輸合配穴針刺對LPS腦損傷幼鼠模型腦組織S100B、NSE表達的影響

胡曉麗，王雪峰，龐偉，韓洋，馬賢德

實驗論著

輸合配穴針刺對LPS腦損傷幼鼠模型腦組織S100B、NSE表達的影響

胡曉麗，王雪峰，龐偉，韓洋，馬賢德

目的 探討輸合配穴針刺干預對LPS腦損傷幼鼠模型腦組織S100B、NSE表達的影響。方法 將60只SD新生的乳鼠隨機分為針刺干預組、模型組和對照組，對干預組采用輸合配穴針刺21 d后，對各組大鼠腦組織中S100B、NSE含量進行檢測。結果 干預組S100B、NSE的表達明顯高于對照組(P<0.01)，且21 d時均低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 通過對腦損傷模型腦組織S100B、NSE表達檢測，明確“輸合配穴”針刺法在早期干預有效性。

腦損傷； 造模； S100B; NSE; 動物，實驗； 幼鼠

小兒腦損傷病因復雜，多因早產、宮內感染、新生兒缺氧缺血性腦病[1]等所導致，雖對其發病機制進行了大量研究，但迄今其病因和發病機制尚未完全明確。腦損傷引起患兒的肢體殘障，給家庭和社會帶來了巨大的負擔，最大限度的促進殘障患兒功能恢復，尋求合理、有效、副反應低的療法仍是康復界的工作重點。王雪峰教授在多年治療兒童癱瘓性疾病臨床經驗的基礎上，運用輸合配穴針刺療法治療小兒癱瘓性疾病，取得顯著療效，為進一步探討其針刺的作用機制，本實驗通過采用給予孕鼠腹腔注射脂多糖(LPS)的方法模擬腦損傷幼鼠動物模型[2-4]，采用“輸合配穴”針刺法早期干預，為運用輸合配穴針刺療法早期干預治療腦損傷患兒提供更有利的實驗數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1 實驗藥品及制備 LPS(Lipopolysaccharides，Escherichia coli 055：B5，由Sigma公司提供)，每1 mg LPS溶于10 mL生理鹽水中。

1.2 實驗動物 SPF級雌性SD新生的乳鼠60只(購自遼寧長生生物技術有限公司，動物合格證號：SCXK2010-0001)，由遼寧中醫藥大學動物實驗中心飼養。按隨機數字表法分為3組，每組20只。

1.3 方法

1.3.1 實驗方法 針刺干預組：乳鼠出生后第3、4、5、6、7天，每天腹腔注射LPS(30，30，60，60，120 μg/kg)連續注射以防止產生耐藥性[1]。于生后第3天始，采用手陽明經和足陽明經的輸穴和合穴，即取雙側曲池穴、三間穴、后三里穴、陷谷穴(按照實驗動物學的動物穴位標準)，采用1寸毫針捻轉進針，直刺穴位0.1～0.3寸，曲池穴、足三里穴采用補法針刺1～2 min，不留針；三間穴、陷谷穴采用瀉法針刺1～2 min，不留針。(為避免手法差異，針刺由針灸系畢業生1人操作)，從出生后第3天開始針刺，每日1次，連續21 d；生后3 d開始，每日進行神經行為學鑒定，分別于1、7、14、21 d取乳鼠腦組織實驗室檢測。

模型組：乳鼠出生后第3、4、5、6、7天，每天腹腔注射LPS(30，30，60，60，120 μg/kg)連續注射以防止產生耐藥性，生后3 d開始，每日進行神經行為學鑒定，分別于1、7、14、21 d取乳鼠腦組織實驗室檢測。

對照組：乳鼠生后第3、4、5、6、7天，每天腹腔注射同等劑量的生理鹽水。生后3 d開始，對照組乳鼠在每日進行神經行為學鑒定，分別于1、7、14、21 d取乳鼠腦組織實驗室檢測。

1.3.2 神經行為學檢測 平面翻正：將乳鼠翻轉放置桌面上，其背部向下，記錄乳鼠由仰臥位變成俯臥位時四只爪接觸平臺的時間。懸吊試驗：使乳鼠前腿抓住一水平的玻璃棒(直徑0.5 cm)，離開桌面45 cm，記錄乳鼠掉下的時間，并進行評分。曠野試驗：裝置為36 cm×36 cm×36 cm無頂方盒，箱底用墨線分成9個等分小格，將乳鼠置于中央小方格內，觀察3 min內活動情況。計分標準：乳鼠1/2以上身體從所在方格進入相鄰方格記1分；乳鼠后肢站立計1分；二者相加為其總分。斜坡試驗：將乳鼠頭向下倒置于45°的斜坡上，記錄乳鼠轉為頭向上>135°的時間。

1.3.3 檢測方法 酶聯免疫吸附法檢測腦組織中的星形膠質源性蛋白(S100B)及神經元特異性烯醇化酶(NSE)吸光值。

2 結果

2.1 不同時間點幼鼠神經發育測驗結果 見表1。

注：與對照組比較，aP<0.05;與模型組比較，bP<0.05。

表1結果表明，干預組和模型組與對照組比較平面翻正測試比較差異有統計學意義(P<0.05)，第7天平面翻正測試，干預組與模型組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)，第14天，干預組與模型組之間比較差異有統計學意義(P<0.05)。

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

表2結果表明，與對照組比較懸吊實驗、斜坡實驗、曠場實驗比較差異有統計學意義(P<0.05)，第14天干預組與模型組之間比較差異有統計學意義(P<0.05)，第21天懸吊實驗、斜坡實驗干預組與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)，而曠場實驗比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 不同時點S100B，NSE的表達結果分析 見表3、表4。

注：與對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01。

表3結果表明，模型組S100B的表達明顯高于空白對照組，差異有統計學意義(P<0.01)，第1、14天模型組與干預組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，在21 d時，模型組與干預組比較有統計學意義(P<0.01)。

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

表4結果表明，模型組NSE的表達明顯高于空白對照組，差異有統計學意義(P<0.01)，第1、14天模型組與干預組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，在21 d時，模型組與干預組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。

3 討論

腦損傷綜合征是近年來在診斷高危兒患有腦性癱瘓、行為異常、運動障礙所引入過渡性診斷，多因早產、宮內感染、新生兒缺氧缺血性腦病等所導致，常用于小于6個月的嬰兒，其神經系統后遺癥日益受到重視。

本文依據文獻的方法，建立LPS感染幼鼠模型，采用輸合配穴針刺進行干預，觀察其神經發育測試結果及腦組織中S100B、NSE表達，為針刺在小兒癱瘓性疾病治療提供實驗依據。傳統祖國醫學對“腦損傷”無專著論述，但在歷代醫籍中均有不少記載，多將其歸屬于“五遲五軟”“五硬”“痿證”的范疇，中醫認為因小兒脾常虛，肝常余，肢體強硬，步履不正，病機主要責之于肝強脾弱。因而在治療上，應以柔肝健脾，抑木扶土為主。五輸穴在全身腧穴中占有極其重要的位置，五輸穴與五行相配伍，如陽經，合穴屬土，輸穴屬木，并根據中醫的上病下取之原理，肘膝關節以下腧穴既可治療局部病，也可治療遠部病，從而達到和內調外，標本兼治的作用[5]。本實驗提出輸合配穴-抑木扶土針刺法，通過瀉輸補合可直接達到抑木扶土之效，即所謂“陰平陽秘，精神乃治”。

血清S100B及NSE在腦組織中具有高度特異性，對腦損傷高度敏感[5]，在血清中迅速出現，確保血清濃度和組織損傷之間有可預測的關系，是目前具有較高敏感性和特異性的最具應用前景的腦損傷標記物，對腦損傷的診斷及傷情評估具有重要的臨床價值，且與神經元的損傷呈正相關，提示其可作為神經元細胞受損的早期指標之一[6]，所以本次實驗選用此指標來檢測所造模型鼠的腦損傷程度。

結果顯示，本實驗模型組的腦組織S100B、NSE含量測定與對照組相比均有顯著差異，顯示模型組造成新生仔鼠腦損傷，通過對各組平面翻正試驗、懸吊實驗，斜坡實驗，曠場實驗鑒定表明，使用“輸合配穴”針刺法早期干預有效。今后將進一步研究脂多糖造成宮內感染模型，對其劑量及感染機制進一步研究。

[1] 肖欽志.腦性癱瘓病因學研究進展[J].南通大學學報：醫學版，2013，33(3)：204-208.

[2] 李曉捷，高晶，孫忠人.宮內感染致早產鼠腦癱動物模型制備及其鑒定的實驗研究[J].中國康復醫學雜志，2004，19(12)：885-889.

[3] Johnston MV, Ferriero DM, Vannucci SJ,et al. Models of cerebral palsy: which ones are best[J].J Child Neurol，2005，20(12)：984-987.

[4] Rees S, Harding R, Walker D.The biological basis of injury and neuroprotection in the fetal and neonatal brain[J].Int J Dev Neurosci，2011，29(6)：551-563.

[5] 李楠，王雪峰，張亮，等.輸合配穴針刺法促進LPS早產鼠腦損傷中CNP及MBP表達的研究[J].山東醫藥，2012，52(36)：55-57.

[6] 尤玉慧，崔志慧，尹水貴，等.0～6個月齡腦癱高危兒血清NSE表達特點及臨床價值[J].醫學研究雜志，2013，42(6)：98-101.

(本文編輯：李志文)

Effects of combined transport acupuncture on the expression of S100B, NSE and LPS of brain tissue of young rats with cerebral injury model

HUXiao-li,WANGXue-feng,PANGWei,etal.

PediatricdepartmentoftheAffiliatedHospitalofLiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，110032Shenyang，China

Objective To research the effect of acupuncture intervention on the expression of S100B、NSE of different types of brain injury model in rat brain tissue.Methods According to the model preparation method is divided into premature intervention group and non intervention group, LPS premature intervention group and non treatment group, Ischemia and hypoxia group and untreated group, LPS intervention group and the non intervention group, the normal group. The method of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect S100B、NSE content in brain tissue of rats in different group.Results Rats S100B, NSE expression was closely correlated with the severity of brain injury.The expression of S100B、NSE in model group, was significantly higher than that in the blank control group (P<0.01).The results showed: the expression of S100B、NSE in brain tissue was lower than non intervention group expression in the acupuncture intervention group on twenty-first day.Conclusions The premature delivery to hypoxia and ischemia, rats, lipopolysaccharide infection detection of brain injury.S100B、NSE are not consistent in various model,maybe that related to the severity of brain injury related model.Brain tissue S100B、NSE expression was lower than non intervention group expression in the acupuncture group, which can demonstrate the use of "shu and he point" early intervention of acupuncture effectively.

brain injury； animal model； S100B； NSE； animal experiments； mice

遼寧省教育廳基金資助(L2012336) 作者單位：110032 沈陽，遼寧中醫藥大學附屬醫院兒科(胡曉麗，王雪峰)；154007 黑龍江 佳木斯，佳木斯大學兒童神經康復實驗室(龐偉)；110032 沈陽，遼寧中醫藥大學研究生學院(韓洋)；遼寧中醫藥大學實驗中心(馬賢德)

胡曉麗(1979-)，女，醫學博士，主治醫師。研究方向：小兒癱瘓性疾病的中醫藥防治。

王雪峰，110032 沈陽，遼寧中醫藥大學附屬醫院兒科。

10.3969/j.issn.1674-3865.2015.01.008

R-33

B

1674-3865(2015)01-0020-03

2014-09-29)