結核分枝桿菌復合群脫氧核糖核酸檢測試劑分析性能評估淺析

劉容枝

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·專論·

結核分枝桿菌復合群脫氧核糖核酸檢測試劑分析性能評估淺析

劉容枝

結核分枝桿菌復合群脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)檢測試劑的分析性能評估資料是該類試劑注冊申報資料的一項重要的技術資料。作者總結分析性能評估資料需要包括的主要項目與相關的技術細節，指導生產企業科學合理地進行試劑研發。

結核分枝桿菌； DNA, 細菌； 試劑盒, 診斷

結核分枝桿菌復合群包括結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、牛結核分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)、非洲分枝桿菌(Mycobacteriumafricanum)、卡內蒂分枝桿菌(Mycobacteriumcanetti)、羊分枝桿菌(Mycobacteriumcaprae)和田鼠分枝桿菌(Mycobacteriummicroti)。在結核分枝桿菌復合群中，除田鼠分枝桿菌對人無致病力外，其他幾種菌均可致病，產生相同的臨床表現和大體相同的對藥物的敏感度譜型。因此，臨床上往往只作結核分枝桿菌復合群的鑒定而無須進行種水平的鑒定[1]。

結核分枝桿菌復合群脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)檢測試劑是指利用PCR核酸檢測技術，以特定的結核分枝桿菌復合群共有的基因序列為檢測目標，對人痰液等呼吸道樣本中的結核分枝桿菌復合群進行體外定性檢測的試劑，用于結核病患者的輔助診斷。

分析性能評估資料是體外診斷試劑注冊申報資料的非常重要的一項技術資料[2]。參考美國食品藥品監督管理局的相關文件[3]，結合審評中對國內外企業有關該部分資料的理解與總結[4-7]，現對結核分枝桿菌復合群DNA檢測試劑的分析性能研究提出如下建議。

最低檢測限

一、最低檢測限的確定

建議使用結核分枝桿菌、BCG(如適用)的梯度稀釋液來確定最低檢測限。每個梯度的稀釋液重復3～5份，每份進行不少于20次的重復檢測，將具有95%陽性檢出率的菌株濃度作為最低檢測限。應明確每份菌株的來源、基因型和表型特性，如來源于美國菌種保藏中心 (American Type Culture Collection，ATCC)等，菌株的基因組中含有多少拷貝的被測靶基因等信息。建議采用鋪板并計數細菌集落形成單位(colony-forming units，CFU)的方法進行菌株濃度的確認。應采用實際鋪板并對細菌集落進行計數的方式來確定細菌集落形成單位，而不是通過推理計算來估計菌株濃度(如麥氏單位)。

實際操作中，建議將已知濃度的菌株與結核分枝桿菌復合群陰性的痰樣本進行混合后，完全按照試劑盒的操作方法對此“制備痰樣本”進行樣本前處理(如液化)、核酸提取擴增等。對結核分枝桿菌復合群陰性痰樣本的確認，應采用培養鑒定、臨床診斷、已上市試劑盒和檢測試劑進行聯合確認。

具體操作如下。(1)液化：在痰液中加入1～2倍體積的4%氫氧化鈉(NaOH)溶液，混勻，室溫下放置20 min，使其充分液化。(2)洗滌：取1 ml液化后痰液至1.5 ml離心管，10 000×g離心10 min，盡可能完全傾倒上清；沉淀用1 ml生理鹽水懸浮，同上離心條件洗滌2次。(3)提取：向含沉淀物的離心管中加入5 μl DNA提取液，混勻，沸水浴10 min，然后冷卻至室溫；10 000×g離心>5 min，吸取上清液作為模板備用。

具體而言，向“菌株與陰性痰液的混合物”中加入1～2倍混合物體積的4%氫氧化鈉溶液，液化、洗滌后提取DNA。

二、最低檢測限的驗證

建議在最低檢測限的菌株濃度對結核分枝桿菌、BCG(如適用)進行至少20次的重復試驗驗證，每種菌株的陽性檢出率應至少為95%。企業應能夠提供用于最低檢測限驗證的各個菌株的來源、表型及濃度等信息。建議在最低檢測限的核酸濃度對上述菌株的核酸進行至少20次的重復試驗驗證，每種菌株的核酸的陽性檢出率應至少為95%。企業應能夠提供用于最低檢測限驗證的各種臨床菌株的核酸的來源及濃度等信息。

分析特異度

一、交叉反應

用于結核分枝桿菌復合群核酸檢測試劑交叉反應驗證的病原體種類主要考慮以下幾方面：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀、采樣部位正常寄生或易并發的其他病原體。包括：非結核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria,NTM)、常見的口腔和呼吸道共生的病原菌等，具體目錄如下。

1.用于交叉反應性研究的其他分枝桿菌(非結核分枝桿菌)：亞洲分枝桿菌(Mycobacteriumasiaticum)、嗜血分枝桿菌(Mycobacteriumhaemophilum)、堪薩斯分枝桿菌(Mycobacteriumkansasii)、瑪爾摩分枝桿菌(Mycobacteriummalmoenes)、海分枝桿菌(Mycobacteriummarinum)、龜分枝桿菌(Mycobacteriumchelonae)、猿猴分枝桿菌(Mycobacteriumsimiae)、偶然分枝桿菌(Mycobacteriumfortuitum)、微黃分枝桿菌(Mycobacteriumflavescens)、土地分枝桿菌(Mycobacteriumterrae)、戈登分枝桿菌(Mycobacteriumgordonae)、施氏分枝桿菌(Mycobacteriumshimodii)、蟾蜍分枝桿菌(Mycobacteriumxenopi)、耐熱分枝桿菌(Mycobacteriumthermoresistible)、鳥分枝桿菌(Mycobacteriumavium)、草分枝桿菌(Mycobacteriumphlei)、胞內分枝桿菌(Mycobacteriumintracellulare)、潰瘍分枝桿菌(Mycobacteriumulcerans)、胃分枝桿菌(Mycobacteriumgastri)、膿腫分枝桿菌(Mycobacteriumabscessus)、瘰疬分枝桿菌(Mycobacteriumscrofulaceum)、恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)、隱藏分枝桿菌(Mycobacteriumcelatum)、日內瓦分枝桿菌(Mycobacteriumgenavense)、產黏液分枝桿菌(Mycobacteriummucogenicum)、次要分枝桿菌(Mycobacteriumtriviale)、蘇加分枝桿菌(Mycobacteriumszulgai)。

2.用于交叉反應研究的其他病原體：肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)、黏膜炎莫拉菌(Mucositismorabacteria)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、大腸埃希菌(EscherichiaColi)、嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila)、肺炎支原體(Mycoplasmapneumonia)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、副百日咳博德特菌(Bordetellaparapertussis)、巴西諾卡菌(Nocardiabrasiliensis)、北京棒桿菌(Corynebacteriumpekinense)、甲型溶血性鏈球菌(Alphahemolyticstreptococcus)、乙型溶血性鏈球菌(Betahemolyticstreptococcus)、沙門菌(Salmonella)、副流感嗜血桿菌(Haemophilusparainfluenzae)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、百日咳博德菌(Bordetellapertussis)和肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia)。

3.建議在病原體感染的醫學相關水平進行交叉反應的驗證：應提供用于交叉反應驗證的病原體的來源、種屬和濃度確認等試驗資料。其中，濃度應是實際計數獲得的濃度，而非理論計算得到的濃度(如麥氏單位或者吸光度值)。實際操作中，建議將已知濃度的菌株與結核分枝桿菌復合群陰性的痰樣本進行混合，并完全按照試劑盒的操作方法對此“痰樣本”進行樣本前處理、核酸提取擴增等。對結核分枝桿菌復合群陰性痰樣本的確認，應采用培養鑒定、臨床診斷、已上市試劑盒和檢測試劑進行聯合確認。

為了確認高濃度的非結核分枝桿菌復合群是否對低濃度的結核分枝桿菌復合群產生干擾，建議將已知濃度的非結核分枝桿菌復合群、結核分枝桿菌以及結核分枝桿菌復合群陰性的痰樣本進行混合，并完全按照試劑盒的操作方法對此“痰樣本”進行樣本前處理、核酸提取擴增等。建議采用如下非結核分枝桿菌復合群檢測該項目：鳥分枝桿菌(Mycobacteriumavium)、胞內分枝桿菌(Mycobacteriumintracellulare)、堪薩斯分枝桿菌(Mycobacteriumkansasii)和瑪爾摩分枝桿菌(Mycobacteriummalmoenes)。

二、干擾物質

潛在的干擾物質主要包括：內源性物質(如：血液、黏液或人細胞)；外源性物質(鼻用藥物、咽喉用藥物，以及口服藥物)和結核病治療中常使用的藥物。建議使用醫學相關水平的干擾物濃度進行驗證。另外，建議申請人在每種干擾物質的潛在最大濃度(最差條件)條件下進行評價。對于常見藥物干擾試驗，建議參照相應藥物藥代動力學研究確定的治療藥物濃度添加相應藥物進行干擾驗證。建議在結核分枝桿菌或牛結核分枝桿菌的最低檢測限濃度水平對每種干擾物質的影響進行研究。

建議用于干擾研究的物質目錄如下：異煙肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、利福平、卡那霉素、鏈霉素、卷曲霉素、丁胺卡那霉素、人細胞、過敏性癥狀緩解藥物、血液、口服麻醉劑和鎮痛劑、抗生素、抗病毒藥、鼻腔噴霧劑或滴鼻劑和鼻腔糖皮質激素。

精 密 度

測量精密度的評價方法并無統一的標準可依，可根據不同產品特征或企業的研究習慣進行，前提是必須保證研究的科學合理性。具體實驗方法可以參考國內有關體外診斷產品性能評估的文件進行。企業應對每項精密度指標的評價標準做出合理要求，如標準差或變異系數的范圍等。針對本類產品的精密度評價，主要包括以下要求：(1)對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，除檢測試劑(包括提取組分和PCR組分)本身的影響外，還應對PCR分析儀、操作者、地點等要素進行相關的驗證。(2)合理的精密度評價周期，例如：為期至少12 d的檢測，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測，從而對批內/批間、日內/日間，以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。如有條件，申請人應選擇不同的實驗室進行重復實驗，以對室間精密度進行評價。(3)建議將“結核分枝桿菌菌株與臨床陰性痰樣本混合物”作為樣本，在以下3個濃度水平進行驗證，具體方法可參考本指導原則的“最低檢測限的確定”部分內容：①陰性樣本：不含分析物的樣本，陰性檢出率應為100%(檢測次數≥20)。②弱陽性樣本：待測物濃度略高于試劑盒的最低檢測限，陽性檢出率應高于95%(檢測次數≥20)。③中等陽性樣本：待測物濃度約為最低檢測限的2倍或3倍，陽性檢出率為100%(檢測次數≥20)。

反應性(包容性)

應證明檢測試劑可以檢測代表世界不同基因多態性的結核分枝桿菌復合群菌株。應采用略高于最低檢出限濃度的結核分枝桿菌復合群菌株進行研究。應能夠提供各個菌株的來源、菌株特性及濃度確認試驗等信息。應采用權威的科學機構認可的標準參考方法：如結核分枝桿菌多位點的數目可變串聯重復序列(mycobacterial interspersed repetitive unit-variable number of tandem repeat,MIRU-VNTR)；間隔區寡聚核苷酸分型技術(Spoligotyping)確認菌株特性。需提交科學文獻，以證明所有采用的菌株含有目的靶基因。

對于某些難于培養或者因為生物安全性原因無法培養的菌株，可采用菌株的核酸提取樣本進行包容性的驗證。

[1] 馬玙，朱莉貞，潘毓萱. 結核病．北京：人民衛生出版社，2006.

[2] 國家食品藥品監督管理總局．體外診斷試劑注冊管理辦法 (國家食品藥品監督管理總局令第5號).2014-07-30.

[3] U.S. Food and Drug Administration. Class Ⅱ special controls guideline: nucleic acid-based in vitro diagnostic devices for the detection ofMycobacteriumtuberculosiscomplex in respiratory specimens—Guideline for Industry and Food and Drug Administration Staff[S/OL].(2014-05-30)[2014-12-15].http://www.fda.gov/medicaldevices/deviceregulationandguidance/guidancedocuments/ucm357617.htm.

[4] 高詩會，趙英偉，胡忠義，等. 鑒別結核分枝桿菌復合群的新型核酸擴增檢測靶標評價. 中華結核和呼吸雜志,2012,35(12)：907-910.

[5] Bloemberg GV，Voit A，Ritter C， et al. Evaluation of Cobas TaqMan MTB for direct detection of theMycobacteriumtuberculosisComplex in comparison with Cobas Amplicor MTB. J Clin Microbiol，2013，51(7)：2112-2117.

[6] Lu PL, Lin YC, Yang YC，et al. Evaluation of a membrane array for detection ofMycobacteriumtuberculosiscomplex and nontuberculous mycobacteria in positive liquid cultures. Diagn Microbiol Infect Dis，2013,75(4):337-341.

[7] Hwang SM, Lim MS, Hong YJ,et al. Simultaneous detection ofMycobacteriumtuberculosiscomplex and nontuberculous mycobacteria in respiratory specimens. Tuberculosis (Edinb)，2013,93(6):642-646.

(本文編輯：薛愛華)

The analytic performance studies ofMycobacteriumtuberculosisComplex DNA detection reagents

LIURong-zhi.

CenterforMedicalDeviceEvaluation，CFDA，Beijing100044,ChinaCorrespondingauthor:LIURong-zhi,Email:liurz@cmde.org.cn

The material of the analytic performance studies ofMycobacteriumtuberculosisComplex DNA detection reagents is an important technical document of the application materials for reagent registration. The main aim of this paper is to summarize the main projects and related technical details of analytic performance evaluation studies in order to guide manufactures to conduct research and development of reagents scientifically and rationally.

Mycobacteriumtuberculosis; DNA, bacterial； Reagent kits, diagnostic

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.03.018

100044 北京，國家食品藥品監督管理總局醫療器械技術審評中心

劉容枝，Email: liurz@cmde.org.cn

2014-04-14)