌發生的關系，目前報道較少，觀點也不一致。 研究發現幽門螺桿菌可以激活NF-κB，從而進一步導致胃癌的發生[11-12]。NF-κB 是一種能與免疫球蛋白κ 輕鏈基因增強子κB 序列特異性結合并調節其轉錄活性的核蛋白因子，其活化形式通常指NF-κB p65。 NF-κB 調控的基因參與了腫瘤的發生、血管生成和癌細胞的轉移，同時NF-κB 基因產物異常表達會導致腫瘤的發生[13]。NF-κB 在腫瘤中的異常狀態與癌細胞的凋亡密切相關， 而TLR4/NFκB 又與炎性及免疫應激有一定的關系， 通過通路與抗炎免疫機制密切相關，該通路的MYD 88 依賴和非依賴兩條途徑發揮作用， 形成相輔相承的信號轉導過程[14]。 TLR4 受體的激活所需的四種蛋白又與上述指標相關，并對炎癥細胞，尤其是促炎細胞產生影響，對其表達狀態產生一定的影響作用[15]。 相關研究認為，NF-κB p65 對于胃癌的早期診斷有較高的價值，主要與其在此類患者早期組織中的表達狀態有關，且其表達越高則患者生存率越高[16]，另外其與患者治療后的生存期也密切相關，因此臨床認為可將其作為胃癌預后的重要了解及監測指標[17]。有研究表明NF-κB轉錄因子亞單位的結合位點在TFF3 的5′端區域。TFF3 可通過IKK 短暫激活NF-κB 的炎性應激反應，并進一步影響Twist 蛋白，兩者相互抑制，從而抑制炎癥及腫瘤發生發展的過程[18-19]。

表1 胃癌組織臨床病理特征與NF-κB 的表達的關系（例，n=50）

本實驗采用免疫組化法檢測了胃癌組織和癌旁肺組織中NF-κB 的表達，結果提示，在胃癌組織中，NF-κB 陽性表達明顯高于癌旁組織， 提示NF-κB 表達可能與胃癌發生有關。 本實驗還發現NF-κB 表達陽性率越高，淋巴轉移率越高，預后也越差。有針對性地選擇其活化途徑的不同水平層次進行選擇性調控NF-κB 的活性，可以從基因水平上防治胃癌，是抗癌藥物設計的一個很好的靶點，為臨床治療胃癌提供一條新的途徑。 NF-κB 是一種多項多功能核轉錄因子，其調節許多重要的生理過程，包括細胞生長、凋亡和腫瘤形成，同時可能影響腫瘤的血管形成，促進腫瘤的生長浸潤和轉移[20]。 本研究結果顯示NF-κB 的表達與脈管侵犯，淋巴結轉移、腫瘤大小呈正相關，與分化程度無相關性。

綜上所述，NF-κB 陽性表達與胃癌的侵襲、轉移密切相關， 檢測NF-κB 的表達對胃癌病情監測及轉移潛能及預后估計等方面有重要參考價值。

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