γ干擾素釋放試驗(yàn)新試劑的臨床應(yīng)用研究

陳雪林 邢俊蓬 馬亮亮 崔嘉 劉宇 黑文明

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·短篇論著·

γ干擾素釋放試驗(yàn)新試劑的臨床應(yīng)用研究

陳雪林 邢俊蓬 馬亮亮 崔嘉 劉宇 黑文明

如何快速、準(zhǔn)確診斷結(jié)核病一直是臨床關(guān)注的問題。近年來，γ干擾素釋放試驗(yàn)(interferon-gamma release assays，IGRAs)作為一種新的輔助診斷結(jié)核分枝桿菌感染的免疫學(xué)方法，已經(jīng)被廣泛認(rèn)可并應(yīng)用于臨床[1]；并且IGRAs對肺外結(jié)核、結(jié)核性胸膜炎的輔助診斷具有較高的敏感度和特異度[1-2]。目前IGRAs檢測試劑有國產(chǎn)化傾向，武漢海吉力生物科技有限公司研制的結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附法)(簡稱“海吉力試劑”)，能夠檢測外周血的γ干擾素水平，與北京萬泰生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌相關(guān)γ-干擾素檢測試劑盒(體外酶聯(lián)免疫法)(簡稱“萬泰試劑”)的檢測原理一致，均選取了卡介苗及大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌沒有的早期分泌抗原靶6(ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)作為結(jié)核分枝桿菌特異性抗原[3]，均可用于結(jié)核分枝桿菌潛伏感染或活動(dòng)性感染的輔助診斷。本研究對海吉力試劑與萬泰試劑在結(jié)核病診斷中的敏感度、特異度、一致率進(jìn)行臨床驗(yàn)證，結(jié)合臨床資料探討IGRAs對結(jié)核病患者的診斷價(jià)值。

對象和方法

1.對象：2013年1—4月在北京老年醫(yī)院結(jié)核門診、感染疾病科、呼吸科、腫瘤科招募研究對象，共入選結(jié)核病患者220例(結(jié)核病組)。其中涂陽或培陽結(jié)核病患者93例(菌陽組)，菌陰結(jié)核病患者127例(菌陰組)；男147例，女73例；年齡15～90歲，中位年齡36.0歲，其中≥60歲的老年患者44例；患者中肺結(jié)核181例(包括糖尿病合并肺結(jié)核患者20例)，結(jié)核性胸膜炎25例，肺外結(jié)核14例。

共入選非結(jié)核肺部疾病患者86例(非結(jié)核肺部疾病組)。其中男56例，女30例；年齡19～96歲，中位年齡72.0歲，其中≥60歲的老年患者59例；患者中肺炎54例，肺癌24例，慢性阻塞性肺疾病8例。

結(jié)核病的診斷標(biāo)準(zhǔn)參見文獻(xiàn)[4]，同時(shí)綜合考慮臨床表現(xiàn)、影像學(xué)、組織病理學(xué)、抗結(jié)核治療效果等，做出明確診斷。本研究獲得我院倫理委員會審核通過，所有患者均簽署知情同意書。

2.方法：每位入選受試者的全血標(biāo)本用海吉力試劑與萬泰試劑進(jìn)行同步檢測。

海吉力試劑檢測步驟：用肝素鋰抗凝采血管抽取靜脈血>4 ml并馬上顛倒混勻3次以上，使抗凝充分；3 h內(nèi)將全血分裝到以下3種管中，每管分裝1 ml，以“N”標(biāo)記本底對照培養(yǎng)管，以“T”標(biāo)記加了結(jié)核特異性抗原ESAT-6、CFP-10的測試培養(yǎng)管，以“P”標(biāo)記加了非特異刺激原植物血球凝集素(PHA)的陽性對照培養(yǎng)管；分裝前需要顛倒混勻3次以上，分裝后輕柔顛倒培養(yǎng)管5次并立刻置于37 ℃培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)(22±2)h后取出，離心收集上清液，然后用Multiskan MK3全自動(dòng)免疫檢測儀(上海賽默飛世爾儀器有限公司生產(chǎn))檢測其中γ干擾素的含量，再按說明書計(jì)算刺激培養(yǎng)系統(tǒng)中升高的γ干擾素的量來判定是否為結(jié)核分枝桿菌感染陽性。結(jié)果判定如下(參照說明書)：本底對照培養(yǎng)管γ干擾素含量值=N、測試培養(yǎng)管γ干擾素含量值=T、陽性對照培養(yǎng)管γ干擾素含量值=P(單位為IU/ml)；N≤8，T-N≥0.35并且≥N/4為陽性；N≤8，P-N≥0.5，T-N<0.35或≥0.35但

萬泰試劑(批號TR20121205)檢測步驟：檢測步驟同上，結(jié)果計(jì)算(參照說明書)和判定的參考值如下：本底對照培養(yǎng)管γ干擾素含量值=N、測試培養(yǎng)管γ干擾素含量值=T、陽性對照培養(yǎng)管γ干擾素含量值=P(單位為pg/ml)；N≤400，T-N≥14并且≥N/4為陽性；N≤400，P-N≥20，T-N<14或≥14但400為不確定。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。一致率檢驗(yàn)采用Kappa檢驗(yàn)，Kappa值≥0.75為一致率高。

結(jié) 果

1. 海吉力試劑與萬泰試劑在結(jié)核病組、菌陽組、菌陰組的敏感度分別為80.9%(178/220)、79.6%(74/93)、81.9%(104/127)和78.2%(172/220)、77.4%(72/93)、78.7%(100/127)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fisher確切概率法，P值分別為0.307、0.727、0.454)；海吉力試劑與萬泰試劑在非結(jié)核肺部疾病組檢測結(jié)果的敏感度分別為27.9%(24/86)、33.7%(29/86)，特異度分別為72.1%(62/86)、66.3%(57/86)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fisher確切概率法，P=0.125)。菌陰組與菌陽組的敏感度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(海吉力試劑：χ2=1.426，P=0.274；萬泰試劑：χ2=0.289，P=0.625)。

2. 海吉力試劑與萬泰試劑的一致率比較：兩種試劑同時(shí)檢測的306例樣本中，均為陽性186例，均為陰性89例，結(jié)果一致率為89.9%(275/306)，Kappa值為0.775，具有很高的一致率。

3. 其他結(jié)果：海吉力試劑在肺結(jié)核、結(jié)核性胸膜炎患者中的敏感度分別為80.7%(146/181)、80.0%(20/25)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.057，P=0.805)；萬泰試劑在肺結(jié)核、結(jié)核性胸膜炎患者中的敏感度分別為77.3%(140/181)、80.0%(20/25)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.207，P=0.314)；兩者在糖尿病合并結(jié)核病患者中的敏感度分別為85.0%(17/20)、80.0%(16/20)，與未合并糖尿病的結(jié)核病患者中的敏感度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(海吉力試劑χ2=2.037，P=0. 152；萬泰試劑χ2=0.671，P=0.439)。海吉力試劑在老年結(jié)核病患者的敏感度為61.4%(27/44)，低于在中青年結(jié)核病患者中的敏感度(84.7%，149/176)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.012，P=0.005)；萬泰試劑在老年結(jié)核病患者中的敏感度為61.4%(27/44)，低于在中青年結(jié)核病患者中的敏感度(81.2%，143/176)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.856，P=0.028)。

討 論

1.γ干擾素釋放試驗(yàn)在結(jié)核病診斷中的現(xiàn)狀：目前IGRAs已有2個(gè)商業(yè)化試劑盒，即用酶聯(lián)免疫吸附法檢測的IFN-γ定量試驗(yàn)(QuantiFERON TB Gold In Tube，QFT GIT)和用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法檢測的T-SPOT.TB試劑盒，主要目的是用于診斷結(jié)核潛伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)，近年來在結(jié)核病臨床診斷中的應(yīng)用越來越廣[5]，對活動(dòng)性結(jié)核病，尤其是肺外結(jié)核(結(jié)核性胸膜炎、淋巴結(jié)結(jié)核、骨關(guān)節(jié)結(jié)核等)也有輔助診斷價(jià)值[1-2，6-7]；但I(xiàn)GRAs檢測結(jié)果受到外周血淋巴細(xì)胞絕對值、病變累及范圍、年齡等因素的影響[8-9]，IGRAs檢測試劑價(jià)格貴，國產(chǎn)IGRAs檢測試劑的應(yīng)用和報(bào)道較少；本研究使用的海吉力試劑與萬泰試劑屬前一種定量試驗(yàn)方法，均為國產(chǎn)試劑。

2.本研究的結(jié)果分析：海吉力試劑、萬泰試劑對結(jié)核病組檢測的敏感度分別為80.9%、78.2%，與結(jié)核病臨床診治進(jìn)展年度報(bào)告(2013年)[5]中“Khalil等研究顯示QFT-GIT診斷活動(dòng)性結(jié)核病的敏感度為80%”的結(jié)論一致；兩種試劑均對菌陽與菌陰結(jié)核病患者檢測的敏感度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但有臨床意義，有助于緩解菌陰結(jié)核病的診斷難題，提示IGRAs對菌陰結(jié)核病的診斷價(jià)值較高，與楊新婷等[8]報(bào)道“γ干擾素釋放試驗(yàn)中IFN-γ分泌量不受菌量負(fù)荷影響”的結(jié)論一致；本研究中兩種試劑對非結(jié)核肺部疾病患者檢測的陽性率均高于國內(nèi)李紅等[10]報(bào)道的“T-SPOT.TB對非結(jié)核肺部疾病患者檢測的陽性率[19.2%(30/156)]”，以此為對照，對結(jié)核病組診斷的特異度稍低于國內(nèi)報(bào)道的“IGRAs診斷活動(dòng)性結(jié)核病的特異度為78.1%～90.4%”[2,6-7,9-10]，可能說明我院(為結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院)非結(jié)核肺部疾病患者的結(jié)核潛伏感染率較高，提示在非結(jié)核肺部疾病患者中IGRAs檢測結(jié)果陰性的排除診斷價(jià)值大于檢測結(jié)果陽性的診斷價(jià)值；海吉力試劑和萬泰試劑均對糖尿病合并結(jié)核病患者檢測的敏感度較好，與未合并糖尿病的結(jié)核病患者的敏感度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值；在老年結(jié)核病患者中，海吉力試劑和萬泰試劑檢測的敏感度均低于在中青年結(jié)核病患者的敏感度，表明IGRAs對老年結(jié)核病患者的臨床診斷價(jià)值相對較低。

綜上所述，本次IGRAs新試劑的臨床研究表明：海吉力試劑與萬泰試劑對活動(dòng)性結(jié)核病診斷的敏感度較高，以非結(jié)核肺部疾病為對照對結(jié)核病診斷的特異度稍低；兩種試劑具有較好的一致性；IGRAs不失為快速、有效診斷各型結(jié)核病的輔助手段，尤其對菌陰結(jié)核病、糖尿病合并結(jié)核病患者的應(yīng)用價(jià)值更高，對老年結(jié)核病患者的診斷價(jià)值相對較低；目前該技術(shù)的國產(chǎn)試劑適宜推廣應(yīng)用。

[1] 葛燕萍，肖和平.γ干擾素釋放試驗(yàn)與結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)輔助檢測肺外結(jié)核病的比較.中國防癆雜志，2014,36(3)：194-197.

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[3] 張立華，靳文香，賈紅彥，等.T-SPOT與結(jié)核菌素試驗(yàn)對結(jié)核病患者的臨床診斷價(jià)值.中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2012,6(14)：4107-4108.

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[5] 中國防癆協(xié)會結(jié)核病臨床專業(yè)委員會.結(jié)核病臨床診治進(jìn)展年度報(bào)告(2013年度).中國防癆雜志，2014,36(8)：714-740.

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[8] 楊新婷，楊揚(yáng)，杜鳳嬌，等.肺結(jié)核患者全血γ干擾素釋放試驗(yàn)影響因素的探討. 中國防癆雜志，2013,35(12)：1007-1012.

[9] 陳雪林，崔嘉，劉宇，等.兩種全血γ-干擾素釋放試驗(yàn)試劑盒在結(jié)核病診斷中的比較研究.中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2013,7(24)：11380-11383.

[10] 李紅，唐神結(jié)，史祥，等.全血γ-干擾素釋放試驗(yàn)對涂陰肺結(jié)核診斷價(jià)值的研究. 中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2012,6(16)：4894-4897.

(本文編輯：郭萌)

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.05.015

100095 北京老年醫(yī)院感染疾病科

陳雪林，Email：chenxuelin.1971@163.com

2014-11-02)