基于克隆文庫技術分析瘤棘砂殼蟲的食物組成

王麗娜, 余 正, 田 野, 張文靜, 楊 軍

1 中國科學院城市環境研究所， 城市環境與健康重點實驗室， 水生態健康研究組, 廈門 361021 2 廈門大學海洋與地球學院, 廈門 361102 3 中國地質大學(武漢)環境學院, 武漢 430074 4 中國科學院大學, 北京 100049

基于克隆文庫技術分析瘤棘砂殼蟲的食物組成

王麗娜1,4, 余 正1,4, 田 野1,3, 張文靜2, 楊 軍1,*

1 中國科學院城市環境研究所， 城市環境與健康重點實驗室， 水生態健康研究組, 廈門 361021 2 廈門大學海洋與地球學院, 廈門 361102 3 中國地質大學(武漢)環境學院, 武漢 430074 4 中國科學院大學, 北京 100049

瘤棘砂殼蟲是東亞特有的原生動物，廣泛分布于長江與珠江中下游以及福建地區的湖泊和水庫，作為水生態系統的捕食者，在維持水生態系統的結構與功能方面發揮著重要作用。利用18S rRNA基因PCR擴增和克隆文庫測序等分子生物學技術方法，從基因水平研究瘤棘砂殼蟲的食物組成。結果表明：所獲得的46條序列在97%相似度水平含有11類OTUs(Operational taxonomic units，操作分類單元)，其中包括輪蟲6個，橈足類5個，說明瘤棘砂殼蟲的捕食類群以輪蟲和橈足類為主，同時也證明單細胞生物可以直接以多細胞的后生動物為食。此外，通過克隆文庫測序技術分析原生動物的食物組成比例，不僅是一種方便、高效、快速，重復性高的方法，同時也為分析原生動物的生態功能提供了一種新的視角。

18S rRNA基因; 克隆文庫; 砂殼蟲; 捕食; 原生動物

砂殼蟲(Difflugia)廣泛分布于世界各地，是淡水生境中豐度和多樣性最高的有殼蟲原生動物，特別是在湖泊水庫物質循環和能量流動等關鍵生態過程中發揮重要的作用。然而，長期以來對有殼蟲食性了解極為有限，并且以往的研究主要限于顯微鏡觀察，認為其主要以藻類和真菌為食物[1]。瘤棘砂殼蟲(Difflugiatuberspinifera)是東亞特有的淡水自由生原生動物，首次在中國貴州烏江渡被發現[2]，蟲體大小100—120 μm，廣泛分布于我國長江與珠江中下游以及福建地區的湖泊和水庫中[3-6]。近年來，韓博平等[6-7]首次報道瘤棘砂殼蟲以攝食水中的微小顆粒及輪蟲為主，說明單細胞生物可以捕食多細胞的后生浮游生物。事實上，原生動物是經典食物鏈與微食物網的關鍵連接點，因此，在維持水生態系統結構、功能等方面具有重要的地位和意義[8]。

目前國際學者對砂殼蟲的研究重點聚焦于形態學、分類學、生態學、系統發育等方面。楊軍等[3, 9]綜合運用現代分類學技術方法對瘤棘砂殼蟲進行了系統分類描述，利用X射線能譜儀分析淡水瘤棘砂殼蟲殼體元素，發現其殼體化學元素組成介于海洋和土壤有殼蟲之間；Wanner等[10]通過形態計量學方法，揭示了有殼蟲適應不同環境的各種機制；Gomaa等[11]基于SSU rRNA基因序列在分子水平上進一步確定砂殼蟲系統發育地位。韓博平等[6]基于顯微觀察首次發現瘤棘砂殼蟲能夠捕食輪蟲，這些研究結果都為砂殼蟲捕食特性的研究奠定了一定的基礎。近幾年，在福建多個水庫中發現大量瘤棘砂殼蟲，為了更清楚地了解瘤棘砂殼蟲的捕食習性和食物組成，首次嘗試將分子生物學技術引入到砂殼蟲食物組成的研究中。本研究采用構建克隆文庫的分子生物學方法分析砂殼蟲食物組成。通過采集樣品，分離活體瘤棘砂殼蟲，對總DNA提取，設計18S rRNA基因特異引物，構建克隆文庫并進行有效序列的分析，進而分析食物的物種組成。此方法操作簡單，試驗周期短，重復性好，為研究砂殼蟲攝食行為特點提供了新的研究手段。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2010年9月在廈門市湖邊水庫(24°30′N，118°09′E)水體表層水平及垂直方向上利用網孔直徑為64 μm的浮游生物網拖拽撈取樣品，將水樣轉入50 mL PVC瓶，并快速送至實驗室。在倒置顯微鏡下挑取瘤棘砂殼蟲蟲體，超純水清洗體表3—5次，以避免外源DNA的污染。選取50個個體裝入1.5 mL的無菌離心管中。置于-20 ℃保存，以備進行總DNA提取。

1.2 DNA提取

配制異硫氰酸胍法DNA提取液[12]，將瘤棘砂殼蟲轉移到含有100 μL DNA提取液的離心管中，輕微震蕩?；靹蚝?，置于65 ℃水浴鍋加熱10—30 min，利用無菌槍頭破碎蟲體。再加入100 μL異丙醇，震蕩混勻，置于4℃冰箱中沉淀過夜。次日，取出冰箱中的樣品，在4 ℃，14000 r/min條件下離心20 min，棄上清液。將預冷的250 μL 70%乙醇加入沉淀物DNA中，混勻漂洗，在4 ℃，14000 r/min條件下離心5 min，棄上清液。再加入250 μL無水乙醇洗滌DNA，在4 ℃，14000 r/min條件下離心5 min，棄上清液。將沉淀物置于無菌處風干1 min，加入適量蒸餾水溶解所提取的DNA，置于-20 ℃冰箱中保存備用。

1.3 基因的PCR擴增及純化

選擇18S rRNA基因通用引物Euk-A(5′-AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′)和 Euk-B(5′-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3′)為PCR擴增引物[13]。PCR反應體系為50 μL，包括5 μL 10 × Ex PCR緩沖液(10 mmol/L，Mg2+終濃度為1.5 mmol/L)，4 μL dNTP(10 mmol/L)，0.25 μL Ex Taq酶(5 U/μL)，PCR前后引物各1 μL(10 μmol/L)，36.75 μL ddH2O和2 μL DNA模板。PCR反應條件如下：95 ℃預變性4 min；40個循環為94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min；最后72 ℃延伸10 min。

PCR產物用經EB染色的1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。從凝膠上切下特異性擴增的目的條帶，置于無菌的1.5 mL Eppendorf管中，利用凝膠回收試劑盒(Wizard? SV Gel and PCR Clean-up System)純化回收18S rRNA基因片段。

1.4 測序及序列分析

將純化后的PCR產物(18S rRNA基因)連接到pGEM-T載體，然后導入大腸桿菌DH5α感受態細胞。涂布到含有50%氨芐青霉素(Ampicillin)的LB固體培養基上孵育、培養并進行藍白斑篩選，挑取出白色克隆進行PCR檢測。將正確插入目的片段的50個白色克隆樣品進行基因測序分析，應用DNASTAR軟件對測序結果進行編輯，去除載體序列。將所獲的序列在NCBI數據庫(http:www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中進行比對，挑選與其親緣關系最相近的已知序列以確定其分類歸屬。利用Mothur v.1.22.2軟件分析操作分類單元(OTUs，Operational taxonomic units)，按97%的相似度進行劃分。基于OTU結果，計算Chao1值、ACE值[14-15]，并繪制稀釋曲線。

1.5 序列登錄號

本研究獲得的18S rRNA基因序列在GenBank中的登錄號為：KF910075—KF910085。

2 結果

2.1 18S rRNA基因多樣性分析

本研究中，PCR擴增獲得的18S rRNA基因片段大小約為1500 bp。對挑選的50個陽性克隆進行測序分析，除4個低質量克隆未成功測序外，共得到46條序列。

46條基因序列在97%相似度水平歸為11類OTU(圖1)。多樣性指數Chao1值為32，ACE指數為74。其中，OTU1及OTU2豐度最高，各自包含了12條序列，表明OTU1及OTU2在砂殼蟲體內豐度較高(圖2)。OTU3是8條序列，OTU4有7條序列。其他7個OTU均包括1條序列，相對豐度較低。

2.2 食物組成

基于系統發育地位分析表明，所有OTUs均可劃歸為兩大類浮游動物：52%的OTUs序列屬于輪蟲(Rotifera)，48%的OTUs序列是橈足類(Copepoda)的哲水蚤(表1，圖3)。其中6個OTUs屬于輪蟲，包括24條序列；5個OTUs屬于橈足類，包括22條序列。由表1可知，輪蟲主要種類包括矩形龜甲輪蟲(Keratellaquadrata)、對壺狀臂尾輪蟲(Brachionusurceolaris)、大肚須足輪蟲(Euchlanisdilatata)、方塊鬼輪蟲(Trichotriatetractis)、萼花臂尾輪蟲(Brachionuscalyciflorus)、剪形巨頭輪蟲(Cephalodellaforficula)；橈足類包括Mastigodiaptomusnesus(鏢水蚤科一種)，擬細真鏢水蚤(Eudiaptomusgraciloides)，Eudiaptomusgracilis(鏢水蚤科一種)，Skistodiaptomusoregonensis(鏢水蚤科一種)，Leptodiaptomusmoorei(鏢水蚤科一種)。以上結果提示，瘤棘砂殼蟲體內出現輪蟲及橈足類的18S rRNA基因，推測瘤棘砂殼蟲不僅以輪蟲為食，而且可以捕食橈足類。

圖1 18S rRNA基因序列稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves for 18S rRNA gene sequences

圖2 18S rRNA基因克隆文庫中OTU0.03等級豐度 Fig.2 Rank-abundance distribution of OTU0.03 based on 18S rRNA gene clone library

表1 18S rRNA 基因測序條帶序列系統發育地位

3 討論

3.1 瘤棘砂殼蟲的食物組成

基于顯微鏡觀測的研究表明，瘤棘砂殼蟲屬肉食性動物，會攻擊其周圍任何微小的生物，尤其是大小相近的微型生物，主要攝食以輪蟲為主的浮游生物，包括膠鞘輪蟲、獨角聚花輪蟲、螺形龜甲輪蟲、紅多肢輪蟲、奇異六腕輪蟲、對棘異尾輪蟲，以及無節幼體[6-7,16]。瘤棘砂殼蟲的捕食行為主要依賴偽足，偽足可以自由伸縮[17]，并且可以準確判斷所要捕食對象的位置。在廣東流溪河水庫輪蟲中，膠鞘輪蟲和獨角聚花輪蟲容易被瘤棘砂殼蟲攝食，因為它們身體柔軟、游泳速度慢；而龜甲輪蟲、紅多肢輪蟲的外殼硬，游泳速度快，不易被瘤棘砂殼蟲捕食[7,16]。針對不同輪蟲物種，瘤棘砂殼蟲的捕食方式是不一樣的。如遇到身體柔軟的膠鞘輪蟲，瘤棘砂殼蟲一般會攻擊它們的背部或尾部，容易捕食成功；而對于外殼比較硬的龜甲輪蟲，選擇先攻擊它們的口部，捕食成功率較低[6,16]。毫無疑問，我們的結果也進一步表明，作為單細胞的瘤棘砂殼蟲能夠捕食多細胞的后生動物(表1)。

有趣的是，除了在瘤棘砂殼蟲體內檢測到輪蟲18S rRNA基因序列外，還檢測到相當比例的橈足類，進而證明湖邊水庫瘤棘砂殼蟲主要以輪蟲及橈足類為食。本研究檢測到瘤棘砂殼蟲捕食的輪蟲及橈足類種屬與韓博平等[6-7,16]學者觀察到的物種有所差異，推測這與不同生境及被捕食物種的豐富度相關。同時，本研究進一步補充擴展了瘤棘砂殼蟲捕食對象的范圍。由于橈足類的個體相對于瘤棘砂殼蟲要大很多，所以捕食相對較難。最近，韓博平等[16]觀察到瘤棘砂殼蟲可以捕食其周圍死亡的橈足類，但關于活體橈足類的捕食尚未見報道。不過，本文推測瘤棘砂殼蟲能夠捕食橈足類幼體，因為橈足類幼體個體相對較小，并且經歷的幼體階段相對較長。

事實上，瘤棘砂殼蟲還會捕食藻類，包括甲藻、絲狀藻類等[6]。但在本研究中沒有檢測到藻類，這并不代表瘤棘砂殼蟲沒有捕食藻類。究其原因，一方面可能是我們所用的18S rRNA基因引物具有一定特異性，擴增序列產生一定的偏好性，導致沒有檢測到藻類。另一方面，瘤棘砂殼蟲捕食的其他類食物數量不夠多，或者已經消化掉了，低于檢測線，因而也沒能檢測到。未來的深入研究有必要篩選更合適的PCR擴增引物和優化PCR條件。

表2 顯微觀察方法與分子技術手段的比較

3.2 基因克隆文庫技術是一個有效的食物組成分析方法

傳統的單細胞生物食物組成和捕食行為研究主要是利用顯微活體觀察技術，在觀察時需要具有分類學背景的專業人才，處理大量樣本耗時較長，因此分析周期長[18]。而近年來興起的分子生物學技術方法的方便、高效、快速，彌補了活體觀察的這一缺陷。本研究中，利用18S rRNA基因序列克隆文庫的分子生物學技術手段，能夠發現瘤棘砂殼蟲體內含有輪蟲及橈足類的基因序列，證明此方法可行可信。因此，單細胞原生動物體內18S rRNA基因的檢測可以作為一個有用的工具來快速地分析瘤棘砂殼蟲的食物組成。雖然分子生物學技術手段能夠快速檢測食物組成，但不能直觀地觀測其捕食行為過程，因此要配合顯微鏡活體觀察來共同研究瘤棘砂殼蟲的捕食特征(表2)。

為進一步深入全面認知瘤棘砂殼蟲的捕食行為特征，揭示其在水生態系統結構、功能等方面的重要作用和意義，建議后續研究綜合顯微活體觀察與分子生物學方法，達到技術方法上相互補充的效果。

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Diet composition ofDifflugiatuberspinifera(testate amoeba) based on a clone library technique

WANG Lina1,4, YU Zheng1,4, TIAN Ye1,3, ZHANG Wenjing2, YANG Jun1,*

1AquaticEcoHealthGroup,KeyLaboratoryofUrbanEnvironmentandHealth,InstituteofUrbanEnvironment,ChineseAcademyofSciences,Xiamen361021,China2CollegeofOceanandEarthSciences,XiamenUniversity,Xiamen361102,China3SchoolofEnvironmentalStudies,ChinaUniversityofGeosciences(Wuhan),Wuhan430074,China4UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China

Difflugiais a morphologically diverse genus of the free-living shelled amoeboid protozoa that are important components of freshwater ecosystems and play crucial roles in nutrient cycles and energy flow through food webs.Difflugiatuberspiniferais an endemic species of East Asia and is widely distributed in freshwater lakes and reservoirs in China. Clearly, this species plays a critical role in maintaining the structure and function of freshwater ecosystems. However, little is known about its diet composition and predatory behavior at both species and gene levels. This testate amoeba (D.tuberspinifera) was first found in the Wujiang River, Guizhou Province, China. Subsequently, more detailed studies on its morphology and biometry have been done on natural populations from Yangtze River and Pearl River valleys, and Fujian reservoirs. Recently, Han et al. illustrated thatD.tuberspiniferais an active and agile hunting carnivore that can capture swimming prey including micro-particulates, rotifers, and other metazoans. In previous studies, however, the specimen identifications were done by microscopic examination, which requires a broad and deep taxonomic knowledge and is very laborious, time-consuming, and somewhat variable because of insufficient taxonomic resolution. In order to facilitate the identification of diet composition inD.tuberspinifera, an inexpensive, efficient, rapid and easy-to handle gene clone library has been developed for diet detection and analysis. The plankton samples were collected from the Hubian Reservoir in Xiamen city in September of 2010. Individual cells were isolated using a glass capillary under an inverted microscope and washed 3—5 times with distilled water before DNA extraction and PCR amplification. The 18S rRNA gene was amplified by the universal eukaryotic primers, and the purified PCR products were ligated into the pGEM-T vector and transformed intoEscherichiacoliDH5α-competent cells. In total, 46 plasmids containing target gene fragments were successfully identified and sequenced. Each sequence was compared with sequences available in the GenBank database using BLAST, and the closest relatives were identified for diet or food composition analysis. Finally, 11 OTUs (operational taxonomic units) were identified at 97% sequence similarity level, and they belonged to either Rotifera (52%) or Copepoda (48%). Our results, combined with existing data, suggested that: 1) the diet composition ofDifflugiatuberspiniferais composed of both rotifera and copepoda species; 2) unicellular protozoa are not only the food of metazoa, but they can also prey on multicellular micro-metazoa; 3) molecular methods are universally applicable, and the SSU rRNA (small subunit ribosomal RNA) gene clone library is an efficient, rapid, and repeatable approach to study the diet composition of protozoa.

18S rRNA gene; clone library;Difflugia; predation; prozotoa

國家自然科學基金項目(31172114, 30800097); 福建省杰出青年科學基金項目(2012J06009)

2014-01-26;

日期:2014-11-19

10.5846/stxb201401260195

*通訊作者Corresponding author.E-mail: jyang@iue.ac.cn

王麗娜, 余正, 田 野, 張文靜, 楊軍.基于克隆文庫技術分析瘤棘砂殼蟲的食物組成.生態學報,2015,35(18):6183-6188.

Wang L N, Yu Z, Tian Y, Zhang W J, Yang J.Diet composition ofDifflugiatuberspinifera(testate amoeba) based on a clone library technique.Acta Ecologica Sinica,2015,35(18):6183-6188.