癲狂夢醒湯對兔動脈粥樣硬化血管基質金屬蛋白酶－9表達的影響

韓鳳麗，于銘權

基質金屬蛋白酶－9（MMP－9）能夠分解血管平滑肌細胞（VSMC）基膜基質，將SMC 從基膜中釋放出來，從而引起VSMC 的移行，在動脈粥樣硬化（AS）發生和發展過程中起著十分重要的作用［1］。對AS 來說，血管內皮細胞的損傷及血脂代謝異常是其發生的重要始動因素。本實驗通過喂飼高脂飼料的方法，建立兔AS模型，應用癲狂夢醒湯進行干預治療，觀察其對動脈內膜厚度、MMP－9表達的影響，以期為癲狂夢醒湯抗AS提供進一步的理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物及飼料 健康日本大耳白兔32只，均為雄性，體重（2～2.5）kg（遼寧醫學院實驗動物中心提供）。高脂飼料：1%膽固醇，8%熟豬油和91%的普通飼料。

1.2 藥物、試劑、儀器 癲狂夢醒湯方劑由遼寧醫學院附屬一院中藥局提供。兔抗人MMP－9多克隆抗體（上海太陽生物有限公司），膽固醇粉（安徽科寶生物工程有限公司）。CIAS－1000細胞圖像分析系統（北京大恒圖像視覺有限公司）、LEICA－RM－2135石蠟切片機（德國）。

1.3 方法

1.3.1 藥物（癲狂夢醒湯方）制作 原方藥物：桃仁24g，柴胡9g，香附6g，木通9g，赤芍9g，半夏6g，腹皮9g，青皮6g，陳皮9g，桑皮9g，蘇子12g，甘草15g。在藥學實驗室浸泡、煎煮、去渣，每付中藥濃縮至100mL，濃度為1.2g／mL（含生藥量）。根據人體－家兔體表面積比值法換算家兔的每日用藥量［2］：低劑量組3.1mL／（kg·d）相當于含生藥量3.8g／（kg·d），高 劑量組4.7mL／（kg·d）相當于含生藥量5.7 g／（kg·d）。中藥高劑量為臨床上每日1劑中藥為標準，中藥低劑量為臨床上每1.5 日一劑中藥為標準。4℃冰箱冷藏保存備用。

1.3.2 分組

1.3.2.1 試驗分組 日本大耳白兔單籠飼養，室溫20℃～22℃，相對濕度為50%～60%，自由飲食水。經適應性喂養1周后開始試驗：遵循隨機原則，將動物分成4組（A 空白對照組、B 模型組、C 癲狂夢醒湯低劑量組、D 癲狂夢醒湯高劑量組），每組8只。

1.3.2.2 模型制作［3］實驗開始后，空白對照組繼續喂飼普通飼料140（g·d）只＋蒸餾水5 ml／kg灌胃；模型組開始喂飼高脂飼料140g／d＋蒸餾水5 ml／kg灌胃；低劑量癲狂夢醒湯組喂飼高脂飼料140g／d＋癲方3.1mL／（kg·d）＋蒸餾水1.9mL／kg灌胃；高劑量癲狂夢醒湯組喂飼高脂飼料140g／d＋癲方4.7mL／（kg·d）＋蒸餾水0.3 mL／kg灌胃；自由飲水，喂養至第12周末。

1.3.3 標本留取 實驗動物于第12周末采用頸動脈割傷法處死。迅速剖開腹腔，分離腹主動脈，剝除外膜結締組織及脂肪，取1cm 動脈血管，沖凈，放入4%多聚甲醛溶液中固定，用于HE染色及免疫組化檢測。

1.3.4 病理形態學 將兔主動脈標本于4%中性甲醛溶液固定24h之后，自來水沖洗4h～6h，逐級脫水、透明、浸蠟、包埋制成蠟塊，用石蠟切片機進行連續切片厚度5μm，于45℃溫水中展片，分別用普通玻片和多聚賴氨酸防脫玻片，撈片后置于56℃溫箱中干燥2h～3h，用于HE 染色及免疫組化染色。每一標本取3張切片（普通玻片）作HE 染色；每一標本取3張切片（防脫玻片）作免疫組化染色，均按試劑盒步驟進行操作，免疫組化以細胞漿染色為主，測定其平均灰度值。

1.3.5 統計學處理 應用SPSS 13.0統計軟件分析，計量資料以均數±標準差表示，4組間比較采用單因素方差分析（ANVOA），組間兩兩比較用LSD（方差齊）或DunnettT3（方差不齊）法進行顯著性檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組內膜厚度測定 光鏡下測定，正常組內膜厚度5.03μm±0.80μm，模型組269.07μm±37.42 μm，中藥低劑量組72.10μm±6.39μm，中藥高劑量組43.50μm±5.39μm。癲狂夢醒湯組內膜厚度明顯低于模型組（P＜0.01）；高劑量癲狂夢醒湯組內膜厚度低于低劑量癲狂夢醒湯組（P＜0.05）。

2.2 對MMP－9蛋白表達的影響 免疫組化示：棕色反應物位于胞漿。正常對照組血管壁表達的少；模型組表達明顯增多，內膜靠近中膜處尤甚，呈棕黃色或棕褐色，融合成片，與正常對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，癲狂夢醒湯組表達明顯減輕（P＜0.01）；與低劑量癲狂夢醒湯組比較，高劑量癲狂夢醒湯組表達降低（P＜0.01）。灰度值；正常組13.32±3.85，模型組74.58±6.78，中藥低劑量組45.74±6.51，中藥高劑量組33.52±3.64。

3 討 論

中醫并沒有AS一詞，中醫將AS形成的首要因素高脂血癥等歸屬為痰濁，將血液的高凝狀態、血管壁受損、脂斑形成等視為血瘀。由于臟腑功能失調，氣、血、津液運行、代謝障礙，導致痰濁內生，無形之痰濁留而不去，致血行不暢，瘀血阻滯，痰瘀交阻，這種病理狀態持續發展下去，痰借血體，血借痰凝，痰瘀互結，著于血脈，血脈上凝著痰瘀結塊使脈管本身受損，局部氣血的運行和溫煦受阻，日久膠結不解，凝之愈堅，這種痰濁瘀血相凝之結塊即是AS斑塊［4］。近年來在大量的臨床及實驗研究中，眾多醫家采用活血化痰中藥防治AS，均取得了良好的治療效果，也進一步證實了痰瘀互結是AS的主要病理機制。痰瘀互結是AS的基本病機，那么選用化痰降濁、活血化瘀法則是治療AS的關鍵之所在［5］。因此，選擇名方癲狂夢醒湯進行研究。方中桃仁、赤芍活血化瘀；柴胡、香附、青皮、陳皮、半夏理氣化痰；蘇子、桑皮、腹皮降氣化痰；木通通利血脈；甘草調和諸藥。諸藥相合共奏豁痰化瘀利竅之功。

MMP 是降解細胞外基質的主要酶類，可為SMC從中 膜 遷 移 至 內 膜 掃 清 道 路［6］。其 中MMP－9 是MMP家族中的重要成員，主要功能是降解Ⅳ型膠原和彈力纖維，在基質降解、VSMC 遷移、AS 形成以及促進斑塊破裂上起重要作用［7］。另外有研究表明，MMP－9可通過激活肝素酶參與SMC 從收縮型向合成型轉換的過程［8］。

本實驗觀察到，模型組MMP－9蛋白表達較正常對照組顯著增高，內膜靠近中膜處尤甚，呈棕黃色或棕褐色，融合成片，主動脈內膜明顯增厚，提示在AS 中MMP－9蛋白表達顯著增高；與模型組比較，癲狂夢醒湯可呈劑量依賴性的降低MMP－9表達水平，減輕動脈內膜增厚，提示癲狂夢醒湯可能通過抑制SMC從中膜向內膜下遷移，進而抑制AS形成。此結果與以往研究的系統給予MMP－9抑制劑［9］，早期可抑制AS形成的結果相同。

癲狂夢醒湯能夠通過降低MMP－9的蛋白表達，減輕主動脈內膜增厚，而起到防治AS的作用。表明癲狂夢醒湯抗AS療效可靠，為臨床應用癲狂夢醒湯防止AS提供理論依據。然而AS的病理機制是多方面的，癲狂夢醒湯是否也可以通過其他途徑和環節來達到防治AS的作用，尚有待于進一步研究。

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