利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術對涂陰肺結核診斷價值的評價

譚英征 陳雙華 龍云鑄 李 丹 傅京力 周杜鵑 傅金球

1.湖南省株洲市中心醫院感染內科，湖南株洲 412007； 2.湖南中醫藥高等專科學校，湖南株洲 412012

近年來，結核患者日益增多，目前肺結核的實驗診斷主要應依靠痰涂片找抗酸桿菌、結核菌素皮膚試驗（tuberculin skin test，TST）及痰培養。 因痰涂片對痰液標本內結核桿菌含量要求高，達到一定濃度方能檢測陽性，涂陰肺結核患者往往因為痰涂片抗酸染色陰性，臨床上不易早期發現，常被延誤治療。TST 是個操作簡單、方便、快捷的篩查結核的免疫學方法，在臨床上應用廣泛，但有較高的假陽性和假陰性率，對結核感染與卡介苗接種后感染無法鑒別，降低了它的臨床價值[1]。痰液結核桿菌培養是診斷結核病的金標準，但結核桿菌生長緩慢，培養周期長，且對實驗室生物安全級別要求高，故傳統的臨床診斷涂陰肺結核試驗方法有限。因此，尋找一種能快速、敏感診斷涂陰肺結核的實驗技術十分重要。

利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增（Xpert MTB/RIF） 檢測技術對結核桿菌具有較高的敏感性和特異度[2]。本研究通過對131 例涂陰肺結核和123 例其他肺病患者進行Xpert MTB/RIF 檢測， 探討Xpert MTB/RIF 在涂陰肺結核快速、早期診斷中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2014 年6～12 月到株洲市中心醫院（以下簡稱“我院”）結核門診就診患者為研究對象。 入選涂陰肺結核患者131 例 （涂陰肺結核患組）， 年齡18～82歲，平均（41.2±15.3）歲；肺結核確診患者114 例（肺結核確診組），年齡21～79 歲，平均（39.6±16.5）歲；其他肺病患者123 例（其他肺病組），年齡17～78 歲，平均（40.4±17.5）歲。 該研究經我院醫學倫理委員會批準，所有參與研究者均簽署了知情同意書。

1.2 診斷標準

1.2.1 入選標準 肺結核確診患者除有發熱、 咳嗽、咳痰、盜汗等臨床表現及影像學資料支持外必須有痰結核分枝桿菌培養結果。 涂陰肺結核診斷標準：①具有午后低熱、咳嗽、咯血、盜汗、乏力等典型肺結核臨床癥狀及肺部CT 表現者； ②痰涂片抗酸染色陰性者；③支氣管或肺部組織病檢支持結核性改變者；④診斷性抗結核治療2 個月后癥狀改善，復查CT 提示有好轉者[3]。

1.2.2 排除標準 ①影像學不典型者行支氣管鏡檢查或病理檢查明確為非結核感染者；②仍不能明確者行診斷性抗結核治療2 個月后癥狀及影像學病變無改善者。 ③常規行痰涂片、痰固體培養，排除結核感染者。

1.2.3 其他肺病者 包括肺病腫瘤（25 例）、普通肺炎（53 例）、支氣管擴張（15 例）、慢性阻塞性肺疾病（26例）肺部其他疾病（4 例）。

1.3 研究方法

對所有入選患者均進行TST、痰固體培養和Xpert MTB/RIF 檢測。TST 所用試劑購自北京高科技生命科技開發有限公司，痰固體培養基為羅氏培養基，由珠海貝索公司生產，Xpert MTB/RIF 儀器及試劑由美國Cepheid 公司研發生產，均在有效期內使用。 特異度=真陰性人數/（真陰性人數+假陽性人數）×100%；陽性預測值=真陽性人數/（真陽性人數+假陽性人數）×100%； 陰性預測值=真陰性人數/（真陰性人數+假陰性人數）×100%。

1.3.1 TST 試驗 吸取試劑5 U（0.1 mL）注入前臂內側上中1/3 交界處皮內，形成皮丘。 經72 h 觀察注射部位反應，考慮到現代人卡介苗接種率高，本研究以硬結的橫徑及縱徑平均≥10 mm 為陽性。

1.3.2 痰固體培養 痰培養采用4%氫氧化鈉處理分離培養。吸取痰標本到前處理管中，加入4%氫氧化鈉前處理液充分混勻， 靜置15 min 后取吸管吸取前處理液均勻接種在培養基斜面上，觀察培養情況，記錄生長結果[4-5]。

1.3.3 Xpert MTB/RIF 檢測 取1 mL 痰液標本與含氫氧化鈉及異丙醇的處理液按1∶2 比例混合，在渦旋震蕩器上震蕩15～30 s， 室溫靜置15 min。 取混合液2 mL 轉移至一次性多室塑料反應盒中， 然后將反應盒放置到檢測模塊中， 儀器進行自動化分析， 約2 h后可讀取結果[6]。

1.4 統計學方法

采用SPSS 13.0 統計學軟件進行數據分析， 計量資料數據用均數±標準差（s）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Xpert MTB/RIF 在肺結核確診組與其他肺病組的檢測情況比較

通過檢測發現Xpert MTB/RIF 檢測在肺結核確診組中為82.45%（94/114），在其他肺病組中為0.81%（1/123）， 肺結核確診組中Xpert MTB/RIF 檢測陽性率明顯高于其他肺病組，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。 Xpert MTB/RIF 檢測對肺結核確診組的陽性預測值為98.95%（94/95），陰性預測值85.92%（122/142）。

2.2 Xpert MTB/RIF、TST 在涂陰肺結核組與其他肺病組的檢測情況比較

涂陰肺結核組中Xpert MTB/RIF 檢測陽性率為80.92%（106/131），其他肺病組中Xpert MTB/RIF 檢測陽性率為0.81%（1/123）。涂陰肺結核組中Xpert MTB/RIF 檢測陽性率明顯高于其他肺病組，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。 涂陰肺結核組中TST 檢測陽性率為64.89%（85/131）， 與涂陰肺結核組中Xpert MTB/RIF 檢測陽性率80.92%比較， 明顯低于涂陰肺結核組中Xpert MTB/RIF 檢測陽性率， 差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。Xpert MTB/RIF 檢測對涂陰肺結核的陽性預測值為99.07%（106/107）， 陰性預測值83.00%（122/147）。 見表1。

表1 兩組Xpert MTB/RIF、TST 檢測結果（例）

2.3 Xpert MTB/RIF、痰培養在涂陰肺結核與其他肺病組的檢測情況比較

涂陰肺結核組中Xpert MTB/RIF 檢測陽性率為80.92%（106/131），痰培養檢測陽性率為71.76%（94/131）。涂陰肺結核組中Xpert MTB/RIF 檢測陽性率明顯高于痰培養檢測陽性率，差異有統計學意義（P ＜0.05）。涂陰肺結核組中Xpert MTB/RIF 檢測特異度為99.19%（122/123），與涂陰肺結核組中痰培養檢測特異度100.00%（123/123）相比，差異無統計學意義（P ＞0.05）。 見表2。

表2 兩組Xpert MTB/RIF、痰培養檢測結果（例）

3 討論

肺結核是世界上致死率最高的傳染性疾病之一，隨著社會老齡化，肺結核患者逐年增加[7-9]。 目前我國肺結核實驗室常規檢查方法是痰涂片找抗酸桿菌，其耗時短、花費小，但檢查敏感度低、對標本含菌量高，致使很多涂陰肺結核患者漏診[10]。 痰培養結核桿菌是結核診斷的金標準[11]，但痰培養方法存在周期長、敏感度相對低，對實驗室的生物安全要求高，耗時長，不易普及[12]，造成涂陰肺結核臨床診斷困難、治療延誤。早診斷、 早治療涂陰肺結核患者對控制結核病的傳播、減少結核耐藥，具有十分重要的社會意義。因此臨床上亟需開發出一種快速、準確、安全的診斷方法。

Xpert MTB/RIF 檢測法是利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術， 采用Cepheid 公司GeneXpert檢測系統，針對rpoB 基因81bp 利福平耐藥核心區間（RRDR）設計引物、探針，檢測其是否發生突變[13]，它是將樣品的準備、 定量PCR 擴增和熒光檢測集于一體的核酸擴增檢測分析系統。 操作簡單，無需太多培訓，只需要在標本盒中加入待檢測標本，系統可自動完成標本純化、離心、DNA 提取、DNA 特異序列檢測，2 h 內便可得到檢測結果[14]，封閉性好，不易造成交叉污染，對涂陰肺結核患者的敏感度高[15]。 多中心研究證實Xpert MTB/RIF 檢測敏感度與特異度高、 耗時短，被世界衛生組織為遏制結核病推薦的檢驗方法[16]。本研究中對131 例涂陰肺結核組患者痰液予Xpert MTB/RIF 檢測，陽性率為80.92%（106/131），肺結核確診組中Xpert MTB/RIF 檢測陽性率為82.45%（94/114），兩者陽性率均高，差異無統計學意義（P ＞0.05）。其他肺病組中Xpert MTB/RIF 檢測陽性率為0.81%（1/123）。涂陰肺結核組中Xpert MTB/RIF 檢測陽性率明顯高于其他肺病組，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。提示Xpert MTB/RIF 檢測對肺結核患者有較高的敏感性。

TST 是結核感染診斷的一個重要參考指標[17]，將結核桿菌產物注入體表，如受試者感染了結核分枝桿菌，則形成超敏反應性炎癥，出現紅腫、硬結[18]。 臨床使用非常廣泛，但其特異性受到接種卡介苗和非結核分枝桿菌的影響，且有較多的假陰性，臨床意義有限[19]。 本研究中對涂陰肺結核組患者中行TST 檢測，陽性率為64.89%（85/131），與涂陰肺結核組中Xpert MTB/RIF檢測陽性率（80.92%）比較，明顯低于涂陰肺結核組中Xpert MTB/RIF 檢測陽性率，差別有統計學意義（P ＜0.01）。 Xpert MTB/RIF 檢測對肺結核確診組的陽性預測值為98.95%，陰性預測值為85.92%；對涂陰肺結核的陽性預測值為99.07%，陰性預測值為83.00%。說明對懷疑涂陰肺結核患者行Xpert MTB/RIF 檢測對診斷有較大幫助。痰結核桿菌培養是結核病診斷金標準，本研究中， 涂陰肺結核組中痰培養檢測陽性率為71.76%（94/131）， 與Xpert MTB/RIF 檢 測 陽 性 率[80.92%（106/131）]比較，痰培養檢測陽性率明顯低于Xpert MTB/RIF 檢測陽性率，差異有統計學意義（P ＜0.05）。涂陰肺結核組中Xpert MTB/RIF 檢測特異度高達99.19%（122/123），與涂陰肺結核組中痰培養檢測特異度[100.00%（123/123）]比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。 但痰培養對實驗室生物安全級別要求高，不能常規開展，且耗時長，培養周期為6～8 周，不利于患者的早期合理治療[20]。 Xpert MTB/RIF 檢測自動化程度高， 唯一手動操作就是將標本置入一次性標本盒內，檢測報告時間2 h，比痰培養節省甚多時間[21]。

Xpert MTB/RIF 檢測是一種簡便、快捷、準確的檢測方法[22]，綜合國內外的診治報道[23-27]進展，臨床應用高于TST、痰培養，可更好地輔助臨床醫師對涂陰肺結核患者進行早期診斷和治療， 為結核病的控制、預防提供了有力的幫助，值得臨床推廣。

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