人工種植與道地野生的金蓮花藥用品質比較及超聲波提取多糖工藝優化

梁永鋒

摘要：為測定人工種植的金蓮花（Trollius chinensis Bunge）中多糖提取率和探索超聲波輻射輔助下多糖提取的最佳工藝，并通過人工種植與道地野生的金蓮花中多糖提取率的比較，實施對人工種植金蓮花的藥用品質評價；試驗在超聲波輻射下，用水提醇沉法提取金蓮花多糖、三氯乙酸法除去蛋白、苯酚-硫酸法測多糖含量，通過單因素試驗和正交試驗，比較了超聲波輻射條件下超聲波輻射功率、超聲波輻射時間、料液比、提取溫度對多糖提取率的影響。結果人工種植的金蓮花多糖提取率為2.94 %，最佳提取工藝條件是超聲波輻射功率300 W、料液比1∶25、超聲波輻射時間30 min、提取溫度80 ℃。這個結果顯示人工種植的金蓮花多糖含量較高，完全能滿足藥用需求。

關鍵詞：金蓮花（Trollius chinensis Bunge）；人工種植；多糖；提取工藝；藥用品質；評價

中圖分類號：Q949.746.5；Q539；R282.5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）22-5456-04

植物多糖具有抗感染、抗氧化、抗衰老、抗癌、抗病毒、降血糖、降血壓和增強機體免疫力等重要的藥理作用[1]，且植物多糖來源廣泛、毒副作用低、安全性好、無致癌作用[2]。中藥金蓮花為毛茛科（Ranunculaceae）植物金蓮花屬（Trollius L.）金蓮花（T. chinensis Bunge）的花、花蕾干燥品，其味苦、性寒、無毒，可治療口瘡喉腫、浮熱牙宣、耳疼目痛等癥[3]。現代藥理研究表明，金蓮花具有抗菌、抗病毒等活性，用于治療慢性扁桃體炎、急性鼓膜炎、發燒、感冒、尿路感染等病。研究表明，金蓮花中主要含有黃酮類、有機酸、糖類、蛋白質等[4]成分；目前對野生金蓮花的蛋白質、黃酮類、有機酸類化合物的提取分離和藥理活性進行了廣泛的研究[5-9]，而對人工種植的金蓮花和野生金蓮花的多糖提取分離的報道不多。隨著市場需求量的不斷增加，野生金蓮花已經遠遠不能滿足需求；近年來各地人工種植金蓮花的規模越來越大，人工種植金蓮花的藥用品質也越來越受到廣泛的關注。試驗對超聲波提取多糖的影響因素及工藝條件進行了探索與優化，分析了寧夏回族自治區隆德縣種植的金蓮花多糖的提取率，通過人工種植與道地野生金蓮花多糖提取率的比較，對人工種植金蓮花的藥用品質進行了評價。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試驗用試劑有石油醚、丙酮、80%乙醇、95%乙醇、苯酚、H2SO4（98%）、NaOH、葡萄糖、無水乙醇、CHCl3、正丁醇等，均為國產分析純，水為純凈水。

儀器主要有UV-2450型紫外可見光分光光度計（日本株式會社島津制作所）、FW-177型中草藥粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）、101-1AB型電熱恒溫鼓風干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司）、DZ-2BCII標準型真空干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司）、750型超聲波處理器（美國Sonica公司）、 pHs-2C型精密酸度計（上海雷磁儀器廠）、RE-52A旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）、L-S電子天平（梅特勒-托利多儀器公司，感量萬分之一）。

1.2 藥材及處理

人工種植的金蓮花采自寧夏回族自治區隆德縣西北中藥材有限責任公司種植基地；分別產于山西省五臺山、河北省承德市、吉林省長白山、內蒙古自治區赤峰市的野生金蓮花購于寧夏明德中藥飲片有限公司，由注冊藥劑師鑒定。將人工種植和野生的金蓮花樣品分別放入恒溫箱中，烘干至恒重，取出后自然陰干，粉碎，過80目篩，依次用石油醚、丙酮處理2 次，除去脂類和色素，再用80 %乙醇處理2次，除去單糖、低聚糖苷類等物質，干燥至恒重，得到預處理的5個產地的金蓮花樣品，備用。

1.3 多糖提取方法

1.3.1 標準曲線的建立 取適量葡萄糖于電熱恒溫鼓風干燥箱中105 ℃烘至恒重[10]，精確稱取10.0 mg，加純水溶解并定容至100 mL，配置成質量濃度為0.1 mg/mL的標準溶液。分別精確移取葡萄糖標準液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL于25 mL具塞刻度試管中，再分別以純水補至2.0 mL，依次加入5 %苯酚溶液1.0 mL和濃硫酸5.0 mL，振搖均勻，靜置 20 min；以不加葡萄糖標準液的空白為參比，在分光光度計490 nm波長處測定吸光度，以吸光度為橫坐標（x），相對應的葡萄糖含量為縱坐標（y），則標準方程為：y=0.083 3 x-0.000 67，R2=0.998 7；這個方程表明，葡萄糖標準品與吸光度具有良好的線性關系。

1.3.2 金蓮花多糖的提取 準確稱取預處理的金蓮花樣品1.00 g，加適量純凈水于50 ℃浸泡，按各種提取條件（料液比、超聲波輻射功率、超聲波輻射時間、提取溫度）進行超聲波提取；在4 000 r/min離心15 min后取上清液，將濾渣在同樣的條件下再浸提1次，合并2次所得濾液，減壓濃縮，向濃縮液中加入1/4體積的5 %三氯乙酸溶液，混合30 min，3 500 r/min 離心10 min，取上清液，重復2 次，至無明顯沉淀為止。向上清液中緩緩加入95%的乙醇，并用玻璃棒緩慢攪拌，使乙醇濃度達到80 %。靜置 4～5 h，4 000 r/min 離心 5 min，過濾沉淀物即為粗多糖，再于40 ℃環境中真空干燥，干燥后稱重。

1.3.3 多糖含量的測定 準確稱取 20.00 mg多糖粗品溶于水中， 定容于250 mL 容量瓶中，用分光光度計測定波長490 nm處的樣品吸光度，按下式計算多糖提取率。

多糖提取率=[（m1×y×250）/20×m2]×100%；

式中，m1為從金蓮花樣品中提取的粗多糖質量（g），m2為金蓮花樣品質量（g），y為標準方程計算所得到的多糖質量濃度（mg/mL）。

1.4 多糖提取工藝試驗

1.4.1 單因素提取比較 ①料液比對多糖提取的影響。稱取1.00 g預處理的人工種植金蓮花樣品5份，設置超聲波輻射功率300 W、提取溫度80 ℃、超聲波輻射時間30 min、浸泡時間60 min，料液比（金蓮花樣品∶水）處理分別設置為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，比較不同料液比處理對金蓮花樣品多糖提取的影響。② 超聲波輻射功率對多糖提取的影響。稱取1.00 g預處理的人工種植金蓮花樣品5份，設置超聲波輻射時間30 min、料液比1∶25、提取溫度80 ℃、浸泡時間60 min，超聲波輻射功率處理分別設置為100、200、300、400、500 W，比較不同超聲波輻射功率處理對金蓮花樣品多糖提取的影響。③ 提取溫度對多糖提取的影響。稱取1.00 g預處理的人工種植金蓮花樣品5份，設置超聲波輻射功率300 W、料液比1∶25、超聲波輻射時間30 min、浸泡時間60 min，提取溫度處理分別設置為50、60、70、80、90 ℃，比較不同提取溫度處理對金蓮花樣品多糖提取的影響。④ 超聲波輻射時間對多糖提取的影響。稱取1.00 g預處理的人工種植金蓮花樣品5份，設置超聲波輻射功率300 W、料液比1∶25、提取溫度80 ℃、浸泡時間60 min，超聲波輻射時間處理分別設置為10、20、30、40、50 min，比較不同超聲波輻射時間處理對金蓮花樣品多糖提取的影響。

1.4.2 正交試驗篩選 為了綜合考查多項提取因素對多糖提取率的影響，根據單因素處理的比較結果，試驗采用L9（34）正交試驗對提取過程中超聲波輻射功率（A）、料液比（B）、提取溫度（C）和超聲波輻射時間（D）及不同水平進行了研究，并做方差分析，以篩選提取金蓮花中多糖的最佳工藝條件。各因素與水平設置見表1。

1.4.3 驗證試驗 取預處理后的人工種植金蓮花樣品，在正交試驗所得到的優化提取工藝條件下進行多糖提取，重復3次，取均值；以驗證正交試驗篩選結果的真實性與正確性。

1.4.4 不同產地野生金蓮花與人工種植金蓮花多糖提取率比較 將寧夏回族自治區隆德縣人工種植的金蓮花和分別產于山西省五臺山、河北省承德市、吉林省長白山、內蒙古自治區赤峰市的野生金蓮花經預處理后，在正交試驗所得到的優化提取工藝條件下進行多糖提取，重復3次，取均值；比較4個產地野生金蓮花與人工種植金蓮花在多糖提取率方面的差異。

2 結果與分析

2.1 單因素處理對金蓮花多糖提取的影響

2.1.1 料液比對金蓮花多糖提取的影響 料液比對金蓮花多糖提取的影響結果見表2。從表2可見，料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30處理后，金蓮花多糖提取率依次為1.41%、1.49%、1.61%、1.64%、1.66%，表明多糖的提取率隨料液比的降低而增加。分析認為，這是因為隨著料液比的降低，溶劑與原料充分接觸，增強了二者的傳質作用，使多糖的提取率增大；但當料液比小于1∶25時，隨著料液比的降低，提取率上升的幅度趨緩，可能是由于當金蓮花的多糖絕大部分被溶出后提取率達到了一個穩定的水平所致；因此確定料液比1∶25為金蓮花多糖提取的適宜料液比水平。

2.1.2 超聲波輻射功率對多糖提取的影響 超聲波輻射功率對金蓮花多糖提取的影響結果見表2。從表2可見，超聲波輻射功率分別為100、200、300、400、500 W處理后，金蓮花的多糖提取率分別為1.38%、1.69%、2.16%、2.17%、2.19%，表明隨著超聲波輻射功率的增大，金蓮花多糖的提取率也在增大，可能是隨著超聲波輻射功率的增大，對細胞的破壞作用增強，從而利于多糖的浸出。當超聲波輻射功率超過300 W后，多糖提取率的增大明顯趨緩；為節省能源起見，確定超聲波輻射功率以300 W 為宜。

2.1.3 提取溫度對多糖提取的影響 提取溫度對金蓮花多糖提取的影響結果見表2。從表2可見，提取溫度分別在50、60、70、80、90 ℃時，金蓮花的多糖提取率分別為1.13%、1.35%、2.16%、2.19%、2.17%，表明在60～80 ℃范圍內，隨著提取溫度的升高，金蓮花多糖的提取率在逐漸增大；而超過80 ℃時多糖提取率反而下降。考慮到防止多糖在高溫下降解，故確定80 ℃是金蓮花多糖提取的適宜溫度。

2.1.4 超聲波輻射時間對多糖提取的影響 超聲波輻射時間對金蓮花多糖提取的影響結果見表2。從表2可見，超聲波輻射時間分別是10、20、30、40、50 min時，金蓮花的多糖提取率分別為1.61%、1.65%、1.77%、1.75%、1.72%，說明隨著超聲波輻射時間的延長金蓮花多糖的提取率在逐漸增加，以超聲波輻射30 min時的提取率最高；但是當輻射時間大于30 min時，提取率反而降低。這可能是由于多糖的熱穩定性較差，隨著超聲波輻射時間的增加造成部分多糖變性，使多糖提取率降低。因此試驗確定的超聲波輻射適宜時間是30 min。

2.2 多因素對金蓮花中多糖提取的影響

根據單因素處理的比較結果，試驗確定了4個因素的合理水平進行L9（34）正交試驗，結果見表3。從表3的直觀分析顯示，影響金蓮花多糖提取的最主要因素是溫度，影響因素大小依次為C>B>D>A，即提取溫度>超聲波輻射功率>超聲波輻射時間>料液比；最佳工藝條件是A2B3C2D2。方差分析結果顯示（表4），超聲波輻射下提取金蓮花中多糖的影響因素是提取溫度，而超聲波輻射功率、料液比和超聲波輻射時間對多糖的提取無顯著影響，因此，在提取過程中應嚴格控制提取溫度，并要把超聲波輻射功率適當降低。

根據正交試驗結果的直觀分析和方差分析，綜合考慮，最佳提取工藝為提取溫度80 ℃、料液比1∶25、超聲波輻射功率300 W、超聲波輻射時間30 min。