氮、磷添加對不同林型土壤磷酸酶活性的影響

鄭棉海, 黃 娟, 陳 浩, 王 暉, 莫江明,*

1 中國科學院華南植物園, 中國科學院退化生態系統植被恢復與管理重點實驗室, 廣州 510650 2 中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所, 國家林業局森林生態環境重點實驗室, 北京 100091 3 中國科學院大學, 北京 100039

氮、磷添加對不同林型土壤磷酸酶活性的影響

鄭棉海1,3, 黃 娟1, 陳 浩1,3, 王 暉2, 莫江明1,*

1 中國科學院華南植物園, 中國科學院退化生態系統植被恢復與管理重點實驗室, 廣州 510650 2 中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所, 國家林業局森林生態環境重點實驗室, 北京 100091 3 中國科學院大學, 北京 100039

研究了鼎湖山3種森林類型(南亞熱帶季風常綠闊葉林、馬尾松人工林和針葉闊葉混交林)的土壤酸性磷酸單酯酶活性(APA)對施肥的響應情況。在3種林型中分別設置對照、加氮(150 kg N hm-2a-1)、加磷(150 kg P hm-2a-1)以及N和P同時添加(150 kg N hm-2a-1+150 kg P hm-2a-1)4種不同處理。結果表明，季風林土壤APA((15.83±2.46) μmol g-1h-1)顯著高于混交林((10.71±0.78) μmol g-1h-1)和馬尾松林((9.12±0.38) μmol g-1h-1)，且3種林型土壤APA與土壤有效磷含量均呈顯著負相關。施加N肥顯著提高了季風林土壤APA，而對混交林和馬尾松林的作用不顯著。施加P肥顯著降低了混交林和馬尾松林土壤APA，但對季風林的影響不明顯。N和P同時添加僅顯著降低了馬尾松林土壤APA，但在季風林中存在交互作用。因此，N沉降會加劇亞熱帶成熟林土壤P的限制，可以考慮施加P肥作為森林管理的一種方式來緩解這種限制作用。

酸性磷酸酶活性; 氮沉降; 氮添加; 磷添加; 磷限制; 鼎湖山

磷(P)是自然界中的基本礦質元素，它不僅參與生物細胞膜的合成、酶的活化以及信號的轉導[1]，同時也是構成絕大多數生物能源物質(ATP)的重要成分[2]。然而，P的缺乏導致許多森林植物和土壤生物的生長受到限制。尤其在熱帶森林中，長期的風化淋溶和生物吸收使土壤P的含量逐漸減少，所以熱帶成熟林生產力普遍受到P的限制[3-4]。土壤磷酸酶在土壤P的循環中起重要的作用，即它可以將土壤中的復雜有機P水解成可被生物直接吸收的無機P，從而緩解了土壤P的限制[5]。因此，土壤磷酸酶活性的高低直接反映了土壤P的基本狀況。

有研究認為，人類活動引起大氣氮(N)沉降的增加將會加劇土壤P的限制，進而改變土壤磷酸酶的活性[6-8]。據統計，目前全球多數地區的N沉降速率已經超過10 kg N hm-2a-1[9]，而我國N沉降以每年0.41 kg/hm2的速率增加，僅在2000年的記錄就達到了21.1 kg N hm-2a-1[10]。長期N沉降對森林植物和土壤生物的生長造成危害[11]，尤其是N沉降引起的土壤P限制將會進一步抑制森林生物的生長。多數研究表明，長期N沉降或施加N肥提高了溫帶森林土壤的磷酸酶活性[12-14]，但目前關于N沉降影響熱帶或亞熱帶森林土壤磷酸酶活性的報道很少。前期，在亞熱帶森林(鼎湖山)的研究已經發現，長期N沉降可能引起土壤P的限制并提高了土壤的磷酸酶活性[15]，然而這種限制作用是否可以通過施加P肥得到緩解需要進一步的研究。

鼎湖山處于南亞熱帶地區，并且長期受到大氣N沉降的影響。據估計，2004—2005年該地區大氣中的無機氮和有機氮輸入分別達到32—34 kg N hm-2a-1和18 kg N hm-2a-1[16]。此外，鼎湖山土壤呈酸性，因此通過測定土壤酸性磷酸單酯酶活性(Acid Phosphomonoesterase Activity，APA)可以直接了解土壤P的狀況。本研究的目的是通過原位的N、P添加試驗，研究N沉降對亞熱帶森林土壤APA的影響，同時探索P素輸入是否可以緩解N沉降對森林土壤P的限制，進而為N沉降不斷增加背景下的亞熱帶森林管理提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 樣地基本概況

鼎湖山自然保護區位于廣東省中部(112°30′—112°33′E，23°09′—23°11′N)，占地面積約1200 hm2。該地屬亞熱帶季風濕潤型氣候，年降水量為1927 mm，其中75% 分布在3月至8月，而12月至2月僅占6%；年平均氣溫為21 ℃，最冷月(1月)和最熱月(7月)氣溫分別為12.6 ℃和 28.0 ℃[17]。

該保護區主要包括3種典型的森林類型，即馬尾松人工林(PinusmassonianaForest，簡稱馬尾松林(PF))、針葉闊葉混交林(Mixed Pine and Broadleaf Forest，簡稱混交林(MF))和季風常綠闊葉林(Monsoon Evergreen Broadleaf Forest，簡稱季風林(MEBF))。馬尾松林由人工種植于1930年，覆蓋面積占保護區面積約20%，其主要植被為馬尾松(Pinusmassoniana)[18]。混交林是由人工種植的馬尾松林被一些闊葉樹種入侵而形成的針葉、闊葉混交樹林，其占地面積約50%，主要植被為馬尾松、荷木(Schimasuperba)和中華錐(Castanopsischinensis)等[18]。季風林占保護區面積20%，其主要樹種為中華錐、荷木、黃果厚殼桂(Cryptocaryaconcinna)和中華楠(Machiluschinensis)等[19]。馬尾松林和混交林分別在1930—1998年和1930—1956年受到人類活動的干擾(如收割地表植被和凋落物等)，而季風林則受到長期的保護[18,20]。3種森林類型的土壤基本概況見表1。

表1 2013年鼎湖山3種森林類型的土壤基本概況

1.2 樣地設計

2007年，在鼎湖山季風林、混交林和馬尾松林分別建立了20個5 m×5 m的N、P添加樣方。每個樣方之間留有5m寬的緩沖帶，以防樣方之間的相互干擾。按照析因設計的原則，在3個林子中分別設置對照、加N(150 kg N hm-2a-1)、加P(150 kg P hm-2a-1)、N和P同時添加(150 kg N hm-2a-1+150 kg P hm-2a-1)4個處理，每個處理各5個重復，且所有的樣方均隨機分布。本研究所用的樣方大小及施肥量均參考國際上同類研究的處理方法[21]。2007年1月至2013年7月(6a)，每兩個月對3個林子的林下層進行一次施肥處理。方法是將每個樣方所施加的N(NH4NO3)、P(NaH2PO4)或者N+P(NH4NO3+NaH2PO4)溶解于5 L水中，用背式噴霧器人工來回進行噴灑。對照樣方噴灑等量的水，以減少因外加的水對森林生物地球化學循環造成影響。

1.3 采樣和處理

2013年7月，在季風林、混交林和馬尾松林土壤分別進行隨機布點采樣。在每個樣方中用內徑為2.5 cm的土鉆隨機鉆取3鉆土，取土深度為0—10 cm(前期研究認為鼎湖山森林10—20 cm土層APA對施肥的響應規律與0—10 cm基本一致[22])。將每個樣方所鉆的土混合均勻并挑出細根和石粒等雜物，通過2mm的土篩后分成兩部分：一部分保存在4 ℃的冰箱，并于14d內完成對土壤APA的分析[23]；另一部分風干后用于測定土壤的理化性質。

1.4 測定方法

土壤APA的測定參照Schneider 等的方法[24]，并進行適當的改進。具體操作即稱取1 g鮮土樣品置于50 mL 錐形瓶中，加入4 mL 緩沖液(MUB)和1 mL 質量濃度為100 mmol/L 的對硝基酚底物(p-NPP)。蓋上瓶蓋后充分搖勻，并在37 ℃下培養1 h。待培養結束后，立即加入1 mL CaCl2(0.5 mol/L)和 4 mL NaOH(0.5 mol/L)以終止反應。反應結束后，所有樣品均用90 mL蒸餾水進行稀釋，并用濾膜(Whatman-42 filter)過濾去除雜質。濾液在400 nm波長下進行比色以測定吸光值。磷酸酶活性的單位用μmol g-1h-1表示。

1.5 統計分析

所有數據均用SPSS 21.0統計軟件進行分析。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和最小顯著極差法(LSR)比較不同森林類型土壤理化指標和APA的差異顯著性。用兩因素方差分析(two-way ANOVA)比較N、P及NP處理對土壤APA的影響。用Pearson相關系數評價土壤APA與土壤理化性質之間的相關性。如無特別說明，顯著性水平均設為P< 0.05。

2 結果與分析

2.1 3種林型土壤APA與土壤理化性質的關系

3種森林類型(季風林、混交林和馬尾松林)土壤APA分別為(15.83±2.46)、(10.71±0.78)、(9.12±0.38) μmol g-1h-1。不同森林類型土壤APA之間的差異達到顯著水平(P=0.021)，季風林土壤APA顯著高于混交林和馬尾松林，但混交林與馬尾松林土壤APA之間沒有顯著差異(表1)。

從表2得知，季風林土壤APA與AP和pH之間均存在顯著相關性，相關系數R分別為-0.451和-0.459。混交林土壤APA與AP、TP、AP/TP、TP/TN、AP/AN均有極顯著相關性(P< 0.005)，相關系數分別達到-0.756、-0.614、-0.767、-0.701和-0.745。馬尾松林土壤APA與土壤理化性質之間的相關性與混交林相似，即與AP、TP、AP/TP、TP/TN、AP/AN均存在顯著相關性，相關系數分別為：-0.524、-0.485、-0.537、-0.523和-0.523。

表2 不同森林類型土壤APA與土壤理化性質的相關性(n=20)

2.2 N、P添加對3種林型土壤APA的影響

從圖1可以看出，(1)N添加處理使季風林土壤APA顯著提高了131.96% ；在混交林和馬尾松林中，施加N肥分別使土壤APA降低了10.55% 和17.76%，但差異均不顯著；(2)P添加處理分別使季風林、混交林和馬尾松林土壤APA降低了32.41% 、56.12% 和41.67%，但只在混交林和馬尾松林中的作用達到顯著水平；(3)N和P同時添加使季風林土壤APA輕微增加了1.64%，使混交林和馬尾松林土壤APA分別降低28.94% 和30.15%，其中對馬尾松林的作用達到顯著水平。兩因素方差分析表明，N和P同時添加在季風林中存在交互作用(P=0.008)，而在混交林和馬尾松林中的作用均不顯著。

3 討論

3.1 3種林型土壤APA的差異

鼎湖山森林土壤APA為9.23—15.83 μmol g-1h-1，在熱帶森林的研究范圍3.89—23.26 μmol g-1h-1內[26-28]。3種不同林型的土壤APA與土壤AP之間均存在顯著負相關(表2)，這與Allison等[29]的研究結果一致。原因可能是在土壤處于缺P的情況下，土壤微生物或植物根系可能通過生物固持和吸收等多種方式繼續消耗土壤AP[30]，而土壤AP的缺乏也將促進微生物或者植物釋放出更多的磷酸酶來獲取P[31-32]。這表明鼎湖山森林土壤AP的缺乏間接提高了土壤APA。

圖1 氮、磷添加對不同森林類型土壤酸性磷酸酶活性的影響Fig.1 Effect of N and P addition on soil APA in different forest typesMEBF:季風林 monsoon evergreen broadleaf forest; MF:混交林 mixed pine and broadleaf forest; PF:馬尾松林 Pinus massoniana forest; APA:酸性磷酸酶活性acid phosphatase activity; C:對照 control; N:施加N肥 N addition; P:施加P肥 P addition; NP:同時施加N肥和P肥combined N and P addition; 同一林型中不同字母表示差異達到顯著水平(P < 0.05); Different letters indicated significant differences (P < 0.05) among treatments in the same forest type; ** 表示交互作用達到極顯著水平(P < 0.01); Significant level of interactive effect (P < 0.01); ns 表示不存在交互作用(P > 0.05); no significant level of interactive effect (P > 0.05)

本研究發現季風林土壤APA和AP均顯著高于混交林和馬尾松林(表1)，該結果并不支持多數研究得出的結論，即土壤AP的缺乏可能會激發植物或者微生物分泌磷酸酶來獲取P[30-33]。先前的研究認為季風林較高的生物多樣性是導致土壤有較高APA的主要原因[15]。此外， 養分失衡和較高的年凋落物量也是導致季風林土壤有較高APA的可能原因。鼎湖山森林位于高N沉降的南亞熱帶地區，長期N素輸入已使季風林土壤達到N飽和[16]，進而增加了植物對P元素的需求[34]。本研究發現，季風林土壤TP/TN顯著低于混交林和馬尾松林(表1)，這暗示了季風林土壤P已處于相對缺乏的狀態。另外，相比混交林和馬尾松林，季風林具有較高的年凋落物量[35]。大量的凋落物輸入提供給土壤豐富的有機質和分解底物，進而增加了微生物對土壤胞外酶的分泌[36]。

此外，混交林和馬尾松林土壤APA還與土壤TP、AP/TP、TP/TN、AP/AN均呈顯著負相關(表2)。這表明混交林和馬尾松林土壤APA對土壤P含量變化的響應可能比季風林敏感。

3.2 N、P添加對3種林型土壤APA的影響

3.2.1 N添加對3種林型土壤APA的影響

在溫帶森林，Keeler等[14]通過長期的N肥添加試驗，發現施加N肥(100 kg N hm-2a-1)提高了松林、楓葉林和楊樹林等林地的土壤APA，平均增量為13%；Saiya-Cork等[13]也發現，長期N肥添加(30 kg N hm-2a-1)使溫帶闊葉林土壤APA增加了約17%。本研究同樣發現，N添加顯著提高了南亞熱帶季風林土壤APA，且增量高達131.96%。其原因可能是磷酸酶蛋白由C、N等基本元素構成，施加N肥在一定程度上促進了磷酸酶的合成[7]；或者是因為長期施加N肥提高了土壤微生物對其他養分的需求(尤其是P元素)，所以微生物通過分泌更多的磷酸酶來獲取有效P[33]。但本研究季風林樣地的土壤APA對施加N肥的響應(=131.96%)遠比其他多數研究樣地(=17%—26%)[6,13-14,33]強烈，這可能與本樣地施加了較高的N肥量(150 kg N hm-2a-1)有關。該結果表明，長期高N沉降可能會加劇季風林土壤P的限制[34]。

然而，施加N肥沒有顯著提高混交林和馬尾松林的土壤APA，這與Cusack等[37]和Weand等[38]的研究結果相似。有研究認為當土壤達到N飽和時，植物和微生物才開始分泌磷酸酶獲取P素，所以土壤N的飽和度也會影響土壤APA[38]。Huang等[22]通過對鼎湖山森林進行長期的N沉降試驗研究，認為由于混交林和馬尾松林土壤長期處于N限制的狀態，所以長期施加N肥(7a)沒有使土壤從N限制向P限制轉變。因此，本研究施加N肥沒有引起混交林和馬尾松林土壤APA的變化，很可能是因為這兩個林分土壤仍處于N限制狀態[39]，以至于無法刺激植物和土壤微生物分泌更多的磷酸酶。

3.2.2 P添加對3種林型土壤APA的影響

Wang等[40]通過短期(< 1a)單次P肥添加試驗，發現施加P肥抑制了桉林土壤APA，其中高P處理(150 kg N hm-2)比低P處理(75 kg N hm-2)更加明顯。Olander和Vitousek[27]通過對夏威夷群島不同時間序列的土壤進行長期施肥研究(4—11a)，結果表明施加P肥(100 kg N hm-2a-1)均顯著降低了各年齡段的土壤APA。本研究也發現P肥添加顯著降低了混交林和馬尾松林土壤APA。這可能是因為施加P肥直接抑制了土壤微生物或植物根系對磷酸酶的分泌[41]，或者通過降低土壤微生物對P的需求，從而使微生物減少了用于合成磷酸酶的能量投入[27]。此外，長期施加P肥還可能導致土壤可利用性C和N的供應量不足，進而減少了用于合成磷酸酶蛋白的原材料[42]。

但是，本研究發現施加P肥沒有顯著降低季風林土壤APA，這與許多研究的結論[7, 27, 42]不一致。已有多數研究認為長期外源P素的輸入會降低微生物對P的需求，進而減少了微生物對磷酸酶的分泌并抑制土壤APA[27, 38]。然而在鼎湖山季風林樣地中，長期施加P肥同時也顯著提高了季風林土壤的微生物總量[35]。土壤微生物量的增加在一定程度上提高了微生物對P的總需求[43]。因此，施加P肥沒有顯著抑制季風林土壤APA，可能與季風林土壤微生物對P的總需求增加有關。

3.2.3 N和P同時添加對3種林型土壤APA的影響

N和P同時添加均降低了混交林和馬尾松林土壤APA，其中在馬尾松林中的抑制作用達到顯著水平(圖1)，這與Olander和Vitousek[27]的研究結果一致。產生該現象的原因可能是本試驗的NP處理無法滿足這兩種林型的植物和土壤微生物對N素的需求。本研究所采用的N、P施肥比例為1∶1，遠低于植物(28∶1)[44]和土壤微生物(7∶1)[43]的平均需求水平。因此，長期的NP處理可能導致植物或微生物的生長受到N的限制，從而降低了它們對土壤P的需求并抑制了磷酸酶的分泌。

然而，NP處理卻輕微提高了季風林土壤APA，但不顯著。這可能是因為季風林土壤長期處于N飽和狀態[16]，本研究進行為期6a的NP處理還不足以使該樣地植物或土壤微生物出現N限制的情況。隨著施肥時間的延長，NP處理是否將會抑制季風林土壤APA還有待于進一步研究。

此外，本研究還發現N和P同時添加對季風林土壤APA的影響存在交互作用(P=0.008)。這表明長期N沉降引起亞熱帶成熟林土壤P的限制可以通過施加P肥得到緩解。該結論為管理森林生態系統并維持其可持續發展提供了理論支持。

4 主要結論

(1)3種林型土壤APA與土壤AP之間均存在顯著負相關，表明鼎湖山森林土壤AP的缺乏間接提高了土壤APA。

(2)施加N肥顯著提高了季風林土壤APA，但對混交林和馬尾松林的作用不顯著，說明長期N沉降更容易加劇季風林土壤P的限制。

(3)施加P肥顯著抑制了混交林和馬尾松林土壤APA，但對季風林的影響不明顯，說明施加P肥更容易降低這兩個林型土壤生物對P的需求。

(4)N和P同時添加對季風林土壤APA的影響存在交互作用，這表明N沉降引起南亞熱帶成熟林土壤P的限制可以通過施加P肥得到緩解。

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Effects of nitrogen and phosphorus addition on soil phosphatase activity in different forest types

ZHENG Mianhai1,3, HUANG Juan1, CHEN Hao1,3, WANG Hui2, MO Jiangming1,*

1KeyLaboratoryofVegetationRestorationandManagementofDegradedEcosystems,SouthChinaBotanicalGarden,ChineseAcademyofSciences,Guangzhou510650,China2KeyLaboratoryofForestEcologyandEnvironment,China′sStateForestryAdministration,InstituteofForestEcology,EnvironmentandProtection,ChineseAcademyofForestry,Beijing100091,China3UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100039,China

Phosphorus (P) as a basic mineral nutrient is considered to constrain primary productivity in many tropical and subtropical forests. Soil phosphatase plays a very important role in P cycling in forest ecosystems because it catalyzes the hydrolysis of soil organic P compounds (e.g., nucleic acids and phospholipids) into forms that are available to plants and soil microbes. Soil phosphatase activity is widely considered an effective indicator of the P demand of plants and microbes due to its ability to mediate plant and microbial nutrient acquisition from organic P compounds. In recent decades, increasing nitrogen (N) deposition due to human activity has been demonstrated to cause soil P deficiency and increase soil acid phosphomonoesterase activity (APA) in several tropical or subtropical forests. However, little is known about the effects of N deposition on soil APA in other forest types (e.g., broadleaf forest and coniferous forest) or whether P addition may relieve soil P limitation in these forests. The present study investigated the responses of soil APA to N and P additions in a monsoon evergreen broadleaf forest (MEBF), aPinusmassonianaforest (PF), and a mixed broadleaf and pine forest (MF) in Dinghushan Mountain, Guangdong Province of southern China via a six-year fertilization experiment. The experiment used full factorial design, including four treatments:control (no fertilization), N addition (150 kg N hm-2a-1), P addition (150 kg P hm-2a-1), and combined N and P addition (150 kg N hm-2a-1plus 150 kg P hm-2a-1). Each 5 m × 5 m plot was established with a surrounding buffer strip (5 m wide). For each N and P application, NH4NO3and NaH2PO4solutions were applied below the canopy with a backpack sprayer, every other month from January 2007 to July 2013. In July 2013, soil samples were collected for analysis. Results showed that soil APA was significantly higher in MEBF ((15.83±2.46) μmol g-1h-1) than that in MF ((10.71±0.78) μmol g-1h-1) or PF ((9.12±0.38) μmol g-1h-1) soils, and a significant negative correlation existed between soil APA and soil available P contents in all forest types. N addition significantly increased soil APA in MEBF, while no statistical difference was found in MF or PF. P addition significantly decreased soil APA in MF and PF, but had no significant effect in MEBF. Combined N and P addition notably depressed soil APA in PF, but had no significant influence in MEBF and MF. Importantly, interactions between N and P additions were observed in MEBF. Based on our results, N deposition is expected to aggravate soil P deficiency in mature subtropical forest, while the N-induced P-limited state of these forests might be effectively relieved by P addition. In conclusion, the addition of P fertilizer may serve as an effective method for the sustainable future development of tropical and subtropical forests.

acid phosphatase activity; nitrogen deposition; nitrogen addition; phosphorus addition; phosphorus limitation; Dinghushan Mountain

國家自然科學基金(41203089, 41273143); 廣東省自然科學基金博士啟動項目(S2012040007989)

2014-05-12; < class="emphasis_bold">網絡出版日期:

日期:2014-12-18

10.5846/stxb201405120970

*通訊作者Corresponding author.E-mail: mojm@scib.ac.cn

鄭棉海, 黃娟, 陳浩, 王暉, 莫江明.氮、磷添加對不同林型土壤磷酸酶活性的影響.生態學報,2015,35(20):6703-6710.

Zheng M H, Huang J, Chen H, Wang H, Mo J M.Effects of nitrogen and phosphorus addition on soil phosphatase activity in different forest types.Acta Ecologica Sinica,2015,35(20):6703-6710.