超微七味白術散對腸道厭氧微生物代謝多樣性的調控作用

王春暉,張華玲,張祺玲,尹抗抗,胡汝曉,譚周進,*

1 湖南省食用菌研究所, 長沙 410013 2 湖南省珍貴瀕危藥材工程研究中心, 長沙 410007 3 湖南省核農學與航天育種研究所, 長沙 410125 4 湖南中醫藥大學, 長沙 410208

超微七味白術散對腸道厭氧微生物代謝多樣性的調控作用

王春暉1,4,張華玲2,張祺玲3,尹抗抗4,胡汝曉1,譚周進4,*

1 湖南省食用菌研究所, 長沙 410013 2 湖南省珍貴瀕危藥材工程研究中心, 長沙 410007 3 湖南省核農學與航天育種研究所, 長沙 410125 4 湖南中醫藥大學, 長沙 410208

探討超微七味白術散對菌群失調腹瀉的腸道微生態調節作用。采用同時灌胃頭孢拉定和硫酸慶大霉素進行小鼠菌群失調造模,灌胃給藥七味白術散傳統湯藥和超微七味白術散1/2劑量的湯藥進行治療,正常組和模型組灌胃等量的無菌水,治療3 d后,提取腸道微生物,在厭氧條件下,運用Biolog微生物自動分析系統研究腸道微生物的代謝情況。培養72 h時,各組的顏色平均變化率(AWCD)趨于穩定,且1/2劑量的超微湯藥治療組>正常組>傳統湯藥治療組>模型組；正常組的Shannon指數和Simpson指數為最大,且與其他各組差異極顯著(P<0.01),1/2劑量超微湯藥治療組的Shannon均勻度和Mclntosh指數最大,Shannon均勻度與正常組差異不顯著(P>0.05),其余指標與各組都存在顯著性差異(P<0.01或P<0.05)。聚類分析和主成分分析表明抗生素的抑菌作用明顯,使小鼠腸道微生物的代謝受到影響,七味白術散傳統湯藥和1/2劑量超微湯藥的調控使小鼠腸道微生物的代謝多樣性逐漸恢復平衡,但兩種湯藥的調控作用不盡相同。七味白術散超微飲片1/2劑量對腸道厭氧微生物代謝多樣性的調控作用優于傳統飲片。

超微中藥；七味白術散；Biolog-Eco；代謝多樣性；腸道厭氧微生物

目前已知健康人腸道內棲息著約1014多個微生物,是人體細胞總數的10—20倍,約1000種[1]。其中90%—99.9%是厭氧菌,在這些細菌中主要包括類桿菌屬、真桿菌屬、雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬等至少14個菌屬。雙歧桿菌是人和動物胃腸道微生物區系中的一種非常重要的正常厭氧菌,在機體腸道內發揮很重要的生理作用,對維持腸道菌群平衡、治療腸道功能紊亂、控制內毒素產生及促進某些營養物質的吸收具有重要影響[2-3]。乳酸桿菌既可以補充腸道的正常菌群,又能促進有益菌的增殖,且對病原菌有明顯的生物頡抗作用,對腸道健康有著不可低估的積極影響[4]。酪酸梭菌(Clostridiumbutyricum)抑制艱難梭菌(Clostridiumdifficile)等病原菌的生長繁殖,促進雙歧桿菌、乳酸菌等腸道有益菌的生長繁殖,加強腸道黏膜營養代謝,保護受損的黏膜屏障,用作微生態制劑具有很好的療效[5]。大量的研究結果表明,腸道內的厭氧菌對人體的生長發育、免疫功能、營養、發病機制、健康等起著重要的作用。

中藥成分通過人體腸道菌群的水解和還原反應被轉化,降低或消除其毒副作用,對提高藥效,改變藥用功能意義重大[6]。有些中藥可能必須通過人體腸道菌群的代謝后才能發揮作用[7]。代謝產物的質變和量變是生物體受基因型與環境的雙重影響,它們的種類和數量變化被視為生物系統對基因或環境變化的最終響應[8-9]。深入研究口服中藥對人體腸道微生物代謝多樣性的影響,有助于闡明中藥的療效機理,并為利用腸道微生物深入研究和應用中藥奠定基礎。

Biolog微生物自動分析系統主要根據微生物對糖、醇、酸、酯、胺和大分子聚合物等95種碳源的利用情況進行分析,通過測定微生物對目標代謝途徑中不同單一碳源利用能力的強弱,可直接反映對應關鍵酶活力大小,從而比較直觀地表現微生物特定代謝途徑整體代謝能力[10-12]。有效利用Biolog系統對特定代謝能力進行分析,可了解腸道微生物代謝能力及其代謝調控作用,利用Biolog法來研究超微七味白術散對腸道厭氧微生物代謝多樣性的影響,以探討其對腸道厭氧微生物的調控功能,闡明其療效機理。

1 材料1.1 動物

清潔級昆明小鼠24只,雌雄各半,體質量(20±2) g,由上海斯萊克斯實驗動物有限公司/中國科學院上海實驗動物中心提供。

1.2 藥物

七味白術散：人參(山西)6 g、木香(云南)6 g、白茯苓(云南)10 g、炒白術(浙江)10 g、藿香葉(廣東)10 g、葛根(湖南)10 g、甘草(內蒙古)3 g。均購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院。

按上述配比,稱取適量的藥物,加冷水浸泡半小時后煎煮,先用大火煮沸,再改用小火煎煮,煎煮2次,每次煎煮時間不宜過長,一般15—20 min。將兩次煎煮的藥液混合后即制成七味白術散傳統湯劑,4 ℃冰箱中保存備用。

超微藥：將單味中藥超微粉碎,按上述配比稱取適量超微粉末,加入適量開水沖泡,攪拌,冷卻后低速離心取上清液,制成超微飲片1/2量湯劑,4 ℃冰箱中保存備用。

1.3 儀器與試劑

1.3.1 儀器

Biolog微生物自動分析儀(型號E1×808BLG)；厭氧工作站(型號BAETRON-1)；超凈工作臺(型號SW-CJ-1B)；實驗在廣東省生態環境與土壤研究所廣東省環境科學與技術公共實驗室完成。

1.3.2 試劑

頭孢拉定膠囊(石藥集團歐意藥業有限公司生產；批號101005)硫酸慶大霉素注射液(山東魯抗辰欣藥業有限公司；批號100928353),用無菌生理鹽水配成濃度為62.5 g/L的抗生素混合液,4 ℃冰箱中保存備用。

1.4 飼料

由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供。

2 方法

2.1 動物分組

24只小鼠適應性飼養2 d后,按照隨機數字表將其分為正常組、模型組、傳統七味白術散湯藥治療組、超微七味白術散湯藥(1/2)劑量治療組(根據課題組研究結果[13-14],選用超微中藥的該劑量與傳統中藥全量進行比較),共4個組,每組6只,雌雄各半,分籠飼養。

2.2 造模方法[15]

正常組給予無菌水0.4 mL 只-1次-1灌胃,其余各組采用抗生素混合液(頭孢拉定和硫酸慶大霉素按照4∶3的比例混合)0.4 mL 只-1次-1灌胃。每天2次,連續5 d。

2.3 給藥方法及劑量

造模成功后,灌胃給藥,每天2次,連續3 d。正常組及模型組給予無菌水,其余各組按小鼠臨床等效用藥劑量給藥,即傳統七味白術散傳統湯藥治療組0.16 g kg-1d-1,七味白術散1/2量超微湯藥治療組0.08 g kg-1d-1。

2.4 小鼠腸道內容物的提取

將小鼠頸椎脫臼處死后立即放于超凈工作臺上,無菌采集各組空腸到回腸段內容物,樣品混合收集于盛滿冰的無菌袋中,并立即帶回實驗室,-20 ℃保存備用。

2.5 Biolog-Eco分析

本研究采用31種碳源的生態板(Biolog-Eco)分析腸道微生物代謝多樣性,碳源的編號同參考文獻[16]。在無菌條件下稱取腸道內容物5 g,放入已滅菌的盛有45 mL 0.85% NaCl溶液和玻璃珠的三角瓶中,搖床振蕩30 min后,500 r/min離心3 min去除食物殘渣,取上清液5 mL分裝于5支已滅菌的EP管中,10000 r/min離心20 min,棄去上清液,保留沉淀。每支EP管中加入1 mL 0.85%的NaCl無菌水,渦旋振蕩,收集沉淀于滅菌過的盛有45 mL 0.85%的NaCl無菌水和玻璃珠的三角瓶中,振蕩10 min,制得腸道內容物中微生物的提取液,最終稀釋比例為1∶1000,用于Biolog分析。用8通道加樣器將稀釋1000倍的菌液加入Biolog-Eco培養板上,每孔150 μL。將接種好的培養板放入37 ℃厭氧培養箱中培養,于培養的第4、12、24、48、60、72、96、120天用Biolog讀數系統讀取數據。具體參照Classen等[17-18]的方法。

2.6 數據統計分析

(1)小鼠腸道微生物的代謝活性用每孔顏色平均變化率(AWCD)來描述,計算公式如下：

AWCD =∑(Ci-R) /31

式中,Ci為各碳源孔在590 nm 下的吸光度值與750 nm下吸光度值的差值；R為Eco 板對照孔A1的吸光度值,Biolog Eco板的C 源數目為31[19]。

(2)利用各樣品培養72 h的數據,計算其微生物多樣性的Shannon指數(H′)、 Shannon均勻度(E)、Simpson指數(1/D)和Mclntosh指數(U)。計算方法參照Magurran[20]。

Shannon指數(H′)

H′=-∑(PilnPi)

式中,Pi= (Ci-R) /∑(Ci-R),表示有碳源的孔與對照孔A1 的光密度值之差與整板總差的比值。

Shannon均勻度(E)

E = H′/lnS

式中,S表示碳源代謝孔的數目(Ci-R>0,則表示該孔碳源被利用,該孔即為反應孔)。

Simpson指數(1/D)

式中,ni是第i孔的相對吸光度值(Ci-R),N是相對吸光度值的總和(∑(Ci-R)),同時,為防止出現負值,需將數據擴大1000倍。

Mclntosh指數(U)

數據用Microsoft Excel 2003計算AWCD值并作圖、DPS v7.05進行T檢驗、SPSS16.0 軟件系統進行聚類分析和主成分分析,所有數據均為3次重復的平均值。

3 結果與分析

3.1 超微七味白術散對小鼠腸道微生物AWCD的影響

平均顏色變化率(AWCD)反映微生物群落代謝的總體活性,其值越大,活性越高；反之,活性越低[21]。由圖1可知,在厭氧培養的4—24 h內,各組的AWCD值變化不大,且各組之間的差別不明顯。在24 h之后,各組的AWCD值均急劇上升,表明小鼠腸道厭氧和兼性厭氧微生物活性隨培養時間的延長在不斷增加。培養36 h時,模型組的AWCD值最小,正常組的AWCD值最大,兩個治療組的AWCD值則比較接近,隨后1/2劑量超微湯藥治療組AWCD值急劇增加,48 h時其值超過正常組,位居第一,其次是正常組,而模型組和傳統湯藥治療組則比較接近。72 h后各組AWCD值的大小為：1/2劑量超微湯藥治療組>正常組>傳統湯藥治療組>模型組,直至培養120 h,說明1/2劑量超微湯藥治療組小鼠腸道厭氧和兼性厭氧微生物群落代謝的總體活性最高,而模型組的則最低。

圖1 不同組小鼠腸道微生物AWCD隨厭氧培養時間的變化

3.2 超微七味白術散對小鼠腸道微生物多樣性的影響

Shannon指數表示相同情況下各個生態系統微生物群落利用碳源的多與少,Shannon均勻度指數則包括豐富度和種類中個體分布的均勻性。Simpson指數和Mclntosh指數是評估某些最常見種的優勢度和均勻度的指數。由表1可知,Shannon指數和Simpson指數均為正常組最大,且與其它3組差異極顯著；Shannon均勻度和Mclntosh指數為1/2劑量超微湯藥治療組最大,且都與模型組差異極顯著；除Shannon指數外其余各指數均為模型組最小,且都與正常組和1/2劑量超微湯藥治療組差異顯著或極顯著；Shannon指數最小為傳統湯藥治療組,且與其余各組差異極顯著。抗生素建立小鼠菌群失調模型,使腸道微生物的結構和數量發生變化,導致模型組小鼠腸道微生物Shannon均勻度、Simpson指數和Mclntosh指數均顯著小于正常組。七味白術散對腸道微生物有很好的調控作用,1/2劑量超微湯藥對腸道微生物的調控療效明顯好于傳統湯藥,可能與該復方中有效成分的溶出率有關[14]。

表1 不同組小鼠腸道微生物的多樣性和均勻度指數

3.3 不同組小鼠腸道微生物群落代謝變化的聚類分析

圖2 不同組小鼠腸道微生物碳源代謝的聚類分析圖

Biolog Eco板的碳源一般按照化學性質可分：糖類、氨基酸類、聚合物類、羧酸類、胺類和其他化合物,共6大類[16,22]。經抗生素造模和七味白術散治療,小鼠腸道微生物群落發生了復雜的變化,使傳統的化學分類無法反映微生物群落對不同碳源的利用情況。由圖2可知,當聚類距離≤5時,正常組的碳源被聚為5類,模型組的碳源被聚為4類,傳統湯藥治療組和1/2劑量超微湯藥治療組的碳源被聚為3類,可見造模后治療與否所導致的小鼠腸道微生物群落對碳源的利用有很大區別。顯然造模后,模型組小鼠腸道微生物對碳源的利用情況比較單一,而經過七味白術散兩種湯藥的治療,對碳源的利用就相對比較多樣化,可見七味白術散的治療效果比較明顯。各組均有D-木糖、D-半乳糖醛酸和N-乙酰-D葡萄糖氨聚為同一類,與正常組相比,模型組還有腐胺、苯乙胺、D-半乳糖γ內酯和L-精氨酸未聚在該類,傳統湯藥治療組還有腐胺、苯乙胺、D-半乳糖γ內酯、L-精氨酸、L-天門冬酰胺和D-甘露醇未聚在該類,1/2劑量超微湯藥治療組則有苯乙胺、1-磷酸葡萄糖、D,L-α-磷酸甘油和肝糖未聚在該類。在正常組中,β-甲基-D-葡萄糖苷、甘氨酰-L-谷氨酸與α-丁酮酸、L-蘇氨酸等10種碳源一起被聚為同一類,而在其它3個組中,該兩種碳源均未聚為該類,且2個治療組還同有吐溫40未聚為該類。在模型組和1/2劑量超微湯藥治療組D-蘋果酸和D-纖維二糖聚為同一類,而在正常組和傳統湯藥治療組則未聚為同一類,尤其在正常組,D-蘋果酸被單獨聚為一類。在正常組中,α-D-乳糖被單獨聚為一類,而在其它3組中,α-D-乳糖均與其它多種碳源聚為同一類,尤其在模型組和傳統湯藥治療組中,同有α-D-乳糖、肝糖等共9種碳源聚為同一類,與1/2劑量超微湯藥治療組不同。

當聚類距離≤10時,正常組、模型組和1/2劑量超微湯藥治療組的碳源均被聚為2類；傳統湯藥治療組的碳源則被聚為3類,且與聚類距離≤5時的聚類結果一樣。模型組和1/2劑量超微湯藥治療組中D-纖維二糖、D-蘋果酸、β-甲基-D-葡萄糖苷、D-半乳糖γ內酯、L-絲氨酸和腐胺共6種碳源被聚為一類。在正常組和傳統湯藥組中,該6種碳源分別被聚為2類。正常組中,D-半乳糖γ內酯、D-蘋果酸和腐胺一類,β-甲基-D-葡萄糖苷、L-絲氨酸和D-纖維二糖為一類；傳統湯藥組中,D-蘋果酸、L-絲氨酸和腐胺一類,D-纖維二糖、β-甲基-D-葡萄糖苷和D-半乳糖γ內酯為一類。

3.4 不同組小鼠腸道微生物群落代謝變化的主成分分析

Biolog Eco的數據顯示,小鼠腸道微生物對Eco板上的絕大多數碳源都具有代謝能力,但是經統計分析發現,不同組別中某些碳源的吸光度差異明顯,這說明,不同小鼠腸道微生物對碳源的利用能力是不同的。為了進一步了解七味白術散對小鼠腸道微生物群落代謝能力的影響,對Biolog所得數據實施主成分分析(PCA)。提取4個組別中的數據,通過分析可知,正常組、模型組、傳統湯藥組和1/2劑量超微湯劑組中,成分1的方差貢獻率分別為：61.68%、57.71%、54.02%和60.46%。

提取31種碳源在2個主成分上的載荷圖來分析這31種碳源在4個組別中的代謝特點。由圖3可知,成分1的方差貢獻率為46.22%,成分2的方差貢獻率為36.83%。正常組中PC1在D-木糖、吐溫80、肝糖、2-羥基苯甲酸和α-丁酮酸等碳源種類上有較高的載荷,表明在正常組中這些碳源對PC1的貢獻率比較大。模型組中PC1在D-纖維二糖、α-D-乳糖、D-纖維二糖、α-D-乳糖和腐胺等碳源上有較高的載荷。傳統湯藥治療組中PC1在β-甲基-D-葡萄糖苷、D-甘露醇、4-羥基苯甲酸、衣康酸和L-蘇氨酸等碳源上有較高的載荷。1/2劑量超微湯藥治療組中PC1在1-磷酸-葡萄糖、α-環式糊精、D-半乳糖酸γ內酯、γ-羥丁酸和L-苯丙氨酸等碳源上有較高的載荷。

圖3 不同組小鼠腸道微生物碳源代謝的主成分分析

正常組中PC2在L-精氨酸、L-蘇氨酸、D-半乳糖酸γ內酯、衣康酸和D-葡糖胺酸)等碳源種類上有較高的載荷,表明在正常組中這些碳源對PC2的貢獻率比較大。模型組中PC2在L-精氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、D-半乳糖酸γ內酯和D-半乳糖酸γ內酯等碳源種類上有較高的載荷。傳統湯藥治療組中PC2在D-纖維二糖、N-乙酰-D-葡萄糖胺、γ-羥丁酸、L-精氨酸和吐溫40等碳源上有較高的載荷。1/2劑量超微湯藥治療組中PC2在D-甘露醇、衣康酸、α-丁酮酸、甘氨酰-L-谷氨酸和吐溫40等碳源上有較高的載荷。

如圖3所示,D-纖維二糖在模型組中對PC1貢獻率較大,在傳統湯藥治療組和1/2劑量超微湯藥治療組中對PC2貢獻率較大,而在正常組中對PC1和PC2的貢獻率都不大。L-蘇氨酸在正常組、模型組和1/2劑量超微湯藥治療組中對PC2貢獻率較大,而在傳統湯藥治療組中對PC1貢獻率較大。衣康酸在正常組和1/2劑量超微湯藥治療組中對PC2貢獻率較大,在傳統湯藥治療組中對PC1貢獻率較大,而在模型組中對PC1和PC2的貢獻率都不大。肝糖在正常組中對PC1貢獻率較大,在模型組和傳統湯藥治療組中對PC2貢獻率較大,而在1/2劑量超微湯藥治療組中對PC1和PC2的貢獻率都不大。腐胺在模型組和1/2劑量超微湯藥治療組中對PC1貢獻率較大,在正常組和傳統湯藥治療組中對PC1和PC2的貢獻率都不大。丙酮酸甲酯在正常組合1/2劑量超微湯藥治療組中對PC1貢獻率較大,而在模型組和傳統湯藥治療組中對對PC1和PC2的貢獻率都不大。

4 討論

宿主與腸道微生物之間的代謝關系復雜,涉及宿主和腸道微生物生命整個過程和各個方面。腸道微生物及其基因組賦予宿主一些特殊的代謝特性,彌補宿主某些生物學不足[23]。本研究經BIOLOG分析,發現模型組小鼠腸道微生物培養72 h后的AWCD值、Shannon均勻度、Simpson指數和Mclntosh指數均小于正常組,其聚類分析結果最簡單,主成分分析結果也與正常組區別明顯,是因為抗生素對敏感革蘭陰性桿菌和厭氧革蘭陽性菌的抑制作用導致腸道菌群失調,直接影響腸道微生物群落的數量和結構,使得小鼠腸道微生物的某些代謝途徑受到影響,導致其整體代謝活性下降。

微生物在生長過程中會產生纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、酯酶等多種酶,對腸道各種消化作用有重要影響。雙歧桿菌相關的代謝酶系有果糖-6-磷酸磷酸激酶、半乳糖苷酶、β-呋喃果糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、D-木糖異構酶、結合膽汁酸水解酶等,在其代謝過程中發揮重要作用[24]。乳酸桿菌通過發酵碳水化合物、蛋白質、氨基酸、脂類等代謝產生乳酸、揮發性酸、過氧化氫、雙乙酰及細菌素,具有抗菌作用[25-26]。酪酸梭菌能產生B族維生素、維生素K、淀粉酶等物質[4]。有研究表明,黃芪多糖和小檗堿的復合制劑能提高蛋雞腸道淀粉酶和蛋白酶的活性,七味白術散可使腸道纖維素酶、蛋白酶及淀粉酶活性上升[13],促進了腸道對纖維素、蛋白質等有機化合物的利用。七味白術散復方中藥化學成分復雜,功能多樣,對微生物的調控作用復雜多樣,能促進乳酸菌、雙歧桿菌等有益菌的增殖[13],黃酮類化合物、甘草酸等對一些特定的微生物也具有明顯的抑制作用。乳酸菌、雙歧桿菌、酪酸梭菌等腸道有益菌可通過生物拮抗作用,抑制艱難梭菌等抗生素相關性腹瀉致病菌、大腸桿菌等條件致病菌的的生長,調節菌群失衡,影響腸道菌群的代謝酶系和代謝活性[5],使得傳統湯藥治療組和1/2劑量超微湯藥治療組的整體代謝活性均高于模型組,Shannon均勻度、Simpson指數和Mclntosh指數也都高于模型組,聚類分析和主成分分析結果也異于正常組和模型組。七味白術散通過促進腸道有益菌的增殖、抑制有害菌的生長來調控腸道微生物的平衡,改變腸道菌群的代謝活性。

AWCD值反映微生物群落代謝的總體活性,1/2劑量超微湯藥治療組的AWCD值大于傳統湯藥組,且表示微生物群落的數量和結構的Shannon指數、Shannon均勻度、Simpson指數和Mclntosh指數均是1/2劑量超微湯藥治療組顯著大于傳統湯藥組(P<0.05或P<0.01),顯然七味白術散的1/2劑量超微湯藥在對腸道菌群的調控作用方面優于傳統湯藥,與譚周進等[14]的研究結果一致,七味白術散超微粉更有利于其藥效的發揮。中藥經超微粉碎后,粉末粒徑小且分布均勻,增大了其比表面積,而且細胞壁大部分被破壞, 胞內有效成分的溶出阻力減小,從而提高了有效成分的溶出速度及溶出率,有利于藥物的吸收,又超微粉碎可在低溫狀態下進行有利于保留不耐高溫的生物活性成分及各種營養成分,從而提高藥效[27]。

[1] 武娜, 朱寶利. 人體腸道微生物與健康. 科學, 2013, 65(2): 13-16.

[2] 高巍, 劉晨黎. 雙歧桿菌在胃腸道微生物區系中的作用及其粘膜附著機制. 石河子大學學報: 自然科學版, 2002, 6(4): 334-338．

[3] Grill J P, Crociani J, Ballongue J. Characterization of fructose 6 phosphate phosphoketolases purified from bifidobacterium species. Current Microbiology, 1995, 31(1): 49-54.

[4] 孫忠信, 李淑華, 楊秀云. 乳酸桿菌對仔豬腸道微生物的影響. 吉林農業科技學院學報, 2010, 9(4): 16-17.

[5] 呂建平, 徐秀麗, 付孟莉. 酪酸梭菌的藥理作用及臨床應用. 臨床合理用藥雜志, 2010, 3(20): 159-160.

[6] Bae E A, Shin J E, Kim D H. Metabolism of ginsenoside Re by human intestinal microflora and its estrogenic effect. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2005, 28(10): 1903-1908.

[7] Li M, Wang B, Zhang M, Rantalainen M, Wang S, Zhou H, Zhang Y, Shen J, Pang X, Zhang M, Hua W, Yu C, Lu H, Zuo J, Su M, Qiu Y, Jia W, Xiao C, Smith ML, Yang S, Holmes E, Tang H, Zhao G, Nicholson JK, Li L, Zhao L. Symbiotic gut microbes modulate human metabolic phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America, 2008, 105(6): 2117-2122.

[8] Nicholson J K, Wilson I D. Understanding ‘global’ systems biology: Metabonomics and the continuum of metabolism. Nature Reviews Drug Discovery, 2003, 2(8): 668-676.

[9] Fernie A R, Trethewey R N, Krotzky A J, Willmitzer L. Metabolite profiling: From diagnostics to systems biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2004, 5(9): 763-769.

[10] 程池, 楊梅, 李金霞, 姚粟, 胡海蓉. Biolog微生物自動分析系統-細菌鑒定操作規程的研究. 食品與發酵工業, 2006, 32(5): 50-54.

[11] 胡桂林, 王德良, 張雪峰, 段開紅. 用Biolog微生物自動分析系統鑒定大曲中地衣芽孢桿菌的研究. 釀酒, 2007, 34(6): 32-33.

[12] 柏中中, 許婷婷, 何小丹, 何冰芳. 利用Biolog系統進行乳酸生產菌代謝能力的快速分析. 食品與生物技術學報, 2009, 28(3): 347-351.

[13] 譚周進, 吳海, 劉富林, 蔡瑩, 蔡光先, 張華玲, 曾奧. 超微七味白術散對腸道微生物及酶活性的影響. 生態學報, 2012, 32(21): 6856-6863.

[14] 譚周進, 張華玲, 余望貽, 周賽男, 曾奧, 蔡瑩, 蔡光先. 菌群失調小鼠腹瀉造模及超微中藥干預過程中腸道微生物的變化. 應用與環境生物學報, 2013, 19(3): 449-453．

[15] 曾奧, 張華玲, 譚周進, 蔡瑩, 蔡光先, 周賽男. 小鼠菌群失調腹瀉模型的建立及超微七味白術散的療效. 微生物學通報, 2012, 39(9): 1341-1348.

[16] 安韶山, 李國輝, 陳利頂. 寧南山區典型植物根際與非根際土壤微生物功能多樣性. 生態學報, 2011, 31(18): 5225-5234.

[17] Classen A T, Boyle SI, Haskins K E, Overby S T, Hart S C. Community-level physiological profiles of bacteria and fungi: Plate type and incubation temperature influences on contrasting soils. FEMS Microbiology Ecology, 2003, 44(3): 319-328.

[18] 劉峰, 張蘭英, 劉鵬, 劉瑩瑩, 高松. 采用Biolog法分析制藥廢水處理工藝中微生物多樣性. 中國給水排水, 2007, 23(21): 28-32.

[19] Grove JA, Kautola H, Javadpour S, Young M M, Anderson W A. Assessment of changes in the microorganism community in a biofilter. Biochemical Engineering Journal, 2004, 18(2): 111-114.

[20] Magurran A E. Ecological Diversity and Its Measurement. New Jersey: Princeton University Press, 1988: 43-47.

[21] Benizri E, Amiaud B. Relationship between plants and soil microbial communities in fertilized grasslands. Soil Biology and Biochemistry, 2005, 37(11): 2055-2064.

[22] 楊鶯鶯, 李卓佳, 梁曉華, 梁潤捷, 洪敏娜, 陳永青. 芽胞桿菌對魚池微生物群落代謝功能的影響. 微生物學雜志, 2009, 29(3): 11-17.

[23] 劉威, 姚文, 朱偉云. 人體與腸道微生物間的互惠共生關系. 世界華人消化雜志, 2006, 14(11): 1081-1088.

[24] 呂耀龍, 趙春杰, 劉建軍. 雙歧桿菌的代謝及開發前景. 乳業科學與技術, 2008, (2): 90-92.

[25] 柴俊, 郤翠仙, 張以芳. 乳酸桿菌主要代謝產物種類及其特性. 食品工業科技, 2007, 28(8): 257-260, 264-264.

[26] 章文明, 汪海峰, 劉建新. 乳酸桿菌益生作用機制的研究進展. 動物營養學報, 2012, 24(3): 389-396.

[27] 谷麗麗, 張雪梅, 田莉瑛, 邊艷青, 趙寶華. 中藥超微粉碎技術的應用及進展. 生命科學儀器, 2008, 6(8): 49-52.

Effects of ultra-micro powder qiweibaizhusan on metabolism diversity of intestinal anaero-microbiotia in diarrheal mice with dysbacteriosis

WANG Chunhui1,4, ZHANG Hualing2, ZHANG Qiling3, YIN Kangkang4, HU Ruxiao1, TAN Zhoujin4,*

1HunanDomesticFungusResearchInstitute,Changsha410013,China2HunanEngineeringResearchCenterofPreciousandEndangeredMedicinalMaterials,Changsha410007,China3HunanInstituteofNuclearAgriculturalSciencesandSpace-inducedBreeding,Changsha410125,China4HunanUniversityofTCM,Changsha410208,China

Compound traditional Chinese medicine is one of the medication characteristics of traditional Chinese medicine, as well as its essence. Intestinal microbiotia have a crucial effect on hosts′ metabolic function and life activities. Intestinal microbiotia are devoted to dissolution and transformation of the Chinese herbal medicinal ingredients by hydrolysis and restoring reaction. In order to investigate the microecological mechanisms for ultra-micro Qiweibaizhusan on diarrheal mice with intestinal dysbacteriosis, the mouse model with dysbacteriosis was constructed by intragastric administration with antibiotics mixture composed of cefradine capsules and gentamycin sulfate injection. One group of diarrheal mice were treated with the traditional decoction of Qiweibaizhusan, the other group of diarrheal mice were given 1/2 dose of ultra-micro powder Qiweibaishusan, and the normal group and the diarrheal group mice were treated with sterilized water by intragastric administration. After three days′ treatment, the intestinal microbiotia were extracted, and their carbon metabolisms were determined by Biolog Microbial Identification System. The results showed that all groups of average of wall color development (AWCD) tended to be stable throughout 72 h cultivation period, but AWCD of the 1/2 dose of ultra-micro powder group > the normal group > the traditional decoction group > the model group. The microbial diversity index, including Shannon index and Simpson index, in the normal group were the largest, and there were significant differences compared with that in other groups (P<0.01). The Shannon evenness and Mclntosh index of the 1/2 dose of ultra-micro powder treated group were very significantly different compared to that of other group (P<0.01,P<0.05), except that the Shannon evenness wasn′t significantly different compared with that of the normal group (P>0.05). The results of clustering analysis and principal components analysis suggest that bacteriostasis function of antibiotics was prominent, and some metabolic pathways of intestinal microbiotia in mice were influenced. The metabolic diversity of intestinal microbiotia in mice was gradually regained by the regulatory functions of 1/2 dose of ultra-micro powder and traditional decoction of Qiweibaishusan. There were differences in the regulatory roles of the traditional decoction and ultra-micro powder decoction. The regulatory role of 1/2 dose of ultra-micro powder was more notable than that of traditional decoction. The ultra-micro Qiweibaizhusan had a prominent regulatory role on metabolic diversity of intestinal anaerobic microbiotia in mice, and had a good treatment effect on diarrhea with intestinal dysbacteriosis.

ultra-micro powder traditional Chinese medicine; qiweibaizhusan; Biolog-Eco; metabolic diversity; intestinal anaerobic microbiotia

國家自然科學基金(81173214)

2013-09-18;

2014-04-16

10.5846/stxb201309182306

*通訊作者Corresponding author.E-mail: tanzhjin@sohu.com

王春暉,張華玲,張祺玲,尹抗抗,胡汝曉,譚周進.超微七味白術散對腸道厭氧微生物代謝多樣性的調控作用.生態學報,2015,35(14):4843-4851.

Wang C H, Zhang H L, Zhang Q L, Yin K K, Hu R X, Tan Z J.Effects of ultra-micro powder qiweibaizhusan on metabolism diversity of intestinal anaero-microbiotia in diarrheal mice with dysbacteriosis.Acta Ecologica Sinica,2015,35(14):4843-4851.