大柴胡湯對高脂高膽固醇大鼠TNF-α、IL-6表達水平的影響

常一川，王鳳榮

實驗論著

大柴胡湯對高脂高膽固醇大鼠TNF-α、IL-6表達水平的影響

常一川，王鳳榮

目的 通過研究大柴胡湯對高脂高膽固醇大鼠模型心肌組織內腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)蛋白表達的影響，進一步闡明大柴胡湯治療高脂高膽固醇疾病的作用機制。方法 將45只幼齡Wistar大鼠隨機分為正常對照組、模型組、大柴胡湯組3組。正常對照組正常飲食并每日給予生理鹽水灌胃；大柴胡湯組、模型組以高脂飼料喂飼大鼠造模；連續10 d；實驗第11天，大柴胡湯組根據給藥劑含生藥量為0.3 g/mL干預。每日觀察大鼠的生存狀態，分別在造模后10、20、30 d，測量體質量并統計。實驗第30天，采用免疫組化法檢測各組大鼠心肌組織內TNF-α、IL-6蛋白的表達。結果 與正常對照組比較，高脂高膽固醇模型組心肌組織內TNF-α、IL-6蛋白表達均顯著上調，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，大柴胡湯組心肌組織內TNF-α、IL-6蛋白表達明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 高脂高膽固醇能刺激機體內TNF-α、IL-6細胞因子的大量釋放，大柴胡湯能較好的抑制TNF-α、IL-6蛋白表達，對高脂高膽固醇疾病有一定的防治效果。

高脂血癥； IL-6； TNF-α； 大柴胡湯； 動物，實驗； 大鼠

高脂血癥發病率很高，尤其對心、腦、腎血管的危害重大，常常是心腦血管疾病發病的基礎。其發病的危害是隱匿、逐漸，進行性和全身性。十幾年來大量研究資料表明，中國高脂血癥的發病率呈現逐漸增高趨勢，同時高脂血癥作為腦卒中、冠心病、心肌梗死、猝死的危險因素也被大量研究所驗證。高脂血癥是由于脂肪代謝或運轉異常使血漿中的一種或多種脂質高于正常的范圍的臨床常見病，通常表現為血清總膽固醇(TC)或甘油三酯(TG)水平升高和(或)高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平的下降。從高脂高膽固醇大鼠模型成功造模可以看出本病是一種與飲食密切相關的疾病。中醫學認為本病外因是過食膏粱厚味、肥甘之品。肥甘厚味之品一般性緩，緩則脾氣滯，不能化濁而生痰濕。內因是臟腑功能失調，氣不化津，則痰濁壅滯，氣機不暢，脈絡瘀阻。與脾虛、腎虛、痰濁、血瘀密切相關[1]。目前伴隨著高脂血癥的發病機制研究的深入，更加重視如何早期預防心肌病變，通過降低炎性因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)，的表達，從而減少心肌的損害。

大柴胡湯煎劑由遼寧中醫藥大學附屬醫院制劑室提供，依原方由柴胡、黃芩、枳實、芍藥等藥物組成，其功效是和解為主與瀉下并用的方劑。具清熱利濕并調和脾胃的功效，現已用于臨床且療效顯著。為進一步探討該臨床有效復方的治病機制，本實驗采用免疫組化法，檢測該藥作用于高脂高膽固醇大鼠后心肌組織中的TNF-α、IL-6含量的表達，為大柴胡湯的臨床應用及后續研究提供更有利的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級SD健康雄性大鼠45只，體質量(200±25)g，由遼寧中醫藥大學實驗動物中心提供。許可證號：SYXK(遼)2010-0001，合格證號：0009238。

1.2 實驗藥物 大柴胡湯(柴胡、黃芩、枳實、大棗各15 g，半夏、大黃、生姜各10 g，芍藥20 g，澤瀉30 g)由遼寧中醫藥大學附屬醫院制劑室提供，含生藥量約0.6 g/mL，放入冰箱冷藏備用，使用時配比成0.3 g/mL溶液。

1.3 飼料 高脂飼料配方：基礎飼料93.7%、豬油5%、膽固醇1%、膽酸鹽0.3%[2]。

1.4 主要試劑與儀器 試劑：大鼠IL-6試劑盒(購自北京博奧森生物技術有限公司)、TNF-α試劑盒(購自武漢博士德生物工程有限公司)；復合消化液、兔抗IgG SABC、DAB顯色試劑盒(均購自武漢博士德生物工程有限公司)。LEIT20MIL型倒置熒光顯微鏡(德國萊卡公司)；1518TC型CO2培養箱(SHEL-LAB美國)，H.H.B11.420型電熱恒培養箱(上海躍進醫療器械廠)，1410090型離心機(上海手術器械廠)，1410090型血細胞計數器(上海求精生物試劑儀器有限公司)，101-1型電熱鼓風干燥箱(上海滬南科學儀器廠)，DSY-2-4孔電熱恒溫水浴鍋(北京國華醫療器械廠)，RE-52A型旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)。

1.5 實驗方法

1.5.1 分組 參照隨機數字表，將SD健康雄性大鼠45只隨機分為正常對照組、模型組、大柴胡湯組各15只。實驗前將大鼠全部置于SPF級清潔籠內喂養，3 d后開始正式實驗。

1.5.2 動物造模 正常對照組喂飼普通飼料；模型組喂飼高脂飼料；大柴胡湯組飼喂高脂飼料，大鼠均為單籠飼養，每只給予飼料100 g/d，飲水不限。

1.5.3 給藥 正常對照組給予生理鹽水10 mL/kg每日灌胃；模型組給予生理鹽水10 mL/kg每日灌胃；大柴胡湯組給予10 mL/kg大柴胡湯制劑每日灌胃。于實驗開始0、10、20、30 d分別測量其體質量；3組平行實驗30 d后標本取材。

1.5.4 標本取材 各組大鼠于給藥第30天各麻醉處死取材。處死前8 h禁食禁水，摘取左側心肌組織放入生理鹽水中沖洗2次，放入干燥無菌的EP管中加入10%甲醛固定，按常規方法石蠟包埋。制成5 μm厚度的切片備用。

1.5.5 TNF-α、IL-6測定 免疫組化法檢測心肌組織中TNF-α、IL-6的含量。切片脫蠟至水，3% H2O2室溫10 min以滅活內源性酶，蒸餾水沖洗5 min×3次。滴加復合消化液，室溫20 min，PBS液沖洗2 min×3次，吸取多于液體，滴加5% BSA封閉液室溫放置20 min。滴加兔抗大鼠TNF-α、IL-6抗體(1∶80倍稀釋)，放入37 ℃溫箱中2 h。取出后PBS液沖洗2 min×3次。滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃ 20 min，PBS液沖洗2 min×3次。滴加SABC試劑，37 ℃ 20 min，PBS液沖洗5 min×4次，DAB顯色約10 min，蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復染，脫水、透明、中性樹膠封片。用OLYMPUS BX50光學顯微鏡觀察，每張切片任選5個視野(×200)，用北航分析系統圖像采集分析，Image-pro plus 4.5圖像分析系統對圖像進行半定量分析，測定每個心肌組織的陽性顆粒(棕黃色)的積分光密度(IOD)，以均值作為該樣本TNF-α、IL-6的相對表達，IOD值越大，說明其蛋白表達越多。

2 結果

高脂高膽固醇大鼠心肌組織內TNF-α、IL-6含量表達水平比較見表1。

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

表1結果說明，與正常對照組比較，模型組TNF-α蛋白的表達顯著增高；與模型組比較，正常對照組、大柴胡湯組測得TNF-α表達顯著降低;與正常對照組比較，模型組中的IL-6蛋白表達明顯升高；與模型組比較，正常對照組、大柴胡湯組IL-6蛋白表達明顯降低。差異均有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

脂肪代謝或運轉異常是引起高脂血癥的重要原因，是誘發包括動脈粥樣硬化在內的心腦血管疾病的重要危險因子[1]。有研究證實，高脂高膽固醇后主要侵襲心肌組織和動脈血管細胞，誘導其細胞分泌細胞因子、炎性因子等炎性介質，炎癥在高血脂與動脈粥樣硬化發生、發展及其并發癥中起著重要的作用，導致一系列臨床癥狀[2，3]。近幾年來，中醫藥在治療和預防動脈粥樣硬化在內的心腦血管疾病方面療效顯著，且無副反應和不良反應，故積極研制中藥治療高脂高膽固醇疾病已日益成為醫藥科研人員的重點工作。

前期實驗研究已表明,大柴胡湯顯著降低高脂血癥大鼠TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平，同時血清ApoA-Ⅰ水平亦顯著升高，而ApoB水平顯著降低;同時能降低高脂血癥大鼠肝臟質量與體質量的比值，作用效果呈劑量依賴關系。大柴胡湯對高血脂模型大鼠具有較好的降血脂治療作用，改善心肌組織微循環的功效[4]。本文在前期研究的基礎上，進一步證實大柴胡湯對于高脂血癥大鼠血脂及炎癥因子的影響。

TNF-α是由單核-巨噬細胞分泌的一個多效因子，在免疫系統發育、炎癥反應、細胞凋亡和類脂代謝中起到重要的中心作用[5]。當動物體處于正常狀態時，其體內的TNF-α含量濃度較低，在攝入到高脂高膽固醇后，TNF-α可迅速通過巨噬細胞、NK細胞、T細胞等多種細胞得到釋放，啟動早期炎癥反應的發生。TNF-α的適量上升可以起到保護機體的作用，但過量的TNF-α則會造成機體免疫功能下降，阻礙疾病的恢復[6]。另外有研究證實，高脂高膽固醇機體后可促使巨噬細胞分泌大量TNF-α，且分泌量與血脂增高的含量呈正比關系[7]。

IL-6同樣是由單核-巨噬細胞分泌而來，為T細胞活化因子，能激活T細胞促進細胞毒性T細胞成熟，介導B細胞增殖分化產生IgG，并能促進TH2細胞分化。已有研究表明，高脂高膽固醇大量攝入后，刺激機體巨噬細胞分泌產生大量的IL-6、IL-8等細胞因子并誘導其聚集，導致血清中的IL-6、IL-8含量顯著增高[8]。

本實驗研究結果顯示，大柴胡湯能顯著降低心肌組織中TNF-α和IL-6等炎癥因子表達水平，具有調節高脂血癥大鼠血脂的作用，并能改善高脂血癥低度炎癥狀態。模型組TNF-α、IL-6蛋白的表達明顯高于正常對照組，再一次證實高脂高膽固醇后刺激機體產生大量TNF-α、IL-6等細胞因子，增強高血脂對心肌的損害。采用大柴胡湯治療后，測得TNF-α、IL-6相對于模型組顯著降低，提示其對于高脂高膽固醇疾病有一定的防治作用，作用機制可能是抑制TNF-α、IL-6等炎性因子的釋放，防止因其過度釋放聚集而對心肌組織造成損害，進而保護機體心腦腎重要臟器。盡早用藥治療對于降低心肌組織中炎性細胞因子含量水平、高脂高膽固醇疾病的預后和轉歸具有十分重要的臨床意義。

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(本文編輯：李志文)

Dachaihu Decoction on high fat and high cholesterol in rats TNF-α，IL-6 expression level influence

CHANGYi-chuan，WANGFeng-rong.

GraduateSchoolofLiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，110032Shenyang，China

Objective Da-chai-hu-tang by studying the impact of high fat and cholesterol in the rat model of myocardial tissue and tumor necrosis factor α(TNF-α)，interleukin-6(IL-6)protein expression，and further clarify the treatment of high fat Dachaihutang cholesterol mechanisms of disease.Methods 45 young Wistar rats were randomly divided into normal control group，model group，Dachaihutang 3 groups. Establish control group，given a normal diet and daily normal saline; hyperlipidemia model groups of rats fed with high fat diet modeling; continuous 10 d; experimental section 11 d，Dachaihutang groups according to the amount of drug-containing crude drug Health and medicine about 0.3 g/mL intervention. Daily living conditions observed in rats，respectively，after modeling 10，20，30 d，measuring weight and statistics. Experimental Section 30 d，within each group to detect the expression of myocardial tissue TNF-α，IL-6 protein was detected by immunohistochemistry.Results Compared with the normal group，model group within hypercholesterolemic myocardium TNF-α，IL-6 protein expression were significantly increased(P<0.05). Compared with the model group，within Dachaihutang myocardial tissue TNF-α，IL-6 protein expression was significantly decreased(P<0.05). Conclusion The high-fat high-cholesterol in the body to stimulate TNF-α，IL-6 massive release of cytokines，Dachaihutang can better inhibit TNF-α IL-6 protein expression of high fat and cholesterol have a certain disease control effect.

High cholesterol; IL-6; TNF-α; Dachaihu Decoction; animal experiments； rat

110032 沈陽，遼寧中醫藥大學研究生學院(常一川)；遼寧中醫藥大學附屬醫院心內科(王鳳榮)

常一川(1987-)，男，遼寧中醫藥大學2012級碩士研究生在讀。研究方向：中醫藥防治心系疾病。

王鳳榮，110032 沈陽，遼寧中醫藥大學附屬醫院心內科。

10.3969/j.issn.1674-3865.2015.01.007

R-33

B

1674-3865(2015)01-0017-03

2014-12-09)