支氣管肺泡灌洗液中β-聯蛋白、轉化生長因子β1、Clara細胞分泌蛋白16、Ⅱ型肺泡細胞表面抗原6在支氣管肺發育不良中的表達及意義

楊敏， 李林瑞， 黃建寶， 孟燕妮， 陳艷萍

臨床論著

支氣管肺泡灌洗液中β-聯蛋白、轉化生長因子β1、Clara細胞分泌蛋白16、Ⅱ型肺泡細胞表面抗原6在支氣管肺發育不良中的表達及意義

楊敏， 李林瑞， 黃建寶， 孟燕妮， 陳艷萍

目的 探討β-聯蛋白、轉化生長因子β1(TGF-β1)、Clara細胞分泌蛋白16(cc16)、Ⅱ型肺泡細胞表面抗原6(KL-6)在支氣管肺發育不良(BPD)患兒支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的表達及其意義。方法 機械通氣早產兒70例，其中40例診斷為BPD的患兒作為觀察組，30例非BPD患兒作為對照組。采用酶聯免疫吸附試驗法檢測兩組患兒機械通氣1、24、48、72 h BALF中β-聯蛋白、TGF-β1、cc16、KL-6水平。結果 觀察組平均胎齡及出生體質量顯著低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，吸氧時間及機械通氣時間顯著長于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。隨機械通氣時間的延長，觀察組cc16水平呈逐漸降低趨勢，而β-聯蛋白、TGF-β1、KL-6水平呈逐漸升高趨勢，且48、72 h時均與1 h時各指標水平差異有統計學意義(P<0.01)。對照組TGF-β1、cc16于機械通氣72 h時與1 h時水平差異有統計學意義(P<0.01)，而β-聯蛋白、KL-6水平在各時間點的差異均無統計學意義(P>0.05)。觀察組機械通氣各時間點β-聯蛋白、TGF-β1水平均顯著高于對照組各相應時間點指標水平,cc16顯著低于對照組水平，差異有統計學意義(P<0.05)，而KL-6在機械通氣48、72 h時高于對照組相應時間點，差異有統計學意義(P<0.05)，余時間點差異無統計學意義(P>0.05)。各時間點比較，BPD中重度組β-聯蛋白、TGF-β1、KL-6水平均顯著高于輕度組，差異有統計學意義(P<0.05)，而cc16水平顯著低于輕度組，差異有統計學意義(P<0.05)。多元逐步回歸分析結果顯示，機械通氣時間、吸氧時間的延長及低cc16水平是BPD發生的危險因素(P<0.01)。結論 機械通氣早產兒BPD的發生與機械通氣、吸氧時間的延長及低cc16水平密切相關，通過監測早產兒初始機械通氣BALF中β-聯蛋白、TGF-β1、cc16水平可對早產兒BPD的發生提供預測依據。

支氣管肺發育不良； β-聯蛋白； 轉化生長因子β1； Clara細胞分泌蛋白16； Ⅱ型肺泡細胞表面抗原6； 嬰兒，新生

早產兒多因急性呼吸窘迫需進行機械通氣和氧療，而隨著機械通氣和氧療時間的延長往往易導致患兒肺損傷和支氣管肺發育不良(bronchial pulmonary dysplasia，BPD)[1-2]。目前，BPD的病因及發病機制尚未闡明。有研究發現，Wnt/β-聯蛋白信號通路、Ⅱ型肺泡細胞表面抗原6(Krebs Von den Lungen-6,KL-6)、Clara細胞分泌蛋白16(Clara cell secretory protein16, cc16)、轉化生長因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)可能參與了肺組織損傷再修復、上皮細胞-間充質轉化等過程[3]。因此，本研究動態監測機械通氣BPD患兒支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中β-聯蛋白、TGF-β1、cc16、KL-6水平，并與非BPD患兒比較，旨在探討其動態變化在BPD中的作用,現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012-01/2013-12在湖南省兒童醫院呼吸內二科住院行機械通氣的早產兒70例，經陰道分娩24例，剖宮產46例。所有病例在產前均應用能量合劑、地塞米松治療，促進胎兒生長及胎肺成熟。新生兒出生時由新生兒科和麻醉科醫師在場，即刻進行Apger評分，胎齡評分及氣管插管等急救措施。其中40例診斷為BPD的患兒作為觀察組，其中男27例，女13例；經陰道分娩13例，剖宮產27例；肺透明膜病者19例，反復呼吸暫停者10例，新生兒肺炎者7例，窒息者4例；40例BPD患兒中輕度23例，中重度17例。另外30例非BPD患兒作為對照組，其中男21例，女9例；經陰道分娩11例，剖宮產19例；肺透明膜病者9例，反復呼吸暫停者9例，反復肺部感染者6例，窒息者6例。兩組患兒在性別、分娩方式、疾病類型、窒息情況、感染情況方面比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標準 BPD患兒均符合2001年美國國家兒童保健及人類發展研究院(NICHD)和心臟、肺及血液研究院(NHLBI)及罕見病委員會聯合發布的診斷標準[4]。輕度BPD指出生后28 d需要氧療，但糾正胎齡36周(或出生后56 d)不需要氧療；中重度BPD指出生后28 d需要氧療，糾正胎齡36周(或出生后56 d)仍然需要氧療。

1.3 納入標準 (1)進行機械通氣的早產兒；(2)患兒家長同意并簽署知情同意書，并通過本院倫理委員會批準。

1.4 排除標準 因嚴重肺部感染、窒息等搶救無效死亡者。

1.5 治療方法 兩組患兒均給予氣管插管，并給予美國Infant Star 950型呼吸機進行機械通氣。機械通氣指征包括：存在呼吸窘迫綜合征Ⅲ～Ⅳ級，或經吸氧治療不能糾正的Ⅰ型或Ⅱ型呼吸衰竭，反復呼吸暫停等情況。根據患兒動脈血氣情況動態調整呼吸機參數，維持目標：血氧飽和度≥0.85，pH值7.30～7.45，動脈血氧分壓≥6.67 kPa，3.6 kPa≤動脈血二氧化碳分壓≤5.5 kPa。若患兒原發疾病治愈或基本控制，全身情況良好，吸氣峰壓<0.196 kPa，通氣頻率降至10次/分，吸入氧濃度不超過40%，血氣分析顯示正常則可撤機。

1.6 指標檢測 (1)BALF的收集：分別于通氣后1、24、48、72 h將生理鹽水溫熱后沿患兒氣管插管滴入，每次約1 mL/kg，同時給予呼吸機給氧3～5次，迅速插入吸痰管直至碰到阻力，采用<6 kPa的負壓吸引，在吸引同時退出吸痰管，整個操作需迅速完成，共進行2次操作，混合2次吸引的BALF，并記錄體積，紗布濾過黏液后4 ℃離心15 min，取上清液，-80 ℃保存備用。整個操作均需嚴格無菌操作，并保持回路通暢，灌洗液溫度適宜且操作精準。(2)相關指標檢測：采用酶聯免疫吸附試驗法(ELISA)檢測兩組患兒1、24、48、72 h不同時段BALF中β-聯蛋白、TGF-β1、cc16、KL-6的表達水平。

2 結果

2.1 兩組患兒一般資料比較 觀察組平均胎齡及出生體質量顯著低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；觀察組患兒吸氧時間及機械通氣時間顯著長于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

注：與對照組比較，at=2.54，2.33，P<0.05；bt=11.20，13.46，P<0.01。

2.2 兩組患兒相關指標比較 見表2。

注：與對照組相同時間點相比較，at=2.53，2.67，7.20，13.52,2.96，3.17，9.54，15.61,2.63，2.76，3.99，12.52,9.56，13.67，P<0.05；與本組1 h比較，bt=9.22,P<0.05，ct=5.12，11.22，7.86，13.22，2.76，5.83，17.64,P<0.01。

表2結果表明，隨機械通氣時間的延長，觀察組cc16水平呈逐漸降低趨勢，而β-聯蛋白、TGF-β1、KL-6水平呈逐漸升高趨勢，且48、72 h時均與1 h時各指標水平比較差異有統計學意義(P<0.01)。對照組TGF-β1、cc16于機械通氣72 h時與1 h時水平比較差異有統計學意義(P<0.01)，而β-聯蛋白、KL-6水平在各時間點間的差異均無統計學意義(P>0.05)。觀察組機械通氣各時間點β-聯蛋白、TGF-β1水平均顯著高于對照組各相應時間點指標水平,cc16顯著低于對照組(P<0.05)，而KL-6在機械通氣48、72 h時高于對照組相應時間點(P<0.05)，余時間點差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3 輕度、中重度BPD患兒機械通氣后不同時間點β-聯蛋白、TGF-β1、cc16、KL-6水平的比較 見表3。

注：與輕度組相同時間點相比較，at=2.61，2.93，5.29，11.63，2.76，5.28，7.19，13.58，2.71，2.96，5.17，9.83，5.93，7.28，9.15，12.8,P<0.05。

表3結果表明，隨機械通氣時間的延長，輕度組及中重度組cc16水平均呈逐漸降低趨勢，β-聯蛋白、TGF-β1、KL-6水平呈逐漸升高趨勢，差異均有統計學意義(F=19.61、23.52、21.63、21.67，P<0.01)。各時間點比較，中重度組β-聯蛋白、TGF-β1、KL-6水平均顯著高于輕度組，而cc16水平顯著低于輕度組，差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.4 BPD發生的多元回歸分析 將患兒的胎齡、出生體質量、機械通氣時間、吸氧時間及機械通氣1 h時β-聯蛋白、TGF-β1、cc16、KL-6水平進行多元逐步回歸分析，結果顯示，機械通氣時間、吸氧時間的延長及低cc16水平是BPD發生的危險因素(P<0.01)。見表3。

3 討論

KL-6屬Cluster 9的MUC-1類糖蛋白，主要由增殖或受損的AT-Ⅱ分泌，可以成為間接判斷肺上皮損傷程度及再生的指標[5]。Clara水平細胞分布于終末細支氣管和呼吸性細支氣管上皮的非纖毛細胞，因此肺上皮襯液、BALF、血漿中cc16可作為反映Clara細胞及肺泡毛細血管膜完整性早期改變的敏感性指標[6]。有研究稱在機械通氣造成的炎性反應性肺損傷時，β-聯蛋白過度表達，可進一步促進細胞周期蛋白D1轉錄，有助于創面的修復。而TGF-β1可促進細胞外基質形成，抑制酶解作用，促進新生血管的形成，趨化成纖維細胞，最終起到促纖維化的作用。研究發現，肺發育不良患者TGF-β1可發生過度表達，其可能通過直接抑制支氣管上皮細胞的分化過程及影響肺表面活性蛋白的表達，導致肺囊泡數目形成減少而發揮作用[7]。動物實驗發現，Wnt信號通路活化在整個鼠胚胎的發育過程發揮重要作用，β-聯蛋白可表達于未分化的原始上皮、分化的肺泡上皮及相鄰間質細胞等多種細胞的細胞質和細胞核，在肺發育過程中至關重要[6]。同時，低cc16水平也被認為是評估早產兒肺發育不良的重要標志物。

本研究結果顯示，觀察組BPD患兒機械通氣后1 h BALF中β-聯蛋白、TGF-β1明顯高于對照組，cc16水平明顯低于對照組，說明上述因子可能在BPD的發生及肺的發育成熟中起重要作用。因此通過監測早產兒初始機械通氣BALF中β-聯蛋白、TGF-β1、cc16水平可對早產兒的肺發育程度及BPD的發生風險提供評估依據。

本研究結果還顯示，觀察組的吸氧時間及機械通氣時間顯著長于對照組，說明早產兒BPD的發生可能與吸氧及機械通氣時間的延長有關。進一步回歸分析示，機械通氣時間、吸氧時間的延長及低cc16水平是BPD發生的危險因素。說明機械通氣及吸氧本身可作為肺功能障礙的治療措施，同時又是早產兒BPD發生的危險因素。由于早產兒肺發育尚未成熟，持續的機械通氣可導致和增加肺部感染的概率及氣道黏膜炎癥，導致氣道阻力及呼吸負荷增加，從而影響肺的發育，出現呼吸機依賴或撤機時間延長，最終導致早產兒BPD的發生。同時在機械通氣狀態下，肺組織可持續處于高氧狀態，導致大量超氧化物和過氧化氫的產生，導致機體產生嚴重的氧化應激反應，但機體的抗氧化系統一般在妊娠最后3個月發育成熟，早產兒的抗氧化系統尚未成熟，極易受到自由基的損傷，因此在持續機械通氣下出現氣道上皮細胞大量死亡，肺泡數目減少，結構破壞，肺間質纖維化，最終發生BPD。

本研究結果顯示，隨時間延長，觀察組cc16水平呈逐漸降低趨勢，而β-聯蛋白、TGF-β1、KL-6水平呈逐漸升高趨勢，提示觀察組患兒在機械通氣48 h后即可能開始出現肺損傷，而對照組在72 h后可能出現輕微的肺損傷。因此機械通氣是導致KL-6、β-聯蛋白、TGF-β1、cc16水平變化及BPD發生的重要因素。進一步比較不同BPD分級各指標水平，結果顯示在各時間點比較，中重度組β-聯蛋白、TGF-β1、KL-6水平均顯著高于輕度組，而cc16水平顯著低于輕度組。說明各指標水平的變化可在一定程度上反映BPD分級。因此通過動態監測機械通氣患兒BALF中KL-6、β-聯蛋白、TGF-β1、cc16水平可對肺損傷的發生及程度進行預測及評估，盡早采取保護措施，盡可能減少BPD的發生。

綜上所述，β-聯蛋白、TGF-β1、cc16在早產兒BPD的發生機制中有重要作用，而KL-6可反映肺上皮的損傷程度。通過監測早產兒初始機械通氣BALF中β-聯蛋白、TGF-β1、cc16水平可對早產兒BPD的發生提供預測依據。然而本文未對β-聯蛋白、TGF-β1、cc16水平與BPD分度的關系進行探討，有待進一步研究。

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(本文編輯：劉穎)

The expression and significance of β-Catenin，transforming growth factor beta 1(TGF-beta 1), Clara cell secretory protein 16(cc16) and surface antigen 6 of alveolar epithelial cell Ⅱ(KL-6) in bronchialveolar lavage fluid(BALF) of children with bronchial pulmonary dysplasia(BPD)

YANGMin，LILinrui，HUANGJianbao，MENGYanni，CHENYanping.

TheSecondDepartmentofRespirationofHunanProvinceChildren'sHospital，Changsha410011，China.

Objective To investigate the expression of β-Catenin，transforming growth factor beta 1(TGF-beta 1), Clara cell secretory protein 16 (cc16), and surface antigen 6 of alveolar epithelial cell Ⅱ(KL-6) in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) of children with bronchial pulmonary dysplasia(BPD) and its significance.Method Of 70 cases of premature infants with mechanical ventilation, 40 cases diagnosed with BPD were included in observation group, 30 cases of non-BPD patients were as control group. Detect the levels of β-Catenin, TGF-beta 1, cc16 and KL-6 in BALF of two groups of children respectively after 1, 24, 48 and 72 h of mechanical ventilation using enzyme-linked immunosorbent assay method. Result Average gestational age and birth body mass of observation group were significantly lower than those of the control group, the difference being statistically significant (P<0.05).The time of mechanical ventilation and oxygen therapy were significantly longer than the control group, the difference being statistically significant(P<0.01). With longer duration of mechanical ventilation, the levels of cc16 of observation group showed a downward trend, and β-Catenin, TGF-beta 1 and KL-6 levels showed an upward trend, and the level difference of each index in time point of 48 and 72 h was statistically significant compared with that of 1 h(P<0.01). The difference of the level of TGF-beta 1 and cc16 of control group at time point 1 h and 72 h of mechanical ventilation was statistically significant (P<0.01), but the differences of level of beta protein and KL-6 at various time points had no statistical significance (P>0.05). Index levels of β-Catenin and TGF-beta 1 of observation group with mechanical ventilation at each time point were significantly higher than control group in the corresponding time point, but cc16 was significantly lower than the control group, the difference being statistically significant (P<0.05), while the KL-6 of observation group was higher than the control group in the corresponding time point of 48 and 72 h, the difference being statistically significant(P<0.05).There was no statistically significant difference at other time points(P>0.05). Comparing each time point,β-catenin, TGF-β1and KL-6 levels in the moderate and severe BPD group were significantly higher than mild group (P<0.05), but cc16 level was significantly lower than mild group (P<0.05). Multiple stepwise regression analysis results showed that the longer duration of mechanical ventilation time and oxygen and the low cc16 levels are a risk factor for the occurrence of BPD(P<0.01).Conclusion The occurrence of premature BPD is closely related to longer duration of mechanical ventilation and oxygen and low cc16 levels. Monitoring the level of β-Catenin, TGF-beta 1 and cc16 of BALF of premature infants in initial mechanical ventilation can provide the basis for predicting the occurrence of premature BPD and its classification.

bronchial pulmonary dysplasia； β-Catenin； transforming growth factor beta 1； Clara cell secretory protein 16； Krebs Von den Lungen-6； infant，newborn

湖南省科技計劃項目(2012SK3256)

410011 長沙，湖南省兒童醫院呼吸內二科

楊敏(1982-)，女，醫學碩士，主治醫師。研究方向：小兒呼吸系統疾病的臨床診治。

陳艷萍，410011 長沙，湖南省兒童醫院呼吸內二科。

10.3969/j.issn.1674-3865.2015.03.008

R563.1+2

A

1674-3865(2015)03-0219-05

2015-04-10)