促紅細(xì)胞生成素對(duì)缺氧缺血性腦損傷大鼠的腦保護(hù)作用及機(jī)制

張晶，黃蕊，郝玲，劉娜

(1河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，石家莊050031;2定州市婦幼保健院)

圍產(chǎn)期缺氧缺血性腦損傷(HIBD)是新生兒常見(jiàn)疾病，是導(dǎo)致腦癱、癲癇、智力低下等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要原因之一，亦是引起新生兒死亡的重要原因［1］。目前，HIBD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，HIBD能致神經(jīng)元細(xì)胞的壞死和凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致病理性癥狀的發(fā)生［2，3］。對(duì)HIBD引起的腦損傷目前尚無(wú)有效防治措施。促紅細(xì)胞生成素(EPO)是一種主要由腎臟和肝臟組織合成的糖蛋白，是調(diào)節(jié)血液中紅細(xì)胞增殖、分化與成熟的細(xì)胞因子。近年發(fā)現(xiàn)EPO受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，對(duì)腦損傷神經(jīng)元具有保護(hù)作用［4，5］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立HIBD大鼠模型，應(yīng)用EPO藥物對(duì)HIBD大鼠進(jìn)行干預(yù)治療，分析EPO對(duì)HIBD腦組織的Fas、FasL表達(dá)的影響，探討EPO對(duì)HIBD大鼠神經(jīng)元可能的保護(hù)機(jī)制，從而為HIBD的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:新生7 d健康的Wistar大鼠120只，雌雄不限，體質(zhì)量12～18 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。主要試劑:EPO注射液(沈陽(yáng)三生制藥股份有限公司)。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、IP細(xì)胞裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)。TRIzol(美國(guó)Invitrogen公司)，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(日本TaKaRa公司)，Real Master Mix試劑盒(德國(guó)Qiangen公司)，GAPDH、Fas及 Fas配體(FasL)抗體(美國(guó) SANTA CRUZ公司)。主要儀器:ABI7300(美國(guó)ABI公司)，bio-rad垂直版電泳槽，常壓缺氧艙(河北有機(jī)玻璃廠)及氧濃度監(jiān)測(cè)儀(日本3A公司生產(chǎn)，1H21A型)，顯微鏡(OlympusH-CX31)。

1.2 模型制備、分組及干預(yù) 將Wistar大鼠用氯胺酮30 mg/kg腹腔注射麻醉后，游離左側(cè)頸總動(dòng)脈，雙線結(jié)扎。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(對(duì)照組)、HIBD組和EPO治療組各40只，根據(jù)處死大鼠的時(shí)間點(diǎn)(6、12、24、48、72 h)不同，進(jìn)一步分為 5 個(gè)亞組，每個(gè)亞組平均8只大鼠。對(duì)照組僅分離左頸總動(dòng)脈但不結(jié)扎血管及缺氧。EPO治療組在HIBD模型建立后立即腹腔注射重組人紅細(xì)胞生成素注射液(5 000 IU/kg)，HIBD組腹腔注射等體積生理鹽水。模型組和EPO治療組缺血術(shù)后恢復(fù)2 h，置于2 000 mL常溫常壓缺氧艙內(nèi)，以1.0～2.0 L/min的速度輸入體積分?jǐn)?shù)為8%氧氣和體積分?jǐn)?shù)為92%氮?dú)獾幕旌蠚怏w，以氧濃度監(jiān)測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，使氧濃度維持體積分?jǐn)?shù)為8%，持續(xù)2 h。2 h后恢復(fù)正常供氧，制成HIBD動(dòng)物模型(左側(cè)大腦半球)。上述動(dòng)物均回籠飼養(yǎng)，6、12、24、48、72 h 時(shí)分別隨機(jī)處死各組大鼠8只，取左側(cè)大腦半球，用于后續(xù)DNA模板和蛋白的提取。

1.3 腦組織中Fas及FasL mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用Real-time PCR法。按TRIzol說(shuō)明書(shū)提取大鼠腦組織標(biāo)本中總RNA。RNA的濃度經(jīng)紫外線分光光度計(jì)測(cè)定:A260/A280=1.8～2.0，說(shuō)明 RNA 的完整性較好，將濃度調(diào)整為500 ng/μL。采用TaKaRa公司RNA M-MLV kit試劑盒，在10 μL反應(yīng)體系中逆轉(zhuǎn)錄RNA合成cDNA，cDNA產(chǎn)物用于后續(xù)的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)或置于－20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ镄蛄?Fas上游引物:5'-CCTCCCATCCTCCTGACCACCG-3'，下 游 引物:5'-CTGGTTGCCTTGGTAGGATTG-3'，擴(kuò)增片段117 bp;FasL上游引物:5'-TCCCTGGAGAAGAGCTACGA-3'，下游引物:5'-TCACTCGTAAACCGCTTCCCTC-3'，擴(kuò)增片段 182 bp;β-actin上游引物:5'-CCTGTTAAATGGGCCACTTTC-3'，下游引物:5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3'，擴(kuò)增片段 194 bp。20 μL 反應(yīng)總體積，取cDNA 1 μL，加 PCR mix buffer 10 μL，上下游引物各 0.6 μL，DEPC-H2O 為 7.8 μL。循環(huán)條件:95℃預(yù)變性5 min;94℃、30 s;56℃、30 s;72℃、45 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后記錄相關(guān)Ct值，根據(jù) 2－ΔΔct公式計(jì)算各組中 Fas、FasL 基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 腦組織中Fas及FasL蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。將大鼠的腦組織在冰浴條件上加細(xì)胞裂解液進(jìn)行研磨并裂解30 min，15 000 r/min離心10 min，收集上清組織(總蛋白標(biāo)本)，利用CBA進(jìn)行蛋白定量，按等量樣本30 μg上樣，10%SDS-PAGE凝膠電泳，80 V電泳至溴酚藍(lán)到分離膠后，上調(diào)電壓至100 V，直至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部約0.5 cm處停止電泳，80 V濕轉(zhuǎn)90 min，TBST洗滌，5%的脫脂奶粉封閉，室溫下?lián)u床維持1 h。TBST洗滌，加一抗，4℃冰箱搖床孵育過(guò)夜，TBST洗滌，孵育二抗30 min，TBST洗滌，ECL顯影，掃片，利用Bio-rad公司的圖形分析軟件Quantity one對(duì)條帶進(jìn)行灰度值掃描，對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組腦組織中Fas、FasL mRNA表達(dá)比較 對(duì)照組在不同時(shí)點(diǎn)的大鼠腦組織中Fas mRNA相對(duì)表達(dá)量均維持在較低水平，在HIBD組6 h后處死的大鼠腦組織中，F(xiàn)as mRNA相對(duì)表達(dá)量開(kāi)始增加，12 h時(shí)達(dá)最大值，隨后開(kāi)始逐步下降，至72 h后Fas mRNA相對(duì)表達(dá)量降至接近基礎(chǔ)水平;在EPO治療組中，F(xiàn)as mRNA表達(dá)與HIBD組有相似的變化趨勢(shì)(先升高后降低)，但變化幅度明顯減小，且在12、24、48 h時(shí)Fas mRNA表達(dá)均明顯低于HIBD組(P均＜0.05)。FasL mRNA表達(dá)在HIBD組腦組織中6～24 h開(kāi)始急劇增減，并在12～24 h維持很高的表達(dá)水平，24 h后開(kāi)始下降，并降至接近基礎(chǔ)水平;6、12、24和48 h時(shí)EPO治療組FasL mRNA表達(dá)均顯著低于HIBD組(P均＜0.05)。詳見(jiàn)表1、表2。

表1 三組不同時(shí)點(diǎn)Fas mRNA在腦組織中的相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

表1 三組不同時(shí)點(diǎn)Fas mRNA在腦組織中的相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

注:與 HIBD 組相比，*P ＜0.05;與 HIBD組相比，△P ＜0.01。

組別 n Fas mRNA相對(duì)表達(dá)量6 h 12 h 24 h 48 h 72 h HIBD 組 8 3.89 ±0.42 12.04 ±0.89 6.91 ±0.64 4.31 ±0.52 2.43 ±0.26 EPO 治療組 8 3.72±0.22 5.68±0.54△ 3.95 ±0.41△ 3.83±0.27* 1.79±0.28對(duì)照組 8 1.75 ±0.21 1.63 ±0.28 1.67 ±0.32 1.39 ±0.26 1.58 ±0.46

表2 三組不同時(shí)點(diǎn)FasL mRNA在腦組織中的相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

表2 三組不同時(shí)點(diǎn)FasL mRNA在腦組織中的相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

注:與 HIBD 組相比，*P ＜0.05;與 HIBD組相比，△P ＜0.01。

組別 n FasL mRNA相對(duì)表達(dá)量6 h 12 h 24 h 48 h 72 h HIBD 組 8 4.69 ±0.61 19.54 ±1.67 22.61 ±2.06 5.29 ±0.732.92 ±0.21 EPO 治療組 8 2.78±0.17* 6.94±0.78△ 6.25 ±0.52△ 3.12±0.36* 2.32±0.23對(duì)照組 8 1.52 ±0.20 1.73 ±0.31 1.82 ±0.35 1.42 ±0.27 1.48 ±0.34

2.2 各組腦組織中Fas、FasL蛋白表達(dá)比較 Fas蛋白的表達(dá)變化與在基因水平有類似趨勢(shì)(先升高后降低)，在HIBD組24 h后Fas蛋白表達(dá)水平達(dá)到最高，之后有小幅度下降;EPO治療組總體表達(dá)變化不明顯，在12 h和24 h Fas蛋白水平有小幅度上升，但明顯低于HIBD組，且在24 h和48 h兩個(gè)時(shí)點(diǎn)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均＜0.05)。在HIBD組中FasL總體表達(dá)水平較Fas蛋白要高，在6 h后就維持在較高水平，在12 h和24 h的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于對(duì)照組，72 h后降至接近基礎(chǔ)水平;EPO治療組經(jīng)過(guò)EPO處理后，F(xiàn)asL蛋白表達(dá)水平顯著降低，在多個(gè)時(shí)點(diǎn)表達(dá)水平均低于HIBD組(P均＜0.05)。詳見(jiàn)表3、表4。

3 討論

新生兒HIBD是一種常見(jiàn)的新生兒疾病，可導(dǎo)致新生兒死亡或嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)損害，是造成胎兒偏癱、認(rèn)知及智力障礙的重要病理基礎(chǔ)。HIBD重要的腦組織病理變化是大量神經(jīng)元細(xì)胞的變性、壞死或凋亡［6］。臨床目前尚無(wú)特異性的治療策略。最初發(fā)現(xiàn)EPO可增加紅細(xì)胞，促使組織的攜氧量提高，促進(jìn)紅細(xì)胞的生存;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，其對(duì)神經(jīng)元亦有一定的保護(hù)作用［4］。本研究結(jié)果顯示，EPO干預(yù)HIBD大鼠后，在基因水平和蛋白水平上均可以下調(diào)大鼠腦組織中Fas、FasL表達(dá)，阻斷神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，保護(hù)腦組織神經(jīng)元細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)為HIBD的靶向干預(yù)和臨床治療提供了新思路。

表3 三組不同時(shí)點(diǎn)Fas蛋白在腦組織中的相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

表3 三組不同時(shí)點(diǎn)Fas蛋白在腦組織中的相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

注:與 HIBD 組相比，*P ＜0.05，△P ＜0.01。

組別 n Fas 蛋白相對(duì)表達(dá)量6 h 12 h 24 h 48 h 72 h對(duì)照組 8 1.92 ±0.31 1.73 ±0.27 1.64 ±0.25 1.41 ±0.22 1.59 ±0.32 HIBD 組 8 3.27 ±0.27 3.84 ±0.89 5.71 ±0.56 4.09 ±0.36 2.34 ±0.18 EPO 治療組 8 3.72±0.22 5.68±0.54 3.95 ±0.41△ 3.83±0.27*1.79 ±0.28

表4 三組不同時(shí)點(diǎn)FasL蛋白在腦組織中的相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

表4 三組不同時(shí)點(diǎn)FasL蛋白在腦組織中的相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

注:與 HIBD 組相比，*P ＜0.05，△P ＜0.01。

組別 n FasL 蛋白相對(duì)表達(dá)量6 h 12 h 24 h 48 h 72 h對(duì)照組 8 1.67 ±0.18 1.82 ±0.23 1.25 ±0.17 1.91 ±0.57 1.62 ±0.42 HIBD 組 8 4.47 ±0.43 7.48 ±0.89 9.57 ±1.08 7.14 ±0.62 3.96 ±0.34 EPO 治療組 8 2.04±0.25* 2.57±0.23△ 3.01 ±0.27△ 1.92±0.16△ 1.35±0.11*

EPD是由人體肝臟和腎臟分泌的一種造血生長(zhǎng)因子，一種耐熱的含唾液酸的酸性糖蛋白激素，相對(duì)分子質(zhì)量約34 kD，作用于骨髓造血干細(xì)胞，促進(jìn)骨髓紅細(xì)胞增生與分化，對(duì)機(jī)體供氧狀況發(fā)揮重要的調(diào)控作用［7］。目前研究顯示，EPO是一種多效細(xì)胞因子，可促進(jìn)紅系祖細(xì)胞分裂，增加循環(huán)中紅細(xì)胞數(shù)量［8］。研究［9，10］發(fā)現(xiàn)，EPO 可通過(guò)與其受體結(jié)合，激活下游Janus激酶2(JAK2)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化蛋白3(STAT3)、磷脂酰肌醇3激酶 (PI3K)、蛋白激酶B(PKB)和NF-κB等信號(hào)通路，從而抑制神經(jīng)元凋亡。

細(xì)胞凋亡是HIBD導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡的重要形式，但缺氧時(shí)神經(jīng)元細(xì)胞亦可發(fā)生壞死，主要取決于缺氧或缺血的嚴(yán)重程度。嚴(yán)重缺氧缺血時(shí)可引起能量衰竭，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外鈣離子平衡無(wú)法維持、細(xì)胞腫脹、細(xì)胞器破壞、神經(jīng)元細(xì)胞壞死等一系列生理病理過(guò)程改變，這種現(xiàn)象在缺血病灶中往往有較明顯表現(xiàn);如果缺血缺氧程度較輕時(shí)或在有效干預(yù)治療后，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變，病理改變是選擇性神經(jīng)元的損傷，啟動(dòng)少部分神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)相關(guān)凋亡基因，導(dǎo)致小部分神經(jīng)元出現(xiàn)程序性死亡。細(xì)胞壞死是不可控的過(guò)程，并會(huì)產(chǎn)生大量炎癥;而細(xì)胞凋亡是一個(gè)受精細(xì)調(diào)控的過(guò)程，是酶聯(lián)激活反應(yīng)。研究［11］表明，HIBD大部分神經(jīng)元死亡通過(guò)細(xì)胞凋亡途徑實(shí)現(xiàn)，因此通過(guò)體外藥物干預(yù)阻止缺氧缺血周圍神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，對(duì)HIBD的損傷和防治有重要意義。

Fas是腫瘤壞死因子受體和神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體家族的細(xì)胞表面分子，表達(dá)于多種細(xì)胞表面，相對(duì)分子質(zhì)量為40～50 kD的Ⅰ型跨膜蛋白，含有3個(gè)富含半胱氨酸的肽鏈，具有重要功能的細(xì)胞表面受體。FasL是一種相對(duì)分子質(zhì)量為40 kD的Ⅱ型跨膜蛋白，由281個(gè)氨基酸組成，F(xiàn)asL僅表達(dá)于活化的T細(xì)胞，與Fas結(jié)合后，進(jìn)一步與細(xì)胞內(nèi)的死亡受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合，原凋亡信號(hào)首先活化Caspase啟始因子，使pro-Caspase-8活化為Caspase-8，效應(yīng)分子特異地水解細(xì)胞中的一系列底物，Caspase引發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞凋亡過(guò)程的中心環(huán)節(jié)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［12］。

本研究發(fā)現(xiàn)，正常生理情況下，大鼠腦組織中的Fas/FasL相對(duì)表達(dá)量均維持在一個(gè)較低水平，以便維持機(jī)體正常更新分化的基礎(chǔ)狀態(tài)。在HIBD組大鼠腦組織中，F(xiàn)as/FasL基因和蛋白水平在6 h開(kāi)始增加，基因水平在12 h達(dá)最高峰，并在24 h維持在較高水平，隨后開(kāi)始下降;蛋白水平在6～24 h持續(xù)增加，并在24 h時(shí)達(dá)最大值。蛋白水平表達(dá)相對(duì)滯后于基因表達(dá)，這符合基因先轉(zhuǎn)錄后翻譯的規(guī)律。表明HIBD能明顯引起腦組織中的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，這一結(jié)果與文獻(xiàn)［13，14］報(bào)道結(jié)果相似。經(jīng)EPO干預(yù)治療后，無(wú)論在基因水平還是在蛋白水平，F(xiàn)as/FasL表達(dá)均低于HIBD組，表明EPO可通過(guò)減少Fas/FasL表達(dá)，阻斷Fas/FasL細(xì)胞受體死亡途徑，減少神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，從而保護(hù)腦神經(jīng)元細(xì)胞。

綜上所述，HIBD可通過(guò)基因水平和蛋白水平上調(diào)Fas/FasL表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，從而引起大鼠腦組織神經(jīng)元損傷，EPO可明顯減緩其對(duì)腦組織神經(jīng)元的傷害。

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