光化學法大鼠腦梗死模型的研究進展

黃 碩,張海林,張樹泉

光化學法大鼠腦梗死模型的研究進展

黃 碩1,張海林2,張樹泉2

在腦梗死的實驗研究中,理想的動物模型,對于研究腦梗死的發病機制及防治措施具有重要意義。目前,用于腦梗死實驗研究的動物主要有鼠、兔、狗、猴等,其中由于大鼠在心腦血管病變方面與人類較為相似,加之品系多、成本低等優點,成為該領域的主要實驗對象。隨著研究的深入,已經形成了多種相對成熟的腦梗死造模方法,包括線栓法、開顱電凝法、微栓子栓塞法、光化學法等。自Watson等[1]1985年通過光化學法建立腦梗死大鼠模型以來,該造模方法由于與人類腦梗死發生機制較為相似,對實驗動物創傷小,模型穩定性好等優點得到了比較廣泛的應用。現綜述光化學法制作大鼠腦梗死模型如下。

1 造模原理及實驗材料的選擇

1.1 造模原理 利用光敏物質在特定波長光作用下產生自由基物質,直接損傷血管內皮細胞,使其產生脂質過氧化物,血小板黏附于血管內皮,激活凝血過程,形成血栓,阻塞血管導致缺血性腦損傷,引起炎癥及壞死。誘發血栓過程中所產生的血管活性物質及神經毒性物質可損害血腦屏障和腦細胞,這與人類腦梗死發生極為相似[2]。

1.2 光敏劑及光源的選擇 四氯四碘熒光素,別名孟加拉玫瑰紅,英文名稱rose Bengal,分子量為1 017.6,最大吸收波長為548 nm,是迄今已知的最強的光敏染料。其照射光源主要有鹵素燈加546 nm濾光片、氪激光器、氙燈輻照系統等[3,4]。有學者報道,手持式激光器(激光筆)價格低廉,其發出的激光波長為532 nm,可作為實驗光源[5]。赤蘚紅B,英文名稱erythrosin B,其最大吸收峰約在520 nm,大鼠最常用劑量(17～ 20)mg/kg,腹腔或靜脈注射,其最常用的光源是波長514.5 nm的氬激光光源。照射時間一般為(2～5) min。光敏Ⅱ,英文名Photofrin II,是一種包括血卟啉醚等多種成分的混合物,其最大吸收峰位于(615～ 635)nm,配合波長632 nm紅色激光照射,可產生含有大量紅細胞和白細胞的血小板性血栓,與人類的腦血栓形成較為相似。

2 常用的大鼠光化學法腦梗死模型

自1985年Waston等成功建立大鼠光化學法腦梗死模型以來,此模型已經發展為4型:大腦皮質終末動脈阻塞模型、環形照射模型、大腦中動脈阻塞模型、頸總動脈阻塞模型。

2.1 大腦皮質終末動脈阻塞模型(Ⅰ型) 該模型是經典的光化學法誘導皮質局灶性腦缺血模型,基本步驟是:首先選定照射部位(一般選在皮質功能區或海馬區),將充分暴露顱骨的大鼠固定在立體定位儀上,尾靜脈或腹腔注射光敏劑,用相應光源進行照射,部位大小可以按照需要進行調整。該模型是早期即可出現血腦屏障開放、嚴重的血管源性腦水腫及微血管血栓形成,因此可用于腦梗死后微血管損傷及血腦屏障改變后的病理生理、生化及抗血小板藥物防治作用的研究。但是此種方法造成的是皮質終末動脈的永久性閉塞,不利于對側支循環建立及缺血再灌注損傷的研究,同時由于缺血半暗帶范圍很狹小且很快消失,亦不利于觀察缺血半暗帶的變化及相關藥物的防治作用。由于該模型自發性高血壓大鼠比正常大鼠產生的梗死范圍大且穩定,因而選擇自發性高血壓大鼠造模更適合抗血栓藥物的研究[6]。

2.2 環形照射模型(Ⅱ型) 此模型的建立方法與Ⅰ型模型基本相同,但該模型照射的光源為環形光斑,使照射皮質產生一個環形的缺血性損傷,中間的環形腦組織因不完全缺血產生一個類似半暗帶的區域[7]。該模型主要用于觀察缺血半暗帶的病理變化及評價各種腦保護防治措施的效果。由于此模型在72 h后還存在自發性的再灌注,因此也可以用于對缺血再灌注損傷及其防治的研究。

2.3 大腦中動脈阻塞模型(即Ⅲ型) 1987年Watson等[8]首先制成光化學大鼠大腦中動脈(MCA)閉塞模型,之后許多學者對該模型進行了改進。基本步驟是經雄性W istar大鼠股靜脈緩慢注入12.5 mg/kg血卟啉衍生物的同時,用波長630 nm 氮氖激光照射左側MCA近側段15 min,手術顯微鏡下觀察白色血栓形成。然后夾閉雙側頸總動脈(CCA)1 h開放使其再通。該方法可使MCA被照射段形成閉塞性血小板血栓,使其供血區形成較大且穩定的梗死灶[9]。

2.4 頸總動脈阻塞模型(Ⅳ型) 該模型是一個多發性腦梗死模型,其基本方法為暴露頸總動脈并結扎同側頸外動脈,注射光敏劑后將光源直射頸總動脈,同時不斷輕微撥動頸總動脈,使產生的血栓栓子隨血流入腦從而產生了多發的腦梗死灶。該方法模擬了人類栓子所致腦梗死,適用于多發性腦梗死及抗血小板集聚藥物的研究。其缺點是所需光照強度和光敏劑劑量大,動物模型長期的死亡率較高,不利于慢性腦缺血研究。

目前在四種模型中,Ⅰ型和Ⅲ型應用較多。如謝志忠等[10]、張光運等[11]應用Ⅰ型模型分別研究了絞股藍總皂苷對腦缺血損傷及環磷酰胺對腦組織缺血再灌注損傷的保護作用;崔建嶺等[12]通過Ⅲ模型進行了靜脈溶栓治療的研究,而楊文清等[13]通過該模型觀察了水蛭提取物對腦梗死的治療作用。

3 檢測指標

3.1 神經功能缺損評分 理想的評分標準應既可以綜合反映神經功能評分,又有較好的可操作性和穩定性。目前在中風臨床前藥物研究中,Bederson評分[14]被國內外學者所公認,引用頻率較高,簡單介紹如下。該評分標準分為四個功能等級:A無神經損傷癥狀為0分;B懸尾實驗不能完全伸展對側前爪為1分;C前肢抵抗對側推力能力下降為2分;D向對側轉圈為3分。一些學者在應用Bede rson評分同時,對其進行了改進,如Menzies評分[15]總分為4分:A,無神經功能損傷,雙前肢對稱向地面伸展(0分);B,對側前肢持續內收(1分),C,對側前肢握力下降(2分);D,輕微刺激大鼠尾巴,向對側轉圈(3分)或者自主持續轉圈(4分)。

3.2 腦組織水腫程度的監測 目前評價腦組織水腫程度的方法主要是腦組織比重梯度柱測定[16]和腦組織含水量測定[17]。

3.3 腦梗死灶體積的測定 腦梗死灶的體積大小直接反映了腦缺血的嚴重程度及預后判斷。目前較為常用的方法是將梗死側的腦組織切片,經氯化四氮唑(TTC)染色,正常組織為紅色,而梗死區為白色,采用圖像采集處理系統軟件測量梗死面積,計算梗死體積[18]。另外,有條件的科研機構,也可以直接行大鼠顱腦MR檢查,在MR機上測量計算梗死灶體積。

3.4 其他 除上述常用指標外,還有一些用于研究藥物作用機制或病理生理過程的指標。例如,凝血因子的監測、炎性因子(TNF-α、IL-6等)的測定、血管內皮因子及其基因表達的監測、神經生長因子的監測等。

4 問題與展望

光化學法大鼠腦梗死模型較好地模擬了人類的卒中發病機制,有很大的發展前景,但在很多方面仍需進一步完善。臨床中腦梗死患者多合并有高血壓病、糖尿病等疾病,并且這些疾病本身作為腦梗死的危險因素,參與了其發病過程,因此建立合并相關疾病的光化學大鼠腦梗死模型,更能接近臨床實踐,有必要開展此類模型的研究。目前的腦梗死模型均不能完全模擬人類卒中發病機制,有自身固有的優缺點,因此應根據研究目的選擇不同的腦梗死模型才能保證研究的科學性。

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R743 R255

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.05.017

1672-1349(2015)05-0610-02

2014-07-29)

(本文編輯 王雅潔)

1山東中醫藥大學2012級碩士研究生(濟南250000);2.泰安市中醫醫院

黃碩,E-mail:shixiaoyehs@163.com