7種維吾爾醫醫院制劑微生物限度檢查方法學驗證

楊曉琴+司馬義江·阿布都熱西提

【摘 要】 目的：建立松布力糖漿、強心艾維西木糖漿、木米亞片、復方蘇潤江片、通竅阿亞然及派克片、復方賽比爾片及庫克亞片等維吾爾醫醫院制劑微生物限度檢查方法。方法：根據《中國藥典》2010年版的規定，用5種陽性對照菌組對回收率試驗進行檢測樣品是否含抑菌成分。結果：松布力糖漿及強心艾維西木糖漿無明顯抑菌現象，可以采用平皿法；木米亞片、復方蘇潤江片、通竅阿亞然及派克片、復方賽比爾片及庫克亞片等對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的回收率均值在65%-88%，有明顯的抑菌作用，應該采用培養基稀釋法。控制菌驗證中，試驗菌生長很好。結論：該方法對所選7種樣品的檢驗有效可行，可用于上述品種的微生物限度檢查。

【關鍵詞】 微生物限度檢查；方法學驗證；醫院制劑

【中圖分類號】R29 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2014）06-0003-02

原料的處理不當或者包裝不嚴密等是導致醫院制劑污染的主要原因，為了達到藥品生產的安全指標必須對其進行微生物限度檢查保證制劑的安全有效。

1 試驗材料

1.1 供試品 松布力糖漿（批號：201303084-1、201303084-2、201303084-3）；強心艾維西木糖漿（批號：201303083-1、201303083-2、201303083-3）；木米亞片（批號：201304102-1、201304102-2、201304102-3）；復方蘇潤江片（批號：201303078-1、201303078-2、201303078-3）；通竅阿亞然及派克片（批號： 201303075-1、201303075-2、201303075-3）；復方賽比爾片（批號：201303073-1、201303073-2、201303073-3）庫克亞片（批號：201303057-1、201303057-2、201303057-3），以上制劑均由喀什地區維吾爾醫醫院提供。

1.2 試驗用菌種（第四代） 金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉菌[CMCC（F）98003]均由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.3 稀釋液、緩沖液 0.9%無菌氯化鈉溶液、pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號：100708）。

1.4 培養基 營養瓊脂培養基（批號：0102262）、膽鹽乳糖增菌液（批號：0102282）、營養肉湯培養基（批號：101213）、虎紅培養基（批號：010214）、4-甲基傘形酮葡糖苷酸（MUG）培養基（批號：100128）、膽鹽硫乳發酵培養基，均由北京三藥科技開發有限公司提供。

1.5 其他物品按規定滅菌備用。

2 方法和結果

2.1 菌液的制備 取大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]的新鮮培養物，分別接種于營養肉湯培養基，30～35℃培養18～24h；取白色念珠菌的新鮮培養物接種于改良馬丁培養基中，23～28℃培養24～48h。上述培養物用0.9%氯化鈉溶液（使用前高壓霉菌使成無菌）稀釋成1ml含50～100cfu菌的菌懸液；黑曲霉的新鮮培養物接種于改良馬丁瓊脂斜面的培養基中，培養5至7天，使大量孢子產生，用0.9%無菌氯化鈉溶液，將其洗脫，然后用0.9%的無菌氯化鈉溶液把菌液稀釋至1ml中含50～100cfu的菌懸液，保存備用。

2.2 菌液的檢驗 分別取上述三種菌菌懸液各1ml，注入用營養瓊脂培養基20ml的平皿中，平行測定兩皿，30℃至35℃培養48小時，計數，菌液應為每ml含50～100cfu。

取上述白色念珠菌、黑曲霉菌菌懸液各1ml，用加入有虎紅瓊脂培養基20ml的平皿中，為了減少實驗中的隨機誤差平行測定兩皿，規定的溫度范圍內培養72小時，觀察，計數，菌液中有效菌株的濃度應該在每1ml含50～100cfu的范圍之內。

2.3 供試品溶液的制備[2]分別取已準備好的固體樣品各10g，研細，液體樣品10ml加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100ml，制成10-1的供試液。

3 回收率測定[1]

3.1 細菌、霉菌、酵母菌計數方法的驗證

3.1.1 平皿法：取供試液1ml及50～100cfu的試驗菌，分別加入培養皿中，平行制備2個平皿，將它凝固后，培養48小時，按《中國藥典》規定的方法測定其菌落數，結果見表1。

由表1可知，松布力糖漿及強心艾維西木糖漿對上述五種代表菌回收率均高于70%以上，無明顯抑菌現象，細菌、霉菌及酵母菌檢查可以采用平皿法，其他的制劑對可能含有抑菌成分需要進一步驗證。

3.1.2 培養基稀釋法 將上述試驗菌株接種于0.2ml/皿、0.1ml/皿的供試品液中，再加20ml瓊脂培養基，培養48小時，觀察結果，細菌計數，測定其回收率，結果見表2、3。

從表2可以看出木米亞片、復方蘇潤江片、通竅阿亞然及派克片庫克亞片等品種對上述代表菌回收率均高于70%以上，無明顯抑菌現象。細菌、霉菌及酵母菌檢查可以采用培養基稀釋法（0.2ml/皿）。

從表3可以看出復方賽比爾片對上述代表菌回收率均高于70%以上，無明顯抑菌現象。細菌、霉菌及酵母菌檢查可以采用培養基稀釋法（0.1ml/皿）。

3.2 控制菌檢查方法驗證

3.2.1 陰性菌對照組 取金黃色葡萄球菌50～100cfu/ml，接種膽鹽乳糖增菌培養基中，置35℃培養18-24h，陰性菌對照組為陰性（未生長）；取金黃色葡萄球菌50～100cfu/ml，接種亞酸鹽肉湯增菌培養基中，置35℃培養18～24h，陰性菌對照組為陰性（未生長）；取金黃色葡萄球菌50～100cfu/ml，接種膽鹽乳糖發酵培養基中，置35℃培養18～24h，陰性菌對照組為陰性（未生長）。

3.2.2 試驗組 取3瓶（100 ml/瓶）膽鹽乳糖增菌培養基，分別接入1： 10供試液10ml，取3支膽鹽乳糖發酵管，分別接入1：10供試液1ml；取3瓶 （200ml/瓶）亞硝酸鹽肉湯增菌培養基，分別接入樣品10g；每組其中一瓶（管）作為樣品組；另一瓶（管）加入相應的陰性對照菌作為試驗組；第三瓶（管）加入相應的陽性對照菌作為陰性菌對照組；置35℃培養24～48h，結果見表4。

4 討論

從表1中可見第一及第二個制劑中的回收率不低于70%，對細菌的生長基本無抑制作用，可以采用平皿法。木米亞片、復方蘇潤江片、通竅阿亞然及派克片、復方賽比爾片及庫克亞片等對金黃色黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及大腸埃希菌的回收率均值在65%-88%之間，說明有顯著地抑菌作用，所以應采用培養基稀釋法。根據實驗結果確定下屬試驗方法。

本試驗結果表明：松布力糖漿及強心艾維西木糖漿對5種陽性對照菌的平皿法的回收率達到70%以上，證明無明顯的抑菌作用，因此常規方法可以做上述兩種制劑的微生物限度檢查。抑菌作用比較弱的木米亞片，復方蘇潤江片，通竅阿亞然及派克片，復方賽比爾片及庫克亞片可以采用培養基稀釋法（0.2ml/皿）。

參考文獻

[1] 馬越，特玉香，杜平華，等.16種中成藥微生物限度檢査法的驗證[J].中國藥品標準，2005，6（6）：356-359.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄79-88.

【摘 要】 目的：建立松布力糖漿、強心艾維西木糖漿、木米亞片、復方蘇潤江片、通竅阿亞然及派克片、復方賽比爾片及庫克亞片等維吾爾醫醫院制劑微生物限度檢查方法。方法：根據《中國藥典》2010年版的規定，用5種陽性對照菌組對回收率試驗進行檢測樣品是否含抑菌成分。結果：松布力糖漿及強心艾維西木糖漿無明顯抑菌現象，可以采用平皿法；木米亞片、復方蘇潤江片、通竅阿亞然及派克片、復方賽比爾片及庫克亞片等對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的回收率均值在65%-88%，有明顯的抑菌作用，應該采用培養基稀釋法?？刂凭炞C中，試驗菌生長很好。結論：該方法對所選7種樣品的檢驗有效可行，可用于上述品種的微生物限度檢查。

【關鍵詞】 微生物限度檢查；方法學驗證；醫院制劑

【中圖分類號】R29 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2014）06-0003-02

原料的處理不當或者包裝不嚴密等是導致醫院制劑污染的主要原因，為了達到藥品生產的安全指標必須對其進行微生物限度檢查保證制劑的安全有效。

1 試驗材料

1.1 供試品 松布力糖漿（批號：201303084-1、201303084-2、201303084-3）；強心艾維西木糖漿（批號：201303083-1、201303083-2、201303083-3）；木米亞片（批號：201304102-1、201304102-2、201304102-3）；復方蘇潤江片（批號：201303078-1、201303078-2、201303078-3）；通竅阿亞然及派克片（批號： 201303075-1、201303075-2、201303075-3）；復方賽比爾片（批號：201303073-1、201303073-2、201303073-3）庫克亞片（批號：201303057-1、201303057-2、201303057-3），以上制劑均由喀什地區維吾爾醫醫院提供。

1.2 試驗用菌種（第四代） 金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉菌[CMCC（F）98003]均由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.3 稀釋液、緩沖液 0.9%無菌氯化鈉溶液、pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號：100708）。

1.4 培養基 營養瓊脂培養基（批號：0102262）、膽鹽乳糖增菌液（批號：0102282）、營養肉湯培養基（批號：101213）、虎紅培養基（批號：010214）、4-甲基傘形酮葡糖苷酸（MUG）培養基（批號：100128）、膽鹽硫乳發酵培養基，均由北京三藥科技開發有限公司提供。

1.5 其他物品按規定滅菌備用。

2 方法和結果

2.1 菌液的制備 取大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]的新鮮培養物，分別接種于營養肉湯培養基，30～35℃培養18～24h；取白色念珠菌的新鮮培養物接種于改良馬丁培養基中，23～28℃培養24～48h。上述培養物用0.9%氯化鈉溶液（使用前高壓霉菌使成無菌）稀釋成1ml含50～100cfu菌的菌懸液；黑曲霉的新鮮培養物接種于改良馬丁瓊脂斜面的培養基中，培養5至7天，使大量孢子產生，用0.9%無菌氯化鈉溶液，將其洗脫，然后用0.9%的無菌氯化鈉溶液把菌液稀釋至1ml中含50～100cfu的菌懸液，保存備用。

2.2 菌液的檢驗 分別取上述三種菌菌懸液各1ml，注入用營養瓊脂培養基20ml的平皿中，平行測定兩皿，30℃至35℃培養48小時，計數，菌液應為每ml含50～100cfu。

取上述白色念珠菌、黑曲霉菌菌懸液各1ml，用加入有虎紅瓊脂培養基20ml的平皿中，為了減少實驗中的隨機誤差平行測定兩皿，規定的溫度范圍內培養72小時，觀察，計數，菌液中有效菌株的濃度應該在每1ml含50～100cfu的范圍之內。

2.3 供試品溶液的制備[2]分別取已準備好的固體樣品各10g，研細，液體樣品10ml加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100ml，制成10-1的供試液。

3 回收率測定[1]

3.1 細菌、霉菌、酵母菌計數方法的驗證

3.1.1 平皿法：取供試液1ml及50～100cfu的試驗菌，分別加入培養皿中，平行制備2個平皿，將它凝固后，培養48小時，按《中國藥典》規定的方法測定其菌落數，結果見表1。

由表1可知，松布力糖漿及強心艾維西木糖漿對上述五種代表菌回收率均高于70%以上，無明顯抑菌現象，細菌、霉菌及酵母菌檢查可以采用平皿法，其他的制劑對可能含有抑菌成分需要進一步驗證。

3.1.2 培養基稀釋法 將上述試驗菌株接種于0.2ml/皿、0.1ml/皿的供試品液中，再加20ml瓊脂培養基，培養48小時，觀察結果，細菌計數，測定其回收率，結果見表2、3。

從表2可以看出木米亞片、復方蘇潤江片、通竅阿亞然及派克片庫克亞片等品種對上述代表菌回收率均高于70%以上，無明顯抑菌現象。細菌、霉菌及酵母菌檢查可以采用培養基稀釋法（0.2ml/皿）。

從表3可以看出復方賽比爾片對上述代表菌回收率均高于70%以上，無明顯抑菌現象。細菌、霉菌及酵母菌檢查可以采用培養基稀釋法（0.1ml/皿）。

3.2 控制菌檢查方法驗證

3.2.1 陰性菌對照組 取金黃色葡萄球菌50～100cfu/ml，接種膽鹽乳糖增菌培養基中，置35℃培養18-24h，陰性菌對照組為陰性（未生長）；取金黃色葡萄球菌50～100cfu/ml，接種亞酸鹽肉湯增菌培養基中，置35℃培養18～24h，陰性菌對照組為陰性（未生長）；取金黃色葡萄球菌50～100cfu/ml，接種膽鹽乳糖發酵培養基中，置35℃培養18～24h，陰性菌對照組為陰性（未生長）。

3.2.2 試驗組 取3瓶（100 ml/瓶）膽鹽乳糖增菌培養基，分別接入1： 10供試液10ml，取3支膽鹽乳糖發酵管，分別接入1：10供試液1ml；取3瓶 （200ml/瓶）亞硝酸鹽肉湯增菌培養基，分別接入樣品10g；每組其中一瓶（管）作為樣品組；另一瓶（管）加入相應的陰性對照菌作為試驗組；第三瓶（管）加入相應的陽性對照菌作為陰性菌對照組；置35℃培養24～48h，結果見表4。

4 討論

從表1中可見第一及第二個制劑中的回收率不低于70%，對細菌的生長基本無抑制作用，可以采用平皿法。木米亞片、復方蘇潤江片、通竅阿亞然及派克片、復方賽比爾片及庫克亞片等對金黃色黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及大腸埃希菌的回收率均值在65%-88%之間，說明有顯著地抑菌作用，所以應采用培養基稀釋法。根據實驗結果確定下屬試驗方法。

本試驗結果表明：松布力糖漿及強心艾維西木糖漿對5種陽性對照菌的平皿法的回收率達到70%以上，證明無明顯的抑菌作用，因此常規方法可以做上述兩種制劑的微生物限度檢查。抑菌作用比較弱的木米亞片，復方蘇潤江片，通竅阿亞然及派克片，復方賽比爾片及庫克亞片可以采用培養基稀釋法（0.2ml/皿）。

參考文獻

[1] 馬越，特玉香，杜平華，等.16種中成藥微生物限度檢査法的驗證[J].中國藥品標準，2005，6（6）：356-359.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄79-88.

【摘 要】 目的：建立松布力糖漿、強心艾維西木糖漿、木米亞片、復方蘇潤江片、通竅阿亞然及派克片、復方賽比爾片及庫克亞片等維吾爾醫醫院制劑微生物限度檢查方法。方法：根據《中國藥典》2010年版的規定，用5種陽性對照菌組對回收率試驗進行檢測樣品是否含抑菌成分。結果：松布力糖漿及強心艾維西木糖漿無明顯抑菌現象，可以采用平皿法；木米亞片、復方蘇潤江片、通竅阿亞然及派克片、復方賽比爾片及庫克亞片等對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的回收率均值在65%-88%，有明顯的抑菌作用，應該采用培養基稀釋法。控制菌驗證中，試驗菌生長很好。結論：該方法對所選7種樣品的檢驗有效可行，可用于上述品種的微生物限度檢查。

【關鍵詞】 微生物限度檢查；方法學驗證；醫院制劑

【中圖分類號】R29 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2014）06-0003-02

原料的處理不當或者包裝不嚴密等是導致醫院制劑污染的主要原因，為了達到藥品生產的安全指標必須對其進行微生物限度檢查保證制劑的安全有效。

1 試驗材料

1.1 供試品 松布力糖漿（批號：201303084-1、201303084-2、201303084-3）；強心艾維西木糖漿（批號：201303083-1、201303083-2、201303083-3）；木米亞片（批號：201304102-1、201304102-2、201304102-3）；復方蘇潤江片（批號：201303078-1、201303078-2、201303078-3）；通竅阿亞然及派克片（批號： 201303075-1、201303075-2、201303075-3）；復方賽比爾片（批號：201303073-1、201303073-2、201303073-3）庫克亞片（批號：201303057-1、201303057-2、201303057-3），以上制劑均由喀什地區維吾爾醫醫院提供。

1.2 試驗用菌種（第四代） 金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉菌[CMCC（F）98003]均由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.3 稀釋液、緩沖液 0.9%無菌氯化鈉溶液、pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號：100708）。

1.4 培養基 營養瓊脂培養基（批號：0102262）、膽鹽乳糖增菌液（批號：0102282）、營養肉湯培養基（批號：101213）、虎紅培養基（批號：010214）、4-甲基傘形酮葡糖苷酸（MUG）培養基（批號：100128）、膽鹽硫乳發酵培養基，均由北京三藥科技開發有限公司提供。

1.5 其他物品按規定滅菌備用。

2 方法和結果

2.1 菌液的制備 取大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]的新鮮培養物，分別接種于營養肉湯培養基，30～35℃培養18～24h；取白色念珠菌的新鮮培養物接種于改良馬丁培養基中，23～28℃培養24～48h。上述培養物用0.9%氯化鈉溶液（使用前高壓霉菌使成無菌）稀釋成1ml含50～100cfu菌的菌懸液；黑曲霉的新鮮培養物接種于改良馬丁瓊脂斜面的培養基中，培養5至7天，使大量孢子產生，用0.9%無菌氯化鈉溶液，將其洗脫，然后用0.9%的無菌氯化鈉溶液把菌液稀釋至1ml中含50～100cfu的菌懸液，保存備用。

2.2 菌液的檢驗 分別取上述三種菌菌懸液各1ml，注入用營養瓊脂培養基20ml的平皿中，平行測定兩皿，30℃至35℃培養48小時，計數，菌液應為每ml含50～100cfu。

取上述白色念珠菌、黑曲霉菌菌懸液各1ml，用加入有虎紅瓊脂培養基20ml的平皿中，為了減少實驗中的隨機誤差平行測定兩皿，規定的溫度范圍內培養72小時，觀察，計數，菌液中有效菌株的濃度應該在每1ml含50～100cfu的范圍之內。

2.3 供試品溶液的制備[2]分別取已準備好的固體樣品各10g，研細，液體樣品10ml加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100ml，制成10-1的供試液。

3 回收率測定[1]

3.1 細菌、霉菌、酵母菌計數方法的驗證

3.1.1 平皿法：取供試液1ml及50～100cfu的試驗菌，分別加入培養皿中，平行制備2個平皿，將它凝固后，培養48小時，按《中國藥典》規定的方法測定其菌落數，結果見表1。

由表1可知，松布力糖漿及強心艾維西木糖漿對上述五種代表菌回收率均高于70%以上，無明顯抑菌現象，細菌、霉菌及酵母菌檢查可以采用平皿法，其他的制劑對可能含有抑菌成分需要進一步驗證。

3.1.2 培養基稀釋法 將上述試驗菌株接種于0.2ml/皿、0.1ml/皿的供試品液中，再加20ml瓊脂培養基，培養48小時，觀察結果，細菌計數，測定其回收率，結果見表2、3。

從表2可以看出木米亞片、復方蘇潤江片、通竅阿亞然及派克片庫克亞片等品種對上述代表菌回收率均高于70%以上，無明顯抑菌現象。細菌、霉菌及酵母菌檢查可以采用培養基稀釋法（0.2ml/皿）。

從表3可以看出復方賽比爾片對上述代表菌回收率均高于70%以上，無明顯抑菌現象。細菌、霉菌及酵母菌檢查可以采用培養基稀釋法（0.1ml/皿）。

3.2 控制菌檢查方法驗證

3.2.1 陰性菌對照組 取金黃色葡萄球菌50～100cfu/ml，接種膽鹽乳糖增菌培養基中，置35℃培養18-24h，陰性菌對照組為陰性（未生長）；取金黃色葡萄球菌50～100cfu/ml，接種亞酸鹽肉湯增菌培養基中，置35℃培養18～24h，陰性菌對照組為陰性（未生長）；取金黃色葡萄球菌50～100cfu/ml，接種膽鹽乳糖發酵培養基中，置35℃培養18～24h，陰性菌對照組為陰性（未生長）。

3.2.2 試驗組 取3瓶（100 ml/瓶）膽鹽乳糖增菌培養基，分別接入1： 10供試液10ml，取3支膽鹽乳糖發酵管，分別接入1：10供試液1ml；取3瓶 （200ml/瓶）亞硝酸鹽肉湯增菌培養基，分別接入樣品10g；每組其中一瓶（管）作為樣品組；另一瓶（管）加入相應的陰性對照菌作為試驗組；第三瓶（管）加入相應的陽性對照菌作為陰性菌對照組；置35℃培養24～48h，結果見表4。

4 討論

從表1中可見第一及第二個制劑中的回收率不低于70%，對細菌的生長基本無抑制作用，可以采用平皿法。木米亞片、復方蘇潤江片、通竅阿亞然及派克片、復方賽比爾片及庫克亞片等對金黃色黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及大腸埃希菌的回收率均值在65%-88%之間，說明有顯著地抑菌作用，所以應采用培養基稀釋法。根據實驗結果確定下屬試驗方法。

本試驗結果表明：松布力糖漿及強心艾維西木糖漿對5種陽性對照菌的平皿法的回收率達到70%以上，證明無明顯的抑菌作用，因此常規方法可以做上述兩種制劑的微生物限度檢查。抑菌作用比較弱的木米亞片，復方蘇潤江片，通竅阿亞然及派克片，復方賽比爾片及庫克亞片可以采用培養基稀釋法（0.2ml/皿）。

參考文獻

[1] 馬越，特玉香，杜平華，等.16種中成藥微生物限度檢査法的驗證[J].中國藥品標準，2005，6（6）：356-359.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄79-88.