結核分枝桿菌聯合藥敏試驗的研究進展

張琳琳 楊華 肖和平

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·綜述·

結核分枝桿菌聯合藥敏試驗的研究進展

張琳琳 楊華 肖和平

結核病仍然是威脅全球性的傳染病，隨著耐多藥和廣泛耐藥結核分枝桿菌的出現，結核病的控制變得更加困難。為了防止結核分枝桿菌對某種藥物耐藥，WHO推薦結核病的治療以幾種不同的藥物聯合治療為主。對于耐藥結核病的治療應根據藥敏結果采取個體化治療方案。目前的藥敏試驗大都是針對單藥進行的，但是有時即使單藥藥敏試驗結果是耐藥，臨床中與其他藥物聯合使用仍有較好的治療效果，這提醒我們幾種藥物聯合使用可能會增強其抗菌活性。當前存在一線藥物耐藥問題嚴重以及二線藥物價格昂貴、毒性大等問題，因此迫切需要我們尋找新的抗結核化療方案來控制耐藥結核病的流行。在建立新的化學方案前，進行可量化的重復實驗來評估方案中幾種藥物的聯合抗菌活性是十分重要的。

結核分枝桿菌； 微生物敏感性試驗

為了防止結核分枝桿菌耐藥的發生，WHO一直推薦抗結核藥物的聯合治療。藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)是檢測耐藥與否的最有效方法，臨床醫生可以根據藥敏試驗結果制訂更趨于合理的抗結核化學治療(簡稱“化療”)方案。但是目前的藥敏試驗主要是針對單藥檢測而設計的，對于評估化療方案的效果尚存缺陷。具體表現在單藥耐藥并不意味著化療方案無效，仍有可能獲得較好的治療效果，這可能與抗結核藥物的協同作用有關；方案中所有藥物均敏感也不代表治療效果一定很好，這則可能系聯合藥物間的拮抗作用所致。因此，建立可量化的重復實驗評估化療方案中藥物的聯合抗菌活性是十分重要的[1]；聯合藥敏試驗可望解決這一重要需求。聯合藥敏試驗的實驗方法是在國際臨床實驗室標準委員會制定的肉湯稀釋法的基礎上提出的，能夠在特定時間內評估藥物聯合作用時的抑菌或殺菌活性[2]。

微生物學家通常使用棋盤法來評估幾種藥物的聯合效應，而肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法或藥敏紙片擴散法也可以用來評估藥物的聯合效應[2]。棋盤法可以對幾種藥物聯合效應進行體外評估并指導臨床用藥，包括微量棋盤稀釋法、試管棋盤稀釋法(大量稀釋法)和瓊脂棋盤稀釋法3種，其中微量棋盤稀釋法為最常用的聯合藥敏試驗方法[2]。微量棋盤稀釋法常使用96孔無菌微孔板，每種藥物最高從2倍最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)開始倍比稀釋，一般取6～8個稀釋度[3]，通過計算部分抑菌濃度指數(fractional inhibitory concentration，FIC)，判斷藥物之間的相互作用。2種藥物聯合藥敏試驗的FIC值計算為：FIC=聯合MIC[A]/單藥MIC[A]+聯合MIC[B]/單藥MIC[B], FIC指數≤0.50定義為協同，0.50～4.00定義為相加與無關，>4.00定義為拮抗[2]。3種藥物聯合藥敏試驗的FIC值計算為：FIC=聯合MIC[A]/單藥MIC[A]+聯合MIC[B]/單藥MIC[B]+聯合MIC[C]/單藥MIC[C]，FIC指數≤0.75定義為協同，0.75～4.00定義為相加與無關，>4.00定義為拮抗(A、B、C分別代表3種不同的抗結核藥物)[4]。聯合藥敏試驗可適用于以下幾種情況：(1)對藥物之間的協同作用不清楚；(2)新的化療方案；(3)由于細菌的耐藥或治療失敗而對藥物協同性不能確定[2]。本研究主要對聯合藥敏試驗在細菌耐藥性檢測、尤其是結核分枝桿菌藥敏檢測中的研究進展做一綜述。

一、聯合藥敏試驗在細菌藥敏檢測中的應用

聯合藥敏試驗中最常使用的是微量棋盤稀釋法，用來檢測聯合用藥對各種耐藥菌(如耐藥金黃色葡萄球菌和耐藥淋球菌等)的體外效應，并指導臨床用藥。

早在1974年，人們使用棋盤瓊脂稀釋法測定新諾明、甲氧氨芐嘧啶、多黏菌素B每2種藥物聯合時及3種藥物聯合時對不同的革蘭陰性桿菌的聯合效應[5]。結果表明，甲氧氨芐嘧啶-多黏菌素的協同作用要優于其他的組合用藥，3種藥聯合作用時抗菌效果還會增加。這一研究為臨床治療革蘭陰性桿菌引起的難治性感染性疾病提供了用藥依據，而且為以后的研究做了鋪墊。

1978年，Berenbaum[6]指出二維棋盤法測定2種藥物的協同性是可行的，但是測定3種較困難，對4種及以上均不可行。因此在二維棋盤法的基礎上首次提出三維棋盤法的理論操作程序。1980年，Yu等[7]使用三維棋盤法對假單胞菌進行實驗，發現慶大霉素-羧芐青霉素-利福平聯合使用時的平均的部分抑菌濃度指數為0.32，甲氧氨芐嘧啶-羧芐青霉素-利福平聯合使用時的平均的部分抑菌濃度指數為0.18，對14種臨床假單胞菌株的試驗均證實3種藥物之間具有協同作用。1980年，Yoon等[8]也使用三維棋盤法對鮑曼不動桿菌進行研究，發現多黏菌素-亞胺培南-利福平聯合使用具有協同殺菌效果。這是三維棋盤法首次在普通細菌耐藥性檢測中的應用，并通過數據分析證明多藥聯合可增加殺菌效果。

2012年，Cetin等[9]使用棋盤法和濃度梯度法2種方法測定多黏菌素B、利福平分別與氨芐青霉素-舒巴坦或頭孢哌酮-舒巴坦聯合作用時抗耐多藥鮑曼不動桿菌的聯合效應。該研究表明，利福平+氨芐青霉素-舒巴坦的協同性在使用棋盤法時表現為最好，濃度梯度法檢測結果更多地表現出不相關性。該研究結果與之前發表的關于這2種方法協同性的研究結果相比差異沒有明顯統計學意義。雖然棋盤法為判斷聯合藥敏抗菌活性的標準方法，但是濃度梯度法的操作方法簡單、且節省人力，有可能替代棋盤法成為標準方法。但實際上，2種方法檢測協同性的結果不是高度一致，因此在臨床應用中有必要將體外檢測結果結合藥代動力學和藥效學的數據綜合考慮。濃度梯度法與棋盤法的檢測結果相比仍有一定差距，因此還不能作為一種標準的聯合藥敏試驗方法替代棋盤法。

由于抗生素的不規則使用導致耐藥菌的增多，單一藥物控制耐藥菌的能力有限，為了更好地控制感染并防止耐藥菌進一步的發展，聯合藥敏試驗應作為一種指導臨床用藥的有效手段進行推廣。然而，棋盤法作為標準的聯合藥敏方法，操作繁瑣，耗費的人力物力均較大，對于普遍開展還存在一定的困難，盡管其他的聯合藥敏方法也在應運而生，但其檢測效果與棋盤法存在一定差距，仍不能替代棋盤法作為一種標準的檢測方法，迫切需要進一步研究。

二、聯合藥敏檢測在結核分枝桿菌藥敏檢測中的應用

棋盤法作為檢測耐藥菌聯合效應的標準方法，也適用于對耐藥結核分枝桿菌進行聯合藥敏試驗檢測。這種方法對指導耐藥結核病的治療起到了一定作用。近些年來，人們使用棋盤法檢測耐藥結核分枝桿菌聯合藥敏試驗越來越多，并獲得了較好的研究成果。

1992年，Moody[2]提出使用二維棋盤法對2種混合抗結核藥物的抗菌活性加以研究，以哌拉西林和阿米卡星為例，對二維棋盤法評估2種藥物聯合效應的操作方法及注意事項作了詳細介紹。二維棋盤法包括微量稀釋法和大量稀釋法，但是后者的準備工作特別繁瑣，實際工作中并不推薦使用。評價抗結核藥物之間的協同性與其他抗生素一樣，也是以部分抑菌濃度指數(FIC)的大小來評估，通過計算各種濃度作用時2種藥物的FIC值；根據FIC值的大小，還可得出2種藥物作用的最佳濃度[2]。

1995年，Cavalieri等[10]使用Bactec 460 TB系統檢測克拉霉素與抗結核藥物(異煙肼、利福平、乙胺丁醇)混合使用時的聯合抗菌活性，該實驗選取12株耐藥結核分枝桿菌菌株,對各種藥物在0.5～2.0 μg/ml的各種混合濃度進行研究。結果表明克拉霉素與抗結核藥物混合使用時的FIC值均在0.23～0.50之間，即克拉霉素與抗結核藥物聯合使用時具有協同作用。因此克拉霉素與抗結核藥物聯合使用可能是一種抗耐藥結核病的有效治療方案。

1998年，Bergmann等[11]使用大量稀釋棋盤法評估利福平和其他4種藥物(異煙肼、阿米卡星、司帕沙星和克拉霉素)中任一種聯合使用的抗結核活性，通過計算FIC值評估2種藥物之間是否具有協同作用。該研究分別選取5株結核分枝桿菌敏感菌株和5株耐藥菌株(至少耐異煙肼和利福平)，使用Bactec 460 TB系統來進行研究。研究結果顯示，2種藥物聯合使用對敏感菌均表現為協同或不相關，對耐藥菌因菌株不同和聯合的藥物不同而表現為協同、不相關或拮抗。因此,利福平無論與異煙肼還是與二線抗結核藥物聯合使用,是否具有協同性均取決于聯合的藥物及所研究的菌株。任何一組聯合藥物都不會對所有的結核分枝桿菌菌株都表現為協同作用。

2005年，Bhusal等[12]用三維棋盤法對10株結核分枝桿菌菌株進行研究，檢測28種抗結核藥物分別與異煙肼和利福平聯合使用時的殺菌活性。該實驗是在二維棋盤法的基礎上進行，將異煙肼和利福平以文獻[2]所述的二維棋盤法操作方法加入96孔微孔板，再將第三種藥物的某一濃度加入二維棋盤法的每個孔中，每塊微孔板中只加入一種濃度，第三種藥物的濃度分別為其MIC值的1/2、1/4、1/8、1/16、1/32和0。該研究顯示氟喹諾酮類藥物及其他抗結核藥物(克拉霉素)與異煙肼和利福平聯合作用時的抗菌效果較好，為二線抗結核藥物的選擇及使用提供了依據。同時該研究表明異煙肼和利福平聯合作用時，FIC值在0.94～1.19之間，表明2種藥物之間既無協同作用，也無拮抗作用，表現為不相關作用。

2012年，Rey-Jurado等[13]使用三維棋盤法對比標準方案中3種藥物異煙肼-利福平-乙胺丁醇或者氧氟沙星-利福平-乙胺丁醇2種方案的抗結核活性。該研究選取11株敏感菌株和12株耐藥菌株(耐異煙肼和鏈霉素)，每種藥物選取5個濃度，高于MIC值、等于MIC值及分別倍比稀釋MIC值3次的濃度。結果表明，異煙肼-利福平-乙胺丁醇在耐異煙肼菌株表現為協同作用，在對異煙肼敏感的菌株卻不表現協同作用。氧氟沙星-利福平-乙胺丁醇組合方案在對異煙肼敏感和耐藥的菌株均表現出協同作用。該研究表明，3種藥聯合方案對耐藥菌均可表現為協同作用，而且含氧氟沙星的方案表現出更好的協同效果，進一步提示體外評估3種藥物的聯合抗菌活性對于確定新的抗結核方案與評價新藥的聯合抗菌活性是非常重要的。

2013年，Caleffi-Ferracioli 等[14]為評估氟喹諾酮類藥物與常規抗結核藥物聯合使用的抑菌效果，對20株結核分枝桿菌(9株敏感、10株耐藥和標準株H37Rv)在體外進行聯合藥敏檢測，分別使用經典二維棋盤法及在二維棋盤法基礎上使用偶氮間苯四酚(resazurin)作為指示劑的方法來判斷結核分枝桿菌的生長情況。2種方法均顯示乙胺丁醇與左氧氟沙星聯合作用時具有協同作用，異煙肼與左氧氟沙星聯合作用時沒有協同性。通過統計分析證明兩種方法之間差異沒有統計學意義，但是由于比色法操作簡單，對設備及操作人員的要求低，因此這種方法受到越來越多的重視。

2013年，Rey-Jurado等[4]使用三維棋盤法對結核分枝桿菌敏感株和耐藥株進行研究，檢測利奈唑胺-左氧氟沙星-阿米卡星、利奈唑胺-左氧氟沙星-乙胺丁醇及左氧氟沙星-阿米卡星-乙胺丁醇3種方案的抑菌或殺菌活性，并比較這3種方案的抗菌效果與一線抗結核方案異煙肼-利福平-乙胺丁醇抗結核分枝桿菌敏感株的效果。結果顯示任何3種藥物聯合作用時的FIC值均在1.5～3.0之間，即任何3種方案各藥物之間都沒有相關性。且二線抗結核方案和一線抗結核方案顯示同樣的結果。

聯合藥敏試驗研究抗結核藥物的聯合抗菌活性已經歷了20多年的時間，科學家們克服了許多難題，使聯合藥敏試驗的操作方法趨于簡單，評估效果趨于準確，并研究了多種聯合藥敏方法，為臨床提供了各種可靠數據，如新的組合方案及新藥的開發等。但是棋盤法對于敏感結核分枝桿菌的研究較多的表現為不相關性，對耐藥結核分枝桿菌的研究可表現為協同作用或拮抗作用。棋盤法可作為一種標準的聯合藥敏方法評估抗結核藥物聯合使用時的協同性大小，并為臨床抗耐藥結核病藥物的選擇提供依據，但仍需要進一步完善。

三、存在的問題及展望

近幾十年來WHO推薦幾種抗結核藥物聯合使用，可更有效的治療結核病[14]。目前雖然新的抗結核藥物的研發是非常有必要的，但是很少有藥物進入到臨床研發階段[15]。對抗結核藥物進行體外藥敏檢測是制定抗結核方案的第一步[4]。盡管臨床上存在不同的抗結核藥物聯合使用，但是尚無抗結核藥物的體外聯合效應的研究，而這種效應可通過聯合藥敏棋盤法來研究[4]。聯合藥敏棋盤法提供了可量化及可重復的實驗結果，用來評估抗結核化療方案包括二線抗結核藥物組合方案及新開發藥物組合方案的聯合抗菌活性，為結核病尤其是耐藥結核病的治療提供理論依據，從而有助于控制結核病的流行。然而，由于聯合藥敏試驗中交叉藥敏濃度的配制次數是成指數增加的，目前多數體外聯合藥敏的研究只包含2種抗結核藥物，3種或3種以上藥物聯合藥敏實驗的研究報道相對較少[16-19]。由于抗結核化療方案一般包括至少3種藥物，因此，包含3種藥物的聯合藥敏試驗方法更為實用[4]，急需進一步研究。

棋盤法通過計算FIC值的大小判斷藥物之間的協同性，可為聯合用藥的抗菌活性檢測提供準確的結果，已成為聯合藥敏試驗的金標準[20]，可為抗結核化療方案的制定提供實驗室依據。但由于結核分枝桿菌體外生長需時較長，所以該方法相對復雜、費時，研發新的針對結核分枝桿菌的聯合藥敏試驗檢測方法成為迫切需要解決的問題[21]。此外，棋盤法已經對于標準抗結核方案中異煙肼、利福平、乙胺丁醇的聯合作用已被研究，來判斷標準方案中除了吡嗪酰胺之外的3種藥物之間的聯合效應。吡嗪酰胺未被研究是由于其在體外呈酸性[22]。

綜上所述，聯合藥敏試驗主要用于評判抗普通耐藥菌藥物及抗耐藥結核分枝桿菌藥物之間的協同作用，從而指導臨床用藥方案的選擇。該方法在普通細菌感染以及結核病尤其是耐藥結核病聯合藥敏檢測方面已取得了一定的成就，對于臨床選藥也起到一定的作用，但是操作方法繁瑣，評估方法復雜，導致對于聯合效用的評估存在一定誤差，因此還需要更進一步完善，在動物模型和臨床實踐中的評估和應用也需要盡快開展，以驗證其可信度，真正實現其指導臨床用藥的應用價值。

[1] Bhusal Y, Shiohira CM, Yamane N. Determination of in vitro synergy when three antimicrobial agents are combined against Mycobacterium tuberculosis. Int J Antimicrob Agents, 2005, 26(4): 292-297.

[2] Moody JA. Synergism testing: broth microdilution checkerboard and broth macrodilution methods. Washington DC: American Society for Microbiology, 1992：22.

[3] 文亞坤, 曹萌, 鄒琳, 等. 碳青霉烯類抗生素耐藥銅綠假單胞菌的體外聯合藥敏研究. 中國抗生素雜志, 2012, 37(7): 536-538.

[4] Rey-Jurado E, Tudó G, de la Bellacasa JP, et al. In vitro effect of three-drug combinations of antituberculous agents against multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates. Int J Antimicrob Agents, 2013, 41(3): 278-280.

[5] Rosenblatt JE, Stewart PR. Combined activity of sulfamethoxazole, trimethoprim, and polymyxin B against gram-negative bacilli. Antimicrob Agents Chemother, 1974, 6(1): 84-92.

[6] Berenbaum MC. A method for testing for synergy with any number of agents. J Infect Dis, 1978, 137(2): 122-130.

[7] Yu VL, Felegie TP, Yee RB, et al. Synergistic interaction in vitro with use of three antibiotics simultaneously against Pseudomonas maltophilia. J Infect Dis, 1980, 142(4): 602-607.

[8] Yoon J, Urban C, Terzian C, et al. In vitro double and triple synergistic activities of polymyxin B, imipenem, and rifampin against multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother, 2004, 48(3): 753-757.

[9] Cetin ES, Tekeli A, Ozseven AG, et al. Determination of In Vitro Activities of Polymyxin B and Rifampin in Combination with Ampicillin/Sulbactam or Cefoperazone/Sulbactam against Multidrug-Resistant Acinetobacter baumannii by the E-test and Checkerboard Methods. Jpn J Infect Dis, 2013, 66(6): 463-468.

[10] Cavalieri SJ, Biehle JR, Sanders WE Jr. Synergistic activities of clarithromycin and antituberculous drugs against multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 1995, 39(7): 1542-1545.

[11] Bergmann JS, Woods GL. In vitro activity of antimicrobial combinations against clinical isolates of susceptible and resis-tant Mycobacterium tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis, 1998, 2(8): 621-626.

[12] Bhusal Y,Shioshira CM,Yamane N. Determination of in vitro synergy when three antimicrobial agents are combined against Mycobacterium tuberculosis.Int J Antimicrob Agents，2005，26(4):292-297.

[13] Rey-Jurado E, Tudó G, Martínez JA, et al. Synergistic effect of two combinations of antituberculous drugs against Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinb)，2012, 92(3): 260-263.

[14] Caleffi-Ferracioli KR, Maltempe FG, Siqueira VL, et al. Fast detection of drug interaction in Mycobacterium tuberculosis by a checkerboard resazurin method. Tuberculosis (Edinb), 2013, 93(6): 660-663.

[15] Lienhardt C, Raviglione M, Spigelman M, et al. New drugs for the treatment of tuberculosis: needs, challenges, promise,and prospects for the future. J Infect Dis, 2012,205(Suppl 2):S 241-249.

[16] Kaur D, Khuller GK. In vitro, ex-vivo and in vivo activities of ethambutol and sparfloxacin alone and in combination against mycobacteria. Int J Antimicrob Agents, 2001, 17(1): 51-55.

[17] De Logu A, Onnis V, Saddi B, et al. Activity of a new class of isonicotinoylhydrazones used alone and in combination with isoniazid, rifampicin, ethambutol, para-aminosalicylic acid and clofazimine against Mycobacterium tuberculosis. J Antimicrob Chemother, 2002, 49(2): 275-282.

[18] Rodriguez Díaz JC, Ruiz M, Lopez M, et al. Synergic activity of fluoroquinolones and linezolid against Mycobacterium tuberculosis. Int J Antimicrob Agents, 2003, 21(4): 354-356.

[19] Bhusal Y, Shiohira CM, Yamane N. Determination of in vitro synergy when three antimicrobial agents are combined against Mycobacterium tuberculosis. Int J Antimicrob Agents, 2005, 26(4): 292-297.

[20] de Steenwinkel JE, de Knegt GJ, ten Kate MT, et al. Time-kill kinetics of anti-tuberculosis drugs, and emergence of resistance, in relation to metabolic activity of Mycobacterium tuberculosis. J Antimicrob Chemother, 2010, 65(12): 2582-2589.

[21] Sala C, Hartkoorn RC. Tuberculosis drugs: new candidates and how to find more. Future Microbiol, 2011, 6(6): 617-633.

[22] Zhang Y, Mitchison D. The curious characteristics of pyrazinamide: a review. Int J Tuberc Lung Dis, 2003,7(1):6-21.

(本文編輯：王然 薛愛華)

The progress of combined drug susceptibility test withMycobacteriumtuberculosis

ZHANG Lin-lin*, YANG Hua, XIAO He-ping.

*The Department of Clinical Medicine, School of Medicine, Suzhou University, Jiangsu 215123,China

Corresponding author: XIAO He-ping, Email: xiaoheping_sars@163.com

Tuberculosis remains a threat to global pandemic, it becomes more difficult to control TB due to the emergence of multidrug-resistant and extensively drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Preventing the resis-tance to a paticular drug, WHO has recommended the combined modality therapy with several drugs as the main method in the treatment of TB. Individualized treatment plan, based on the drug susceptibility results, should be taken in the treatment of drug-resistant TB. So far, the drug susceptibility test is mostly carried out for monotherapy. However, in some cases, even the single drug susceptibility results are resistant, the combined modality therapy still performances better therapeutic effect,which reminds us that the combination of several drugs used in treatment may enhance its antibacterial activity. At present, because of the severe drug resistance of first-line drugs and the shortcoming of second-line drugs (such as price，toxicity and so on), we urgently need to find a new anti-TB chemotherapy to control the prevalence of drug-resistant. Before creating a new chemistry program, it is important to conduct quantified experiments repeatedly to evaluate the antimicrobial activity of the combined modality therapy.

Mycobacterium tuberculosis； Microbial sensitivity tests

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.01.016

“十二五”國家科技重大專項(2013ZX10003009)

215123 蘇州大學醫學院臨床醫學系(張琳琳)；上海市結核病(肺)重點實驗室 同濟大學附屬上海市肺科醫院結核科(楊華、肖和平)

肖和平，Email:xiaoheping_sars@163.com

2014-11-19)