禾谷類花粉培養的生物學基礎研究進展

戴 力，王學華

（湖南農業大學農學院，長沙　410128）

禾谷類花粉培養的生物學基礎研究進展

戴 力，王學華*

（湖南農業大學農學院，長沙410128）

從植物生理代謝的角度總結禾谷類花粉培養中一系列過程的生理代謝機制，同時探討了小孢子脫分化和愈傷組織形成、分化及轉化等幾個關鍵過程的生理學或細胞學機制。對該領域當前面臨的問題和未來發展的方向進行了總結和展望。

禾谷類作物；花粉培養；脫分化；愈傷組織；生理生化機制

由于在育種實踐和基因工程操作等方面存在巨大優勢，植物花藥、游離花粉（小孢子）培養獲得單倍體植株的技術自20世紀六七十年代開始備受關注。特別是在當今追求高效的商業化育種中，其快速純合、大大縮短育種周期以及選擇效率高的重要特性便顯得尤為突出。游離花粉培養可生產大量單倍體（Haploid）和加倍單倍體（Doubled Haploid，DH群體），進一步獲得純系，為外源基因的導入提供良好的受體；而DH群體又可為形態發生學、遺傳學和發育分子生物學等基礎研究提供遺傳背景多樣且穩定的材料。除此之外，花粉培養還可作為細胞的分裂誘導和全能性、花粉發育途徑轉換及其調控等研究的理想實驗體系［1，2］，促進這些方面理論研究的發展。因此，花粉培養理論與技術研究非常必要。

就其本質而言，花粉培養其實就是特殊（單倍體）單細胞的培養，是具有一定分化程度的單倍體花粉細胞經過脫分化和再分化形成完整的單倍體花粉植株的過程。它相對于花藥培養技術來說，具有不可替代的優勢［3，4］。因此，盡管花粉培養比花藥培養的技術難度更大，然而近年來人們對它的研究卻并沒有減少。花粉細胞脫分化和再分化的實質就是基因在一定環境條件下的選擇性表達，即細胞全能性的表現。這從理論上說明各種基因型的花粉細胞在一定的內外條件下都能夠通過花粉培養得到花粉植株。當前實踐中仍有較多植物或品種未培養獲得花粉植株或者誘導率很低，其可能的原因是還未找到與其基因型相配套的最適培養條件。對于不同作物或同一作物不同品種的花粉，其培養條件的適宜性可能主要取決于花粉本身及在培養過程中的遺傳和生理生化特性。其中，生理生化特性既是遺傳與表型之間的重要紐帶，又對實踐性研究與生產具有重要的理論指導作用。研究花粉培養的生理生化機制，首先要了解其生物學基礎。

禾谷類作物作為全球主要的糧食作物，隨著世界人口的增長和農業生產面臨耕地面積減少、全球氣候變化等挑戰，對其進行特異性的遺傳改良與育種并加快優良品種育成速度愈發重要。游離花粉培養技術是達到這一目的的一條重要途徑。隨著生物技術的不斷發展，近年來國內外在該培養技術方面的研究取得了較大進步。為此，筆者擬綜述水稻、玉米、小麥、大麥等主要禾谷類作物花粉培養的生物學基礎及其過程中的生理生化和遺傳機制，以期有助于禾谷類作物花粉培養技術的進一步發展。

1　花粉細胞的類型及發育途徑

在高等植物花器官中，花粉母細胞經兩次減數分裂后形成小孢子（microspore），再分裂形成生殖細胞和營養細胞后即為雄配子體。在花粉培養中通常將小孢子和雄配子體統稱為花粉（pollen）。根據花粉細胞中核數目的多少可將其發育過程依次分為:單核早期、中期和晚期及第一次核有絲分裂期、雙核期、第二次有絲分裂期和花粉成熟期等幾個階段。小孢子有廣義和狹義之分。狹義的小孢子包括四分體解體到第一次核有絲分裂時期的細胞，廣義的小孢子包括雙核期的花粉，即通常花粉培養中所說的小孢子［5］。

王志武等［6］研究發現，大麥小孢子群體中存在有活力和無活力（衰敗）小孢子共存的現象，被稱為花粉二態性或二型性（Pollen dimorphism）。這兩類小孢子最早出現于單核中晚期（ML）；區別較明顯:前者直徑隨發育推進而漸增，在普通光源下，呈現出直徑大、細胞質豐富和外形近圓形；后者從單核晚期到成熟期之間細胞大小增長十分緩慢，直徑明顯小于前者，胞質缺乏，染色較淺，外壁皺縮。Ming T Chang于1989年在玉米中也進行了類似的報導。二態性現象很好地解釋了密度梯度離心處理對小孢子離體培養的重要作用——對新取材的或經一定前處理后的花粉進行離心純化，可以提高活力小孢子在接種小孢子中的比例，從而提高花粉培養的效率和遺傳轉化率。

根據花粉發育途徑的不同或在離體培養中分裂能力的有無，活力小孢子可分為胚性和非胚性兩種。小孢子的發育可塑性很大，可因內在生理及外界環境的變化而朝不同方向發育。總的來說，共有三種可能發育途徑［7］:①（雄）配子體發育途徑。小孢子發育的一般途徑——發展得到雄配子體，此類小孢子在離體培養中不能分裂形成多細胞花粉（multicellular pollen），通常培養一段時間后便退化死亡，因此被稱為非胚性花粉。②孢子體發育途徑。又稱“雄核發育途徑”，發育形成再生單倍性孢子體植株。這類小孢子因能在培養中分裂形成多細胞花粉并進一步分裂分化出單倍體植株而被稱為胚性花粉。③雌配子體發育途徑。小孢子發育出類似雌配子的構造，轉換為雌性配子體的途徑，這種途徑只在極其少見的特殊情況下出現，因此常被忽略。胚性小孢子較非胚性小孢子體積增大，具有中央大液泡和清晰的細胞質［8］，在細胞質中出現無細胞器區域，淀粉粒和脂質體數量和大小急劇下降，且核糖體和細胞器總量下降［9，10］；表現為細胞質脫分化程度增大，有研究者稱之為細胞質重組，并認為它與胚胎誘導潛力有關［11］。

Clément等［10］報道認為，小孢子早在減數分裂期便已開始發生細胞質重組。在真核細胞中，已知的可引起細胞質重組的路徑有兩種:泛素-26S蛋白酶系統——短命和長命分子退化的主要細胞途徑；細胞的自我吞噬作用——細胞器通過溶酶體降解和再生的主要細胞內機制。盡管這些都是發育調節途徑，但當受到脅迫時也能被激活，比如饑餓、熱處理和低溫等。減數分裂期間的自我吞噬作用造成了整個細胞生理學狀態的不穩定，這可能將賦予小孢子在預處理期間伴隨外界刺激轉換到孢子體發育途徑的能力［10］。如何依據兩組小孢子——活力小孢子與非活力小孢子、胚性小孢子和非胚性小孢子——在形態學、細胞學、生理學及發育學等方面的特征差異，發現和發明出能夠高效快捷地將之彼此篩選分離的指標和方法，以提高活力和胚性小孢子在外植體小孢子中所占的比率，進一步增大胚胎誘導率，還有待于更多的研究去探索。

花粉培養即通過人工培養使花粉經孢子體途徑獲得單倍體再生器官或植株，用于基礎科學研究和育種實踐。孢子體發育分為兩個階段［7］。

第一階段，小孢子經過幾次有絲分裂后形成多核花粉（或多細胞花粉）。根據啟動雄核發育時的細胞分裂方式不同，該階段又有4種主要的發育途徑［3］:①A-V途徑。單核小孢子進行不均等分裂，得到大小不等的兩個細胞，之后大細胞持續分裂，最終發育為單倍體植株，即營養細胞；而小細胞停止分裂或分裂一兩次后退化，即生殖細胞。這種發育方式在高等植物中較為常見，如大麥、小麥和黑小麥等的雄核發育均依此進行。②A-G途徑。單核小孢子不均等分裂，所得的生殖細胞保持不斷分裂，最終發育成為單倍體植株，而營養細胞停止分裂或僅分裂到有限程度即退化。此方式較為少見。以上二者統稱“不等分裂途徑”。③B途徑。亦稱“均等分裂途徑”。此途徑中小孢子進行均等分裂，得到的營養細胞和生殖細胞大小相同，且二者繼續同時分裂共同形成單倍體植株。甘藍型油菜的雄核發育便依此方式發生。④C途徑。小孢子營養核與生殖核不獨立分裂，而在同一紡錘體上同時分裂與融合，產生二倍體或非單倍體胚。此外，還有一些小孢子通過重復游離核分裂而進行發育，但游離核的前途如何尚不清楚。

第二階段，多核花粉繼續分裂分化發育成為單倍體植株。根據發育方式不同，此階段又有兩種可能的發育途徑——胚狀體途徑（如曼陀羅）和器官發生途徑（先形成愈傷組織，再分化產生根、芽和完整植株，如水稻）。研究發現［12］，正確有效的人為調控可使兩途徑相互轉變，特別是外源激素的調控，作用明顯。同時二者各有特點:器官發生途徑易發生染色體變異，但其中自行發生的染色體增倍過程能夠使得二倍純合子植株大量形成，從而省去了人工使用秋水仙素誘導加倍的過程，而且二倍體幼苗生活能力強，更容易成活；胚狀體途徑細胞較穩定，變異較少。因此，人們多希望誘導獲得胚狀體。至于禾谷類植物，常傾向于以器官發生的途徑再生植株。

孢子體途徑為何會存在？對此，鮮有討論。Horner與Mott于1980年報道，煙草單倍體植株是由非典型小孢子產生，此類小孢子易重復分裂——即僅某些特殊小孢子亞群才有可能誘發孤雄生殖，而正常小孢子可能不行。Heberle-Bors在1985年報道，用能引起植株雄性不育的殺雄劑和殺配子劑（乙烯利、生長素和抗赤霉素化合物）處理供體植株會增加胚性花粉量。離體培養的胚性花粉有可能就是在生長過程中因各種自然或人為因素而發生雄性不育的花粉。當然，這個觀點有待于直接的試驗驗證。同時，花培時對供體植株及外植體進行一定逆境處理（如低溫、高溫、高滲透壓等），可提高花粉植株誘導率，即可促進孢子體途徑表達。花粉孢子體發育很有可能是極少部分特異小孢子在一定外界環境的刺激下而發生的一種適應性表達，即當受到一定環境條件的影響時小孢子不能通過正常的配子體途徑延續后代，傳遞遺傳物質，此時便改變內部生理、結構和遺傳機制，選擇通過孢子體途徑努力延續自身遺傳基因。這種適應性表達在離體和非離體條件下均能發生，其表現被發現與否取決于是否遇上適宜繼續生長發育的條件。非離體條件下特異小孢子可能受到體細胞或其他正常小孢子的干擾難以進一步生長發育而退化。

另外，王憲曾［13］和加藤幸雄等［14］報道，花粉細胞中內含物豐富，主要包括植物激素、糖類和脂類、維他命類及氨基酸等等。花粉中的游離氨基酸含量與花粉的育性、分類及生長緊密聯系。花粉的化學組成和貯藏物的種類及數量同時受到基因型和環境因素的影響，即其存在基因型差異。對于碳水化合物和脂類，甚至存在植株間差異。這可能與局部環境差異有關，如玉米花粉中淀粉含量在品種之間存在著12%～30%的差異；在弱光下，成熟花粉的碳水化合物含量變少［14］。據王兆龍1998年報道，同一玉米雄穗花序上，小穗中第1穎花較第2穎花發育及物質累積要早且快，開花時花藥鮮、干重均略高。王志武等［6］在大麥中也發現，同一時期內同一穗中可能擁有3～4種處于不同發育階段的花粉，其中中間小穗的花粉發育較兩邊的要早。還有研究報道，不同花粉細胞中滲透壓大小也不同［15］，這可能與化學成分及其數量不同有關。花粉粒的充實程度也可能與花粉植物胚狀體的誘導有直接關系。饑餓作用中小孢子內的糖類代謝似乎可以佐證。看來，因少淀粉或無淀粉而引起的花粉敗育（包括典敗、圓敗和染敗）可能是一種天然的饑餓作用，會造成不育花粉分解自身內部營養物質和組成結構以存活。伴隨著花粉中的營養成分和結構物質分解，一些處在雙核中期的花粉細胞進入孢子體發育途徑［16］。只是沒有外部營養供應時，發生了發育途徑轉變的小孢子便會死亡。因此，不育花粉是否更易誘導單雄生殖，值得進一步研究證明。

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綜上所述可見，對于相同品種的不同個體，同一個體（花序）上的不同小穗，乃至同一小穗中的不同花藥，可能由于局部生長環境、植株花期和物質分配的不同造成其化學組成、營養條件及細胞滲透勢等的不同，從而進一步導致其花粉群體內個體生理狀態、細胞周期及發育狀況的差異。特定品種花粉進入孢子體發育途徑的自身條件與外界條件要求在理論上應是一定的。因此，這便造成同一批花粉內部不同個體間誘導結果的差異。在進行實驗取材時，除了選擇合適發育時期的花粉，還要特別注意花粉來源部位的適宜性和統一性，最好將供體材料培養于可控的人工氣候室中，以便調控并盡量統一供體植株的生長環境，以產生一定規模的同質花粉群體供培養。

以此觀之，外植體預處理或預培養能夠在一定程度上提高花粉培養的誘導率的現象似乎也預示著同一品種花粉異質性的可同化性，即通過一定的調控處理，使得處于不同發育時期不同營養狀態和內源激素水平的花粉細胞達到相同或相近的狀態。Hu和Kasha 1999年研究發現，小孢子在預處理期間經歷的脅迫處理造成了一種細胞分裂周期的整體協調。孟金陵［4］也認為，高溫可以使小孢子發育同步化，增加處于發育周期中誘導敏感階段的小孢子數。這頗類似于作物生產中種子引發時生理狀態（如損傷程度、發芽活力等）不同的種子粒之間的同步化過程，而其目的是為了達到齊苗壯苗的效果。因此，花粉細胞異質性的同化調控處理方法成為提高花粉培養誘導率的一個可能的重要突破口。

2　花粉培養關鍵環節及生理機制

花粉離體培養是人工誘導小孢子發育途徑發生轉變，由配子體途徑轉向孢子體途徑，并為發育轉變后的小孢子提供一定的繼續生長發育的條件，使之通過器官再生或胚狀體途徑形成完整的單倍體或加倍單倍體植株的過程。其中，發育途徑的轉變即花粉細胞脫分化過程和繼續生長發育條件是花粉培養成功的關鍵。對于小孢子的脫分化，有人認為其只需離體條件即可發生，也有人認為其需要一定的特殊條件誘導，如各種預處理和外源激素作用。脫分化后的小孢子一部分會停止增殖或生長分裂到一定程度后停止生長而死亡，只有少部分通過四種可能的發育途徑（A-V、A-G、B或C途徑）繼續分裂增殖，形成多核花粉，隨后再進一步生長發育成胚狀體或愈傷組織；生成的愈傷組織中有一部分能夠繼續生長分化為完整的植株，這一部分稱為胚性愈傷組織，另外一部分生長會發生停滯，無法獲得植株，則被稱為非胚性愈傷組織。不過，在一定的條件下兩種愈傷組織之間可以相互轉換。因此，胚性愈傷組織的誘導與調控是花粉培養的另一個關鍵，重點在于提供合適的激素、碳源、氮源以及培養環境等繼續生長發育條件。

從分子水平上看，花粉脫分化的實質就是一定內外條件下細胞分裂周期調控基因的選擇性表達，是受到細胞內外信號刺激的成熟細胞在細胞分裂周期調控基因的指導下由細胞分裂停止狀態重新進入分裂周期的現象。細胞分裂周期分為G1期（DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（DNA合成后期）和M期（分裂期）。G1期為特別重要的周期調節階段，因為在這一階段中，大部分細胞面臨要么持續分裂，要么退出細胞周期的局面。在生長條件差或存在來自其他細胞的抑制信號的情況下，細胞有可能在G1期暫停更長的時間，甚至可能進入到長期的非分裂狀態（G0期）。由G0期重新回到G1期是花粉細胞脫分化的重要標志。

負責細胞周期事件的大量蛋白裝置于細胞周期調控系統的嚴密控制下，此系統的核心成分是一群被稱為周期蛋白依賴激酶（cyclin-dependent Kinnses，CdK）的酶家族。CdKs催化來自 ATP的磷酸基團共價結合到蛋白底物上，即發生磷酸化，使得底物的酶活性或與其他蛋白的相互作用發生改變。CdK活性隨細胞周期進程上升或下降，使細胞周期裝置組分的磷酸化水平發生周期性變化，從而啟動細胞周期事件［17］。

關于雄配子體的正常形成途徑，Borg等［18］對雄性生殖細胞系特化及其保持的作用模式進行了設想:PMI（減數第一次分裂）階段的不對稱分裂形成了兩個在形態和發育命運上完全不同的子代細胞（生殖細胞與營養細胞）。細胞質分裂保證了子代細胞中不同細胞命運決定子的分配。PMI階段后，在生殖細胞和營養細胞中出現細胞分裂周期抑制因子KRP6和KRP7。FBL17在生殖細胞中的短暫表達使這些細胞分裂周期抑制因子（KRP6／7）降解，從而激活CDKA，生殖細胞進入S期。一旦完成S期，激活的G2／M期調節因子即與CDKA活性偶聯（G2／M期調節因子激活依賴于DUO1），從而促進生殖細胞通過G2／M期的控制點進行有絲分裂，在有關因子的作用下發育成精細胞。營養細胞不表達FBL17，因此其CDKA活性被持續高表達水平的KRP6／7所抑制而無法進入細胞分裂周期［19］。據此可以推測，大麥、小麥等禾谷類作物孢子體發育途徑中的A-V途徑可能與FBL17或其類似基因在營養細胞中的表達和在生殖細胞中的受抑制有關。

禾谷類花粉小孢子細胞重新進入細胞分裂周期實現脫分化后，細胞不斷有絲分裂，通常形成愈傷組織，一定誘導條件下也能形成胚狀體。培養誘導形成的愈傷組織多種多樣，對于其分類也有較多不同的意見，通常將其分為胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織兩種:非胚性愈傷組織呈白色，質地松軟，粘稠或水漬狀，無繼代和分化能力；胚性愈傷組織呈鮮黃色、質地致密、松脆、呈易分散小顆粒狀、表面干燥、繼代和分化能力強［20］。不同植物的愈傷組織，其質量標準有著很大的不同。對于禾谷類植物而言，色澤鮮黃或乳白、質地致密、表面光滑且凹凸不平的愈傷組織（易以器官發生的方式實現植株再生）和結構松脆、顆粒狀的愈傷組織（易以體胚發生的方式實現植株再生），都屬于質量好的愈傷組織［12］。王海波［12］認為，愈傷組織培養其實是一種細胞類型多樣性的衍生體系，愈傷組織的類型由組成愈傷組織的主要細胞領導類型決定，并且在一定的條件誘導調控下，不同細胞類型之間的細胞可以相互轉變，即胚性與非胚性愈傷組織之間可以通過調控相互轉化；其調控因子按應該優先考慮的順序依次為:培養基激素、N源（類型及用量）、無機離子（如K+、Ca2+、Mg2+、Cl-、SO24-和PO34-等）、維生素、C源和滲透壓。一般情況下，只要把握好激素和N源的使用就可達到很好的調控效果；其中生長素和還原態N主要是使細胞進入或保持在亢進狀態，它們能夠促進生物合成和細胞分裂、促使細胞壁松弛和膜透性發生改變等，從而愈傷組織不斷生長而不利于進一步分化出根、芽等器官；細胞分裂素和硝態氮主要是使細胞進入或穩定在保守狀態，多表現為促進細胞產生或強化某些功能、促使細胞間產生分工、促進某些生命活動所需物質的合成和產生代謝物等，促進愈傷組織分化。另外，物理因素也可作為調控因子，如光照、低溫可作為保守因子，熱激等可列為衰敗因子（造成愈傷組織衰敗死亡）。離體培養的核心就是“細胞狀態調控”。“細胞狀態”是由遺傳、生理、化學、物理、組成、結構等因素控制或影響的細胞形態、結構、功能、潛能的綜合反映［12］。細胞狀態決定愈傷組織的質量，決定培養的效果和結果。成功的細胞和組織培養是以獲得理想的愈傷組織狀態為目標，協調細胞內外的各種因素，使之達到理想的組合與配合。

3　問題與展望

隨著近年來國內外生物技術的不斷發展，禾谷類作物花粉培養的研究不論是在基礎理論還是在實踐應用上都取得了較大的進步，但是仍然還有較多問題需要探討。

（1）植物中孢子體發育途徑存在的生物學意義是什么？孢子體途徑是否是植物在特殊情況下的一種遺傳物質傳遞和種群延續的特殊機制？對于這個問題的探討有利于從進化學上更進一步地了解認識花粉培養過程。

（2）脅迫處理對于胚性小孢子來說是起到篩選純化作用還是誘導創造作用？當前的研究只是說明其能夠增加小孢子胚胎的誘導效率，而其對胚性小孢子的具體作用仍不是很清楚。有可能是通過殺死非胚性小孢子而相對增加胚性小孢子在總外植體中的比例，也有可能是使得非胚性小孢子發育轉變為胚性小孢子，增加胚性小孢子的數量。這需要更深入的研究去探明。

（3）脅迫處理后小孢子的細胞學和生理學變化的信息還比較少，還不足以支持一個關于預處理后小孢子行為的全面的觀點［10］。該問題的存在一方面是由于預處理和試驗品種的多樣性造成的，另一方面則是因為研究工作的相對缺乏所致。

（4）脫分化和多細胞花粉結構的形成（主要是細胞壁的形成）哪個才是花粉胚誘導的關鍵決定因子？當前兩方面的論述都比較多，或者說兩者都是比較重要的。對于這個問題的探討，有利于在實踐中更具針對性地去采取措施提高花培誘導率。

（5）花粉的不育性與花粉的單雄生殖反應能力之間是否存在著一定的關系？如果真如前面推測所說——花粉的不育性也許是一種天然的饑餓作用，不育花粉細胞是一種具有較好誘導條件和較強誘導潛力細胞，那么依此將禾谷類作物普遍存在且研究較深入透徹的不育系引入花培體系，對于其培養材料來源就是一個很大的突破，既利于增大培養規模，又利于提高培養效率。

另外，小孢子重新進入細胞分裂周期的基因調控機制，小孢子重新進入細胞分裂周期與體細胞相比是否存在著一定的特異性等，還有待于進一步研究。對于小孢子離體培養的遺傳調控機制研究，除了細胞分裂周期的基因調控機制之外，研究比較多的還有各種谷類花粉培養能力的遺傳模式［21，22］和小孢子胚胎誘導過程中關鍵環節的分子機制［23～25］，如小孢子脅迫前處理、花粉脫分化、發育途徑轉變以及白化苗的形成分子機制等；其中涉及到的基因種類眾多，包括形態特征、信號轉導、細胞命運決定、細胞壁變化、細胞保護、防御和毒性及脅迫反應、新陳代謝、轉錄翻譯調控、蛋白質降解、質體發育以及物質轉運等相關基因。然而由于缺乏系統有效的歸納總結，這部分理論研究成果還較難用于指導花培實踐。因此對這些繁雜的分子機制研究成果進行總結歸納，使基礎理論進一步轉化為應用技術也非常重要。

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Research Progress on the Biological Basis of Cereal Pollen Culture

DAILi，WANG Xue-Hua*
（College of Agronomy，Hunan Agriculture University，Changsha，，Hunan 410128，China）

From the angle of plant physiological metabolism，the physiological and metabolic mechanism of series of process in the cerealmicrospore culture are summarized，at the same time，the physiological or cytologymechanism of several key process is discussed in this paper，such asmicrospore dedifferentiation and callus formation，differentiation and transformation，etc.And the current problems we are facing in this field and the direction of future development is summarized and prospected.

cereal crops；microspore culture；de-differentation；callus；physiological and biochem icalmachanism

Q943.1

A

1001-5280（2015）06-0672-06

10.3969／j.issn.1001-5280.2015.06.25

2015-04-03

戴 力（1992-），男，湖南隆回人，碩士研究生，Email:1436156290＠qq.com。*通信作者:王學華，博士，教授，從事作物栽培與耕作學研究，Email:wxh6011＠163.com。