甜瓜CmERFIV-5基因cDNA的克隆·表達分析及載體構建

金烏云， 邵 琪， 郝 鑫， 鮑牧蘭， 哈斯阿古拉

(內蒙古大學生命科學學院，內蒙古自治區牧草與特色作物生物技術重點實驗室，內蒙古呼和浩特 010021)

甜瓜CmERFIV-5基因cDNA的克隆·表達分析及載體構建

金烏云， 邵 琪， 郝 鑫， 鮑牧蘭， 哈斯阿古拉*

(內蒙古大學生命科學學院，內蒙古自治區牧草與特色作物生物技術重點實驗室，內蒙古呼和浩特 010021)

[目的]研究甜瓜CmERFIV-5基因的克隆、表達分析及超表達和RNAi載體構建。 [方法]根據GenBank上登錄的甜瓜一個乙烯應答因子(ethylene responsive facter，ERF)基因cDNA序列 (登錄號：MELO3C024315) 設計合成特異性引物。應用RT-PCR技術從甜瓜品種河套蜜瓜(CucumismeloL. cv. Hetao) 成熟果實中克隆得到該基因cDNA序列，命名為CmERFIV-5，分析了該基因在甜瓜根、莖、葉及果實發育過程中的表達特性，將其構建到過量表達載體pPZP221中，得到重組植物表達載體pPZP221-CmERFIV-5。同時，構建了該基因RNAi載體pART-27-CmERFIV-5。[結果]序列分析顯示，所克隆的cDNA長度為808bp，編碼255個氨基酸。熒光實時定量PCR分析表明，CmERFIV-5基因在甜瓜根、莖、葉及不同發育時期的果實中均有表達，在葉片中表達量最高。[結論] 構建了CmERFIV-5基因的過量表達載體與RNAi載體，為進一步研究該基因的功能奠定了基礎。

甜瓜；乙烯應答因子；乙烯；表達；CmERFIV-5

乙烯是一種含2個碳原子的氣體分子，又是一種具有生物活性的氣體植物激素。1934年，Gane[1]研究證明了乙烯是植物生長發育的內源調節劑。作為植物五大類激素中的一員，乙烯參與并調控植物生長發育過程中的許多生理過程，如種子萌發、葉片衰老、根系生長、果實成熟、器官衰老、應答生物及非生物脅迫等[2-3]，其中乙烯在果實成熟衰老進程中的作用是研究重點之一。乙烯最有代表性的生物學反應是“三重反應”，由于“三重反應” 發生在植物發育的早期且是乙烯的特異反應，有利于大規模篩選乙烯突變體[4]。由此科學家們利用各種突變體材料克隆得到眾多乙烯信號轉導元件基因，建立了從信號感知到轉錄調控的乙烯信號轉導的大致線性模型，即乙烯→乙烯受體→CTR1→EIN2 →EIN3/EILs→ERF→乙烯反應[5]。

AP2/ERF是一類有眾多成員的轉錄因子超家族，根據其序列的相似性和AP2/ERF 結構域的數量，其分為 AP2、ERF和RAV 3個家族[6]。ERF家族又因所結合的順式作用元件的不同將其分為兩大類，第一類能與GCC盒結合，稱為ERF 亞家族[7]；第二類能與DRE/CRT結合，稱為CBF/DREB 亞家族[8]。此外，還有一些比較特殊的 ERF 轉錄因子，如煙草的Tsil既能與GCC盒特異性結合，又能與DRE/CRT特異性結合[9]。

甜瓜(CucumismelonL.)是一種色、香、味俱全的水果，是世界十大水果之一。2012年完成了甜瓜全基因組測序[10]，為甜瓜功能基因組研究奠定了基礎。Ma等[11]在甜瓜全基因組中對AP2/ERF轉錄因子超家族成員進行了鑒定，發現有136個成員，其中ERF家族最多，包含119個成員，聚類分析可將其分成11個群。筆者對第4個群的第5個成員的基因CmERFIV-5 cDNA進行了克隆和表達特性分析，構建了CmERFIV-5 基因過量表達載體與RNAi載體。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑所用植物材料為內蒙古地方甜瓜品種河套蜜瓜，原種由內蒙古自治區牧草與特色作物生物技術重點實驗室保存。采摘九成熟果實，取中果皮組織于液氮速凍，-80 ℃保存，用于基因克隆。采摘授粉后0、10、20、30、40 d的果實，取中果皮組織，于液氮速凍。選取甜瓜子房及30日齡根、莖、葉等不同組織,于液氮速凍，用于分析CmERFIV-5 基因的表達特性，為保證數據的可靠性，每天9：00采集樣品，采樣生物學重復3次。

RNA提取試劑盒RNAiso Plus (Total RNA extraction reagent)克隆載體pEasy?-Blunt、T4DNA 連接酶、限制性內切酶、氨芐青霉素、DNAmarker、Prime-STARTMHS DNA 聚合酶、dNTPs以及SYBR?PremixExTaqTM實時定量 PCR 試劑盒等購自大連寶生物公司；TransStart?Pfu DNA Polymerase購自北京全氏金生物技術有限公司；AMV第一鏈cDNA合成試劑盒；柱式PCR 產物純化試劑盒、柱式DNA膠回收試劑盒、柱式質粒DNA小量抽提試劑盒購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1引物設計與合成。根據GenBank上登錄的甜瓜一個乙烯應答因子(ethylene responsive facter，ERF)基因cDNA序列(登錄號：MELO3C024315)和甜瓜甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH)基因cDNA序列(序列號：AB033600)，使用Primer Premier 5.0分別設計引物。目的基因克隆引物P1：5′-GCTCTAGACACTCAGCTgTTTGTGTTTTCC-3′ (下劃線部分為XbaⅠ內切酶位點)和P2：5′-TAGGTACCCAACATCAGAAGAAGCTGGACT-3′(下劃線部分為KpnⅠ內切酶位點)。目的基因定量PCR檢測引物P3：5′-GGCTTCATTCCGCCGACTC-3′和P4：5′-GCTCCTCCACATCAAATTCCAAA-3′。內參基因定量PCR檢測引物P5：5′-ATCATTCCTAGCAGCACTGG-3′和P6：5′-TTGGCATCAAATATGCTTGACCTG-3′及RNAi載體構建引物P7：5′-TAGGATCCGAGGTGCTATAATCTCCGGCTT-3′(下劃線部分為BamHⅠ內切酶位點)、P8：5′-GAATCGATGAGCTGAAGGAACAGGAGGGT-3′(下劃線部分為ClaⅠ內切酶位點)、P9：5′-CAGGTACCGAGGTGCTATAATCTCCGGCTT-3′(下劃線部分為KpnⅠ內切酶位點)、P10：5′-TACTCGAGGAGCTGAAGGAACAGGAGGGT-3′(下劃線部分為XhoⅠ內切酶位點)，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2總RNA 提取及cDNA第一鏈的合成。采用TaKaRaTM公司RNAiso Plus試劑提取甜瓜總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，-80 ℃保存備用。取5 μl總RNA為模板，按照AMV第一鏈cDNA合成試劑盒反轉錄合成cDNA。1.2.3cDNA PCR擴增、克隆及序列分析。以cDNA第一鏈為模板，P1、P2為引物，用Prime-STARTMHS DNA 聚合酶PCR擴增，采用 25 μl反應體系，反應參數為：95 ℃預變性10 min;95 ℃變性20 s，51 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，25個循環；72 ℃延伸補平5 min。RT-PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物純化后與pEasy?-Blunt克隆載體連接，轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，陽性克隆送至上海生工生物工程有限公司測序?？寺〉玫降脑摶騝DNA序列，命名為CmERFIV-5。

將得到的測序結果與甜瓜基因庫(https://melonomics.net/)中的甜瓜ERF基因MELO3C024315序列比對，通過ORF Finder(http://www.ncbi.n lm.nih.gov/gorf.html)對CmERFIV-5序列進行開放閱讀框分析。

1.2.4基因表達特性分析。按照RNAisoPlus試劑盒說明書提取甜瓜授粉后0、10、20、30、40 d果肉總RNA。采集1/2MS 培養基中培養37 d甜瓜植株第五六片真葉、第五六片真葉間的莖段以及根樣品，提取總RNA。反轉錄合成cDNA，分別用P3和P4、P5和P6為引物，SYBR?PrimixExTaqTM實時定量PCR試劑盒進行定量PCR分析，PCR程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s；60 ℃延長30 s，共進行40個循環，數據采用2-△△CT方法進行分析[12]。將授粉后第0天的甜瓜果實基因表達量設定為1，標準偏差(SE)來自3個生物重復和3個技術重復。

1.2.5過量表達載體的構建。利用XbaⅠ和KpnⅠ酶切位點將克隆好的CmERFIV-5基因cDNA插入植物雙元表達載體pPZP221的相應多克隆位點，構建過量表達載體pPZP221-CmERFIV-5。

1.2.6RNAi載體的構建。分別用P7和P8、P9和P10兩對引物擴增CmERFIV-5基因cDNA ORF 179～445 bp的片段，雙酶切后，分別重組到中間載體pKANNIBAL的PDK內含子的兩側，構建成RNAi中間載體pKAN-CmERFIV-5；再利用NotⅠ酶切位點將pKAN-CmERFIV-5載體上的“正向序列-PDK序列-反向序列”插入到植物表達載體pART-27的NotⅠ酶切位點，構建成RNAi載體pART-27-CmERFIV-5。

2 結果與分析

2.1 cDNA克隆及序列分析經RT-PCR擴增得到約800 bp的特異性條帶，與預期相符。測序結果與甜瓜基因庫(https://melonomics.net/)中MELO3C024315序列相似度高達100%。用NCBI的ORF Finder軟件在線分析克隆序列，表明所克隆CmERFIV-5基因的cDNA全長808 bp，5′非編碼區長35 bp，3′編碼翻譯區長5 bp，預測的ORF為768bp，編碼255個氨基酸(圖1)。

2.2 基因的表達特性分析實時熒光定量PCR檢測結果表明(圖2)，CmERFIV-5基因在甜瓜根、莖、葉及不同發育時期的果實中均有表達，在葉片中的表達量最高；在不同發育時期的果實中，授粉后第40天的表達量最高，其次是第20天。

2.3 過量表達載體構建挑取轉化菌落，提取重組質粒pPZP221-CmERFIV-5，選用限制性內切酶XbaⅠ和KpnⅠ進行雙酶切鑒定，電泳結果顯示產生約0.8 kb預期片段。以質粒pPZP221-CmERFIV-5 為模板進行體外擴增，擴增出特異性片段約0.8 kb，表明已將CmERFIV-5 基因cDNA成功插入到植物表達載體pPZP221中。

2.4 RNAi載體構建用限制性內切酶NotⅠ切割重組質粒pART27-CmERFIV-5，產生約3.3 kb預期片段。以質粒pART27-CmERFIV-5為模板，PCR擴增出特異性片段約0.8 kb，表明CmERFIV-5 基因的RNAi載體構建成功。

3 討論

ERF類轉錄因子屬于AP2/ERF家族，主要調控乙烯應答以及相關逆境響應基因的表達,且在植物抵抗生物與非生物脅迫過程中發揮重要作用[13-15]。目前有關ERF在果實成熟衰老過程中的研究較少。番茄LeERF2(AAO34704,第Ⅶ族ERF)的表達水平在果實成熟衰老過程中呈增強趨勢[16]，表明參與了果實的成熟衰老進程。在蘋果中ERF家族成員MdERF1主要在成熟果實中表達，在其他組織中很少表達，研究認為同屬于Ⅶ族ERF的蘋果MdERF1與番茄LeERF2在果實成熟衰老過程中起相似的作用[17]。葡萄果實中的ERF1基因表達量自始熟期持續增加，直至完熟期轉錄水平達到最高，表明乙烯信號途徑可以在果實始熟期之后對果實成熟衰老發揮重要調控作用[18]。轉基因研究進一步顯示，抑制屬于第V族ERF的LeERF1(AAL75809)可有效延緩番茄果實的成熟過程[19]，表明ERF在果實成熟衰老過程中具有重要的調控作用。在甜瓜中，ERF亞家族基因共有64個，分為6個亞族[11]，為研究其第IV組第5個成員CmERFIV-5在甜瓜植株生長發育及果實成熟中的功能，該研究進行了甜瓜CmERFIV-5基因的克隆、表達分析及超表達和RNAi載體構建。該基因在葉片中的表達量最高；在果實發育的不同階段，CmERFIV-5基因表達水平不同，總體呈上升趨勢，推測CmERFIV-5基因在甜瓜葉和果實成熟中發揮作用。

4 結論

該研究以甜瓜品種河套蜜瓜為材料，克隆了CmERFIV-5基因 cDNA，長度為808 bp，編碼255個氨基酸；CmERFIV-5基因在甜瓜根、莖、葉及不同發育時期的果實中均有表達，在葉片中表達量最高；構建了CmERFIV-5基因的過量表達與RNAi載體，為進一步研究該基因的功能奠定了基礎。

[1] GANE R.Production of ethylene by some ripening fruits[J].Nature,1934,134(3400):1008.[2] BLEECKER A B,KENDE H.Ethylene:a gaseous signal molecule in plants[J].Annual Review of Cell and Developmental Biology,2000,16(1):1-18.[3] YAU C P,WANG L,YU M,et al.Differential expression of three genes encoding an ethylene receptor in rice during development,and in response to indole-3-acetic acid and silver ions[J].Journal of Experimental Botany,2004,55(397):547-556.

[4] ECKER J R.The ethylene signal transduction pathway in plants[J].Science,1995,268(5211):667-675.

[5] WANG W,ESCH J J,SHIU S H,et al.Identification of important regions for ethylene binding and signaling in the transmembrane domain of the ETR1 ethylene receptor ofArabidopsis[J].The Plant Cell Online,2006,18(12):3429-3442.

[6] NAKANO T,SUZUKI K,FUJIMURA T,et al.Genome-wide analysis of the ERF gene family inArabidopsisand rice[J].Plant Physiology,2006,140(2):411-432.

[7] HAO D,OHME-TAKAGI M,SARAI A.Unique mode of GCC box recognition by the DNA-binding domain of ethylene-responsive element-binding factor (ERF domain) in plant[J].Journal of Biological Chemistry,1998,273(41):26857-26861.

[8] THOMASHOW M F.Plant cold acclimation:freezing tolerance genes and regulatory mechanisms[J].Annual Review of Plant Biology,1999,50(1):571-599.

[9] PARK J M,PARK C J,LEE S B,et al.Overexpression of the tobacco Tsi1 gene encoding an EREBP/AP2-type transcription factor enhances resistance against pathogen attack and osmotic stress in tobacco[J].The Plant Cell Online,2001,13(5):1035-1046.

[10] GARCIA-MAS J,BENJAK A,SANSEVERINO W,et al.The genome of melon (CucumismeloL.)[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2012,109(29):11872-11877.

[11] MA Y,ZHANG F,BADE R,et al.Genome-wide identification and phylogenetic analysis of the ERF gene family in melon[J].Journal of Plant Growth Regulation,2015,34(1):66-77.

[12] LIVAK K J,SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod[J].Methods,2001,25(4):402-408.

[13] 劉強,趙南明.DREB 轉錄因子在提高植物抗逆性中的作用[J].科學通報,2000,45(1):11-16.

[14] LIU L,WHITE M J,MACRAE T H.Transcription factors and their genes in higher plants[J].European Journal of Biochemistry,1999,262(2):247-257.

[15] YAMAGUCHI-SHINOZAKI K,SHINOZAKI K.Transcriptional regulatory networks in cellular responses and tolerance to dehydration and cold stresses[J].Annu Rev Plant Biol,2006,57:781-803.

[16] TOURNIER B,SANCHEZ-BALLESTA M T,JONES B,et al.New members of the tomato ERF family show specific expression pattern and diverse DNA-binding capacity to the GCC box element[J].FEBS Letters,2003,550(1):149-154.

[17] WANG A,TAN D,TAKAHASHI A,et al.MdERFs,two ethylene-response factors involved in apple fruit ripening[J].Journal of Experimental Botany,2007,58(13):3743-3748.

[18] DELUC L,GRIMPLET J,WHEATLEY M,et al.Transcriptomic and metabolite analyses of Cabernet Sauvignon grape berry development[J].BMC Genomics,2007,8(1):429.

[19] LI Y,ZHU B,XU W,et al.LeERF1 positively modulated ethylene triple response on etiolated seedling,plant development and fruit ripening and softening in tomato[J].Plant Cell Reports,2007,26(11):1999-2008.

Cloning，Expression Analysis and Vector Construction of theCmERFIV-5 Gene cDNA from Melon (CucumismeloL.)

JIN Wu-yun， SHAO Qi， HAO Xin， HASI Agula*et al

( College of Life Sciences,Inner Mongolia University;Inner Mongolia Key Laboratory of Herbage &Endemic Crop Biotechnology,Hohhot,Inner 010021)

[Objective] The aim was to study cloning，expression analysis and vector construction of theCmERFIV-5 gene cDNA from melon (CucumismeloL.)[Method]A pair of specific primer was designed according to the cDNA nucleotide sequence in GenBank (accession number: MELO3C024315) of an ethylene responsive facter gene cDNA from melon(CucumismeloL. cv. Hetao). The cDNA of the gene was cloned by RT-PCR from mature fruit of melon, which the gene was namedCmERFIV-5. The gene expression patterns were characterized inCucumismeloL.melon root，stem，leaf and fruit of different developmental stage . The cDNA of theCmERFIV-5 was cloned into the overexpression vector pPZP221 to construct the recombinant plant expression vector pPZP221-CmERFIV-5. Meanwhile, the RNAi vector pART-27-CmERFIV-5 was constructed. [Result]Sequence analysis indicated that the cDNA was 808 bp which incodes a polypeptide of 255 amino acids. Quantitative real-time PCR analysis showed that theCmERFIV-5 expressed ubiquitously in roots, stems, leaves and different developmental stages of fruit and the highest transcription was in leaves.[Conclusion] Overexpression vector and RNAi vector ofCmERFIV-5 gene was constructed, and laid the foundations for the further research of the gene function .

Melon; Ethylene responsive facter; Ethylene; Express;CmERFIV-5

國家自然科學基金項目(31360486)。

金烏云(1991- )，女，內蒙古興安盟扎賚特旗人，碩士研究生，研究方向：植物分子生物學及基因工程。*通訊作者，博士，教授，從事植物分子生物學及基因工程研究。

2015-04-02

S 652

A

0517-6611(2015)14-030-03