吡格列酮對急性腦缺血再灌注損傷大鼠TNF—α、IL—10和細胞凋亡的影響

趙俞+余智+盧波達+劉凱的+方來明

[摘要] 目的 探討急性腦缺血再灌注損傷大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-10（IL-10）和細胞凋亡的變化規律及吡格列酮（Pioglitazone，PGZ）干預對上述指標的影響。 方法 將84只SD大鼠隨機分為PGZ組（n=42）及對照組（n=42），前者通過改良Zea-longa法建立腦缺血再灌注損傷模型后立即經尾靜脈注射10 mg/kg的PGZ，對照組則用同等劑量的生理鹽水代替PGZ，以后各組分別每24小時腹腔注射1次等量PGZ/生理鹽水，直至SD大鼠被處死，并以傷后處死時間分為7個亞組，分別為1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、3 d和7 d，每個亞組各6只。取缺血灶周圍組織采用免疫組織化學方法檢測并比較腦組織中TNF-α及IL-10的蛋白表達，同時采用TUNEL法觀察并比較細胞凋亡情況。 結果 PGZ組TNF-α蛋白表達量較對照組明顯下降（P<0.05），而IL-10顯著上升（P<0.05），且兩組中二者均呈顯著負相關（P<0.01）；同時PGZ組腦組織細胞凋亡數量較對照組也有所下降（P<0.05）。結論 腦缺血再灌注損傷后，吡格列酮可能通過降低TNF-α的活性上調IL-10的表達，減輕炎癥反應，阻止神經細胞進一步凋亡，從而對缺血再灌注損傷大鼠神經細胞發揮保護作用。

[關鍵詞] 吡格列酮；腦缺血再灌注損傷；TNF-α；IL-10；細胞凋亡

[中圖分類號] R743.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）35-0001-04

目前在2型糖尿病的治療過程中，吡格列酮（Pioglitazone，PGZ）在減少外周組織和肝臟的胰島素抵抗、增加依賴胰島素的葡萄糖處理、減少肝糖的輸出方面具有重要意義。研究表明，吡格列酮對腦缺氧缺血、低血糖、創傷和癲癇發作時發揮的神經保護作用與激活過氧化物酶增殖體激活受體-γ（PPARγ）抑制炎癥等途徑有關[1]。然而，其具體神經保護分子機制還有待進一步研究。故本實驗采用PGZ對改良Zea-longa 法建立大腦中動脈缺血再灌注損傷模型大鼠進行治療干預，檢測TNF-α、IL-10蛋白的表達及其對細胞凋亡的影響，探討其對腦缺血再灌注損傷大鼠神經保護分子機制，為該藥用于腦缺血缺氧性疾病的臨床防治提供實驗基礎和理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗大鼠

選取84只清潔級雄性SD大鼠[浙江大學醫學院動物實驗中心提供，動物合格證號：SCXK（浙）2008-0033]，體重（265±15）g。實驗前大鼠禁食不禁水12 h，用隨機數字表法分為PGZ組42只、對照組42只，再根據傷后處死時間分為7個亞組，分別為1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、3 d和7 d，每個亞組各6只。

1.2 主要試劑

吡格列酮（PGZ）（美國Sigma公司）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及白細胞介素-10（IL-10）免疫組化試劑盒（美國R&D Systems公司）；TUNEL原位末端標記試劑盒（美國Promega公司）；電子顯微鏡（日本OLYMPUS公司）等。

1.3 大鼠腦缺血再灌注損傷模型的制備及處理

灌注。模型成功標志[2]：大鼠蘇醒后出現術側Horner綜合征；爬行時跌倒或向右側轉圈；提尾懸拉后出現缺血灶對側上肢蜷縮屈曲。PGZ組待大鼠自然蘇醒后立即經尾靜脈注射PGZ 10 mg/kg，對照組則經尾靜脈注射等量的生理鹽水，以后各組分別每24小時經尾靜脈注射一次等量PGZ/生理鹽水，直至大鼠被處死。

1.4 觀察指標

1.4.1 TNF-α及IL-10蛋白的表達 大鼠深度麻醉成功后，開胸暴露并游離出心臟，以生理鹽水灌洗到雙肺色白，后再灌注冰凍（4℃）4%多聚甲醛，迅速斷頭取腦，多聚甲醛浸泡固定24 h。在距額葉前端2.5 mm和8.5 mm處行冠狀切片，取中間5 mm厚的腦組織塊，沿矢狀縫左側約1.5 mm處切除右側部分，選取余下的左側腦塊作為檢測標本，即缺血半暗帶腦組織。自前往后連續冠狀位切片，厚約6 μm，每隔10張取兩張切片，嚴格按相關試劑盒提供的步驟進行檢測，在400倍顯微鏡下隨機取5個不重復視野，觀察并計數陽性細胞數，求其平均值并采圖。

1.4.2 TUNEL染色 嚴格按照TUNEL細胞凋亡試劑盒說明書進行操作。在400倍光鏡下觀察凋亡細胞（以胞核出現棕黃染色顆粒代表），并計算計數陽性細胞數，求其平均值并采圖。

1.5 統計學方法

應用SPSS 18.0統計學軟件進行數據分析。計量資料用（x±s）表示，兩組在不同時間點的指標比較分別采用兩獨立樣本均數t檢驗與重復測量資料方差分析，組間因素為分組（PGZ組和對照組），組內因素為時間點（7個不同處死時間點），交互作用為分組×時間；P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TNF-α蛋白的表達

PGZ組大鼠缺血灶周圍組織中TNF-α在術后1 h中開始表達，3 h出現大量表達；6～24 h處于高度表達，再灌注損傷后3 d呈強表達，至7 d表達量有所降低，并顯著低于對照組（P<0.05）；通過重復測量資料的方差分析結果顯示，兩組同一時間點TNF-α蛋白表達比較，差異具有統計學意義（F組間=16.207，P=0.000<0.01）；兩組各不同時間點TNF-α蛋白表達差異具有顯著性（F組內1=13.999，P=0.000<0.01；F組內2=12.337，P=0.000<0.01）；分組和時間之間不存在交互作用（F交互=1.759，P=0.188>0.05），即PGZ組和對照組TNF-α蛋白的表達在各時間點上的變化趨勢是相同的，見表1、圖1。

2.2 IL-10蛋白的表達

IL-10蛋白在損傷灶周圍組織細胞核中1 h時高表達，但3～12 h陽性細胞數逐漸降低，24 h時陽性細胞數達到低峰，處于低表達狀態，但7 d表達有所上升，并顯著高于對照組（P<0.05）；通過重復測量資料的方差分析結果顯示，兩組同一時間點IL-10蛋白表達比較，差異具有統計學意義（F組間=9.819，P=0.002<0.01）；二組各不同時間點IL-10蛋白表達差異具有顯著性（F組內1=105.707，P=0.000<0.01；F組內2=112.307，P=0.000<0.01）；分組和時間之間不存在交互作用（F交互=0.405，P=0.526>0.05），即PGZ組和對照組IL-10蛋白的表達在各時間點上的變化趨勢是相同的，見表1及圖2。

2.3 神經細胞凋亡變化

PGZ組大鼠損傷灶周圍組織1 h開始出現凋亡細胞，3～24 h凋亡細胞數逐漸增多，3 d達到高峰，但7 d凋亡細胞數較前有所減少，并顯著低于對照組（P<0.05）；采用重復測量資料的方差分析結果顯示，兩組同一時間點凋亡細胞數比較，差異具有統計學意義（F組間=6.585，P=0.012<0.01）；兩組各不同時間點凋亡細胞數比較差異具有顯著性（F組內1=19.979，P=0.000<0.01；F組內2=21.136，P=0.000<0.01）；分組和時間之間不存在交互作用（F交互=0.540，P=0.465>0.05），即PGZ組和對照組凋亡細胞數在各時間點上的變化趨勢是相同的，見表1及圖3。

2.4 TNF-α與IL-10蛋白的表達相關性分析

兩組腦組織TNF-α與IL-10蛋白的表達均呈顯著負相關，以TNF-α蛋白的表達為自變量（independent variable），用X表示。IL-10蛋白的表達為應變量（dependent variable），用Y表示。回歸方程Y1=0.43-0.261X，r2=-0.937（P<0.01），Y1=4.16-0.738X，r2=-0.951（P<0.01）。

3 討論

目前缺血性腦血管病已逐步成為導致人類死亡疾病中的首要因素[3]，造成勞動力喪失并花費巨額的醫療資源，對家庭和社會造成巨大的影響。因此，如何提高急性缺血性腦血管病的療效是臨床亟需解決的難題，而神經保護劑在缺血性腦血管疾病急性期的治療中具有重要作用，故尋找有效的神經細胞保護劑是當代神經科學的重要課題之一。

腦缺血特別是缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）的病理生理過程極為復雜，其發病機制涉及腦組織炎癥反應、能量代謝紊亂、興奮性氨基酸（EAA）的細胞毒性等多個學說。這些環節并不是孤立存在的，而是密不可分，互為因果，彼此重疊，最終導致神經細胞的凋亡或壞死[4]。大量研究表明，腦缺血后炎癥反應在缺血再灌注損傷發病機制中具有重要地位[5]。我們課題組前期的實驗研究也已證實，缺血再灌注后核轉錄因子的表達和炎性細胞浸潤參與了腦缺血再灌注損傷過程[6]。其中TNF-α由神經細胞、小膠質細胞和血管內皮細胞產生，是一種多效性促炎性細胞因子，其表達與細胞凋亡密切相關，隨著TNF-α表達的減弱，所觸發炎性反應及神經細胞凋亡損傷也逐漸緩解[7]。此外，IL-10作為一種多功能負性調節因子，可減少巨噬細胞產生金屬蛋白酶、自由基等有毒物質；減輕興奮性神經毒性誘導的神經細胞損害；下調炎性細胞因子，阻止炎癥聯級反應，對神經細胞具有一定程度的保護作用[8]。因此，在防治大鼠缺血再灌注腦損傷中細胞凋亡中，我們可以通過減少有害細胞因子的產生，增加有利細胞因子，從而達到減少缺血再灌注神經元凋亡所引起的繼發性腦損傷[9]。保護受損細胞，是目前治療缺血性腦血管疾病的一大靶點。

此外，細胞凋亡（Apoptosis）是細胞在體內外多種因素刺激誘導下，由多種基因嚴格調控而發生的有序變化的死亡過程。有文獻報道[10，11]，PPARγ激動劑吡格列酮能促進PPARγ mRNA和蛋白的表達，活化細胞外信號調節激酶而抑制炎癥因子的表達，增強其對腦缺血再灌注損傷后腦神經的保護效應，并且與劑量呈正比關系。本研究發現經PGZ處理后的各時間段大鼠腦組織TNF-α的表達較對照組顯著降低，而IL-10的表達則相應增高，且兩者的表達呈顯著負相關，大鼠腦缺血半暗帶中神經細胞凋亡數量明顯減輕。由此我們推測，PGZ可通過下調TNF-α的釋放能力，上調抗炎介質（IL-10）的表達，發揮免疫抗炎作用，從而減少細胞凋亡。

由此可見，吡格列酮可負性調節腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中TNF-α蛋白的表達，顯著上調抗炎介質（IL-10）的釋放，減輕了缺血后再灌注損傷，從而較大程度地減輕細胞凋亡，為該藥在腦缺血再灌注損傷的治療中提供了廣闊的應用前景。

[參考文獻]

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（收稿日期：2014-09-25）

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（收稿日期：2014-09-25）