2015年版《中國藥典》無菌檢查法解讀

楊曉莉，李輝，繩金房，錢維清，胡昌勤

（1.陜西省食品藥品檢驗所，陜西西安710065；2.上海市食品藥品檢驗所，上海201203；3.中國食品藥品檢定研究院，北京100050）

2015年版《中國藥典》無菌檢查法解讀

楊曉莉1，李輝1，繩金房1，錢維清2，胡昌勤3

（1.陜西省食品藥品檢驗所，陜西西安710065；2.上海市食品藥品檢驗所，上海201203；3.中國食品藥品檢定研究院，北京100050）

目的解讀2015年版《中國藥典》無菌檢查法的主要增修訂情況。方法對比2015年版《中國藥典》無菌檢查法與2010年版《中國藥典》無菌檢查法的主要差異。結果2015年版《中國藥典》無菌檢查法在檢查內容、檢查方法、培養體系及質量控制理念等方面都作了較大修訂。結論2015年版《中國藥典》將無菌檢查法完善成為更加科學并與國際接軌的檢查方法。

無菌檢查法；2015年版《中國藥典》；無菌藥品；培養體系；質量控制

無菌檢查法是指用于檢查藥典要求無菌的藥品、生物制品、醫療器具、原料、輔料及其他品種是否無菌的方法［1］，是藥品微生物檢查體系的重要組成部分，藥品微生物是關系藥品安全性的關鍵指標之一。無菌藥品的微生物污染是影響藥品生產質量和引發臨床不良事件的主要因素，近年來發生的“欣弗事件及刺五加事件”等嚴重藥害事件都是無菌藥品的微生物污染導致［2］。目前，美國、歐盟、日本等國家或組織無菌檢查法已協調一致［3］。2010年版《中國藥典》及之前版本收錄的無菌檢查法與國際通用的標準在檢查理念、培養體系、方法要求等諸多方面有顯著差異。在國家藥品安全規劃與標準提高的目標下，2015年版《中國藥典》借鑒國外藥典先進技術經驗，以新的控制理念為指導，結合我國國情對無菌檢查法的檢測范圍及環境要求、培養體系、方法適用性、檢查方法、偏差調查與過程控制等方面都做了較大修訂，進一步完善了無菌檢查法，修訂后的無菌檢查法正逐步與國際通用標準一致。筆者對比了2010年版《中國藥典》［4］，解讀2015年版《中國藥典》無菌檢查法增修訂概況，以推動新版藥典的貫徹實施。

1　檢測范圍和環境要求的變化

1.1檢測范圍

2010年版《中國藥典》無菌檢查法的相關內容統一為新的標準方法，解決了長期以來各部之間相同方法要求不一致的問題，其檢查范圍增大，要求更明確、嚴格。除了規定藥典要求無菌的藥品、原料、輔料、生物制品及其他品種外，還將無菌醫療器具明確納入檢查范圍。無菌醫療器具與無菌藥品的使用密切相關，影響著無菌藥品的安全使用。醫療器具在提高救治質量的同時，也可能成為環境病原菌的傳播工具，造成醫院感染的發生［4］，新的要求必將嚴格無菌醫療器具的監管，降低安全風險。

1.2環境要求

新版藥典無菌控制理念要求檢測環境應與檢測需求相適應，體現科學、合理的原則。目前，國際上對無菌檢測環境無明確要求，但原則上無菌檢查的試驗環境應不低于無菌藥品的生產關鍵區域環境。相比2010年版《中國藥典》規定的無菌檢查應在環境潔凈度10 000級下的局部潔凈度100級單向流空氣區域內進行的要求，2015年版《中國藥典》中規定“無菌檢查應在無菌條件下進行，實驗環境必須達到無菌檢查的要求”。無菌檢查條件和無菌檢查具體要求應是什么呢？2015年版《中國藥典（四部）》通則9 203藥品微生物實驗室質量管理指導原則中給出了具體指導意見，無菌檢查應在B級背景下的A級單向流潔凈區域或隔離系統中進行。新版藥典這一要求比之前的環境要求更嚴格，在無菌操作、預防措施、潔凈度確認、隔離系統驗證和環境監控等方面要求一致。新版藥典在通則9203藥品微生物實驗室質量管理指導原則和9205藥品潔凈實驗室微生物監測和控制指導原則對試驗環境和環境監控有更詳細、具體的指導，增強了方法的可操作性、實用性、可靠性和規范性。

2　培養體系的變化

培養體系主要包括培養基、培養時間和培養溫度等方面，微生物培養體系的差異導致了2010年版《中國藥典》與國外藥典無菌檢查法的系統性差異，檢查結果之間存在不確定性及不可比性。隨著國際貿易的日益頻繁，中外藥典微生物培養體系的一致性需求成為一種趨勢，新版藥典無菌檢查法微生物培養體系與國際通用標準一致。

1）無菌檢查用培養基

2015年版《中國藥典》無菌檢查法規定，以硫乙醇酸鹽流體培養基和胰酪大豆胨液體培養基作為無菌檢查的2種主要培養基，其中硫乙醇酸鹽流體培養基主要用于厭氧菌的培養，胰酪大豆胨液體培養基主要用于需氧菌和真菌的培養，糾正了我國長期存在的將微生物劃分為細菌和真菌的概念，以培養基的促生長能力和微生物的生長需要作為分類依據，將產品中可能污染的微生物在無菌檢查中按需氧菌、厭氧菌和真菌進行培養。硫乙醇酸鹽流體培養基自20世紀50年代起，國內外藥典陸續將其收錄，用于藥品的無菌檢查。但研究發現，其存在局限，該培養基并不能使所有的梭狀芽孢桿菌生長，并提出應同時使用胰酪大豆胨液體培養基作為補充，這一建議隨后被國外藥典采納。但該培養基之所以能沿用至今，是因為其具有不可替代的優勢，硫乙醇酸鹽流體培養基能在普通有氧環境下提供厭氧條件，使需氧菌和厭氧菌均能生長良好，并易于觀察結果，這提供了一般實驗室難以達到的厭氧培養條件［5-6］。試驗證明，2010年版《中國藥典》無菌檢查法所用改良馬丁培養基與國外藥典胰酪大豆胨液體培養基雖然在促微生物生長能力（靈敏性）和適于微生物生長的種群（廣譜性）上無顯著性差異，但胰酪大豆胨瓊脂培養基的菌落形態較典型，且在培養霉菌方面略優于改良馬丁培養基，且胰酪大豆胨液體培養基pH值為7.3±0.2，改良馬丁培養基的pH值為6.4±0.2，更接近中性的pH環境，適宜于需氧菌和真菌的生長［7-9］。為與國際標準接軌，新版藥典無菌檢查用培養基將胰酪大豆胨液體培養基取代了2010年版《中國藥典》收載的改良馬丁培養基。

新版藥典無菌檢查用培養基中對原來的“選擇性培養基”名稱進行了更正。因為選擇性培養基是指能允許特定的微生物在其中繁殖，而部分或全部抑制其他微生物生長的增菌培養基。而2010年版《中國藥典》及以前各版無菌檢查法一貫收載的“選擇性培養基”實際上是指為消除供試品的抑菌性而在原有培養基中加入中和劑、滅活劑后的培養基，不是嚴格意義上的選擇性培養基，新版藥典將其更名為準確的“中和或滅活用培養基”。

另外，新版藥典無菌檢查法中還規定培養基的pH值應在25℃測定。因溫度對pH值有影響，培養基在配制過程中需要經過加熱、溶解、滅菌等一系列處理，規定25℃的pH值也是對培養基質量提出了更嚴格的要求。

2）菌液制備用培養基

由于培養體系的變化，菌液制備所用的培養基、培養條件等要素也做了相應調整。其中用胰酪大豆胨液體培養基替代營養肉湯培養基，胰酪大豆胨瓊脂培養基替代營養瓊脂培養基，沙氏葡萄糖液體培養基替代改良馬丁培養基，沙氏葡萄糖瓊脂培養基替代改良馬丁瓊脂培養基。新增沙氏葡萄糖瓊脂和沙氏葡萄糖液體培養基用于白色念珠菌和黑曲霉菌的菌液制備。

3）培養溫度

溫度是影響微生物生長的關鍵因素，與醫藥相關的微生物大多是嗜溫的，其最適溫度在環境溫度和體溫之間［10］。絕大多數微生物最適生長溫度為25～37℃。2015年版《中國藥典》硫乙醇酸鹽流體培養基規定的培養溫度與2010年版硫乙醇酸鹽流體培養基規定的培養溫度一致，為30～35℃，生物制品需增加1份20～25℃培養。但胰酪大豆胨液體培養基規定的培養溫度為20～25℃，不同于原改良馬丁培養基的培養溫度23～28℃。金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌和大腸埃希菌最適生長溫度為37℃，白色念珠菌和黑曲霉最適生長溫度為28℃，均為嗜溫型微生物。微生物在最適溫度生長最快，超過最適溫度，熱會破壞菌體的某些蛋白質而使細胞活力喪失，微生物生長的最適溫度通常與規定的最高溫度相對較近而與規定的最低溫度相對較遠。一般略低于最適溫度對微生物生長影響不大，而高于最適溫度會對微生物生長產生較大影響，因此結合培養基的促生長特性，盡量全面地覆蓋微生物檢出的種類和數量，無菌檢查規定的培養溫度20～25℃和30～35℃滿足試驗要求。

4）培養時間

在適宜培養條件下，細菌的群體生長數量與培養時間的關系遵循生長曲線規律，延長培養時間有利于微生物的檢出［11］。無菌產品中的微生物在生產工藝過程中會受到損傷而處于亞致死狀態，受損微生物菌體在開始繁殖前需要有一段修復損傷的時間，一般標準方法中推薦的通常只是多數細菌恢復生長的最佳時間。如果減少培養時間會導致菌體生長數目大量減少，在定性試驗方法中，導致假陰性結果。方法適用性下規定的培養時間為不得超過5 d。

5）培養環境

氧氣作為許多微生物的最終電子受體，是其生長的重要影響因素，如枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等。但有一些微生物，氧氣的存在不利于其生長，如生孢梭菌等。另有一些微生物的生長也可不依賴氧氣的存在，屬兼性厭氧菌，如大腸埃希菌、沙門氏菌等。在培養環境中不同微生物對氧氣的依賴程度不同，影響微生物的生長速率和狀態的程度也不同。液體培養基煮沸可將溶解氧去除，硫乙醇酸鹽流體培養基與胰酪大豆胨液體培養基在配制時需要煮沸。硫乙醇酸鹽流體培養基中的還原劑巰基乙酸鈉能形成-200mV或更低的氧化還原電位，以減少或清除氧或氧化分子對厭氧微生物生長的抑制作用。胰酪大豆胨液體培養基配制時微溫溶解，培養基中有一定的氧含量，有利于需氧菌、微需氧菌和兼性厭氧菌等其他微生物的生長。新的培養體系提供了覆蓋更全面、更普遍的微生物培養環境，有利于污染菌的檢出。

3　方法適用性試驗的變化

3.1名稱的修訂

2015年版《中國藥典》無菌檢查法將方法驗證試驗修訂為方法適用性試驗。驗證與適用性均是為保證方法的合理、有效而對方法進行的測評，然而其側重點不同。方法學驗證是通過實驗證明方法的運行符合分析應用要求的過程，側重于方法本身的科學性。適用性把儀器確認、電子系統、分析方法、操作、樣品等因素作為一個整體的系統來評價，控制分析條件諸因素的影響，使檢測活動能達到預期目標。方法適用性試驗包含方法驗證試驗，范圍更廣，層次更高，更為全面的質量控制策略。分析方法驗證、轉移和確認的概念不同，適用范圍不同。方法確認的目的是證明藥典分析方法或法定分析方法適用于被測樣品，被測樣品的質量可控，方法可行，同時還證明方法使用人員有能力成功地操作藥典分析方法或法定分析方法［12］。新版藥典將原來的“驗證、證明”的表述修訂為“確認”，更準確。

3.2菌種及菌液制備

增加了pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為菌液制備中的稀釋劑和洗脫劑，pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液除了能提供適宜的滲透壓、良好的細胞修復環境外，還消除了微生物培養過程中積累的代謝產物引起的酸堿度變化而帶來的不利影響。方法適用性試驗使用的菌種與培養基靈敏度使用的菌種略有不同，方法適用性試驗以大腸埃希菌代替銅綠假單胞菌。銅綠假單胞菌為假單胞菌屬菌種，對很多抗生素都天然耐藥，藥物敏感度不高，不適合做方法適用性。但假單胞菌屬的細菌對培養體系的營養要求高，所以適合做培養基適用性檢查。

3.3薄膜過濾法

薄膜過濾法是歷版《中國藥典》收載的無菌檢查法的首選方法，其具有操作簡便、結果準確等優點，尤其是全封閉式薄膜過濾器具有不易污染的優勢而在薄膜過濾法中得到廣泛應用，新版藥典刪除了“取出濾膜接種至硫乙醇酸鹽流體培養基或改良馬丁培養基中”，淘汰了開放式薄膜過濾的操作方式。另外，在培養時間上要求不得超過5 d，對方法適用性試驗進程提出了比較靈活的要求。

3.4直接接種法

當樣品的性狀不允許，且經多種方法前處理后仍無法采用薄膜過濾法的供試品，可采用直接接種法［13］，由于培養體系的不同，方法適用性試驗所使用的培養基的接種管數也與2010年版《中國藥典》規定的接種管數有差異。2010年版規定為硫乙醇酸鹽流體培養基8管，改良馬丁培養基4管；2015年版為硫乙醇酸鹽流體培養基與胰酪大豆胨液體培養基各6管。

4　供試品無菌檢查的變化

4.1檢驗數量

檢驗數量是指一次試驗所用供試品的最小包裝容器的數量。2015年版《中國藥典》增加了新的要求，即：成品每亞批均應進行無菌檢查。因為在實際中，為完成某些生產操作步驟，可能有必要將1批產品分成若干亞批，最終合并成為1個均一批。無菌檢查是通過抽取1批產品中的部分樣品檢測來推斷整批產品是否無菌的統計學過程，因此如果檢驗數量與所對應的實際批量不符（亞批的狀況），就會導致產品通過無菌檢查的概率升高。對于亞批無菌檢查的特別規定，體現了藥品安全從嚴控制的理念。無菌檢查法中“表1批出廠產品及生物制品的原液和半成品最少檢驗數量”與“表2上市抽驗樣品的最少檢驗數量”專門用來描述對于檢驗數量的規定，無菌檢查試驗供試品的檢驗數量不能低于藥典規定的最少檢驗數量。

4.2檢驗量

2010年版《中國藥典》無菌檢查法中的檢驗量是指1次試驗所用的供試品總量（g或mL），這顯然與“表2液體制劑最少檢驗量及上市抽驗樣品的最少檢驗數量”和“表3固體制劑最少檢驗量及上市抽驗樣品的最少檢驗數量”所表達的“每支供試品接種每種培養基的最少量”不完全相符，表達不夠準確。新版藥典檢驗量的概念結合無菌檢查法的特點和供試品的特殊性，定義為供試品每個最小包裝接種至每份培養基的最小量（g或mL），詳細清晰地表述了檢驗量為每個最小包裝接種至每份培養基的供試品量的下限。只要供試品特性允許，應將所有容器的全部內容物過濾，這有利于污染菌的檢出。刪除了“薄膜過濾法檢驗量應不少于直接接種法的供試品總量”的表述，一般來說，薄膜過濾法具有適用于檢驗量較大的供試品無菌檢查，該方法總檢驗量通常都不會少于直接接種法的總檢驗量，因此，2015年版《中國藥典》關于該問題不再贅述。

4.3陽性對照

2015年版《中國藥典》無菌檢查法將陽性對照菌的選擇細化，將原來抗細菌的供試品，以金黃色葡萄球菌為陽性對照修訂為無抑菌作用及抗革蘭陽性菌為主的供試品，以金黃色葡萄球菌為對照菌，抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對照菌，再加上抗厭氧菌的供試品以生孢梭菌為對照菌，這樣就使供試品對照菌的選擇更科學，對方法的控制更具針對性。陽性對照試驗的設置是必要的，是單次試驗條件下檢測方法有效的有力證據。對于某些具有抑菌性的藥物，若陽性對照呈陽性生長，則證明所采取的稀釋、中和、滅活等去除抑菌性的方法是有效的。

4.4供試品處理及接種培養基

該項下主要描述了無菌檢查前，需要對樣品進行消毒處理以避免人為污染而影響結果的準確性。同時，提供了容器內具有一定真空度供試品的前處理方法。該部分屬于文字及編排順序的變更，內容無實質性變化。

4.5薄膜過濾法

隨著科技水平的發展，封閉式薄膜過濾器因其不易污染、操作方便等優勢逐漸取代了一般薄膜過濾器，因此新版藥典無菌檢查法不再收載一般薄膜過濾器及其相關操作。對于水溶液供試品，明確了“可直接過濾，或混合至100mL適宜稀釋液的無菌容器中，混勻，立即過濾。這樣可使樣品充分分散。整合了2010年版《中國藥典（三部）》關于生物制品薄膜過濾法和接種培養基的規定。總結近年來醫療器具無菌檢查的實踐經驗，可聯合使用薄膜過濾法和直接接種法，增加了具有導管的醫療器具（輸血、輸液袋等）供試品無菌檢查方法的規定。

4.6直接接種法

新版藥典明確了直接接種法的適用范圍，即直接接種法適用于無法用薄膜過濾法進行無菌檢查的供試品。直接接種法操作相對煩瑣，加入中和劑或滅活劑等處理時經常會出現其他影響結果觀察的狀況，因此刪除了關于去除抑菌性的相關規定。但直接接種法在進行固體制劑、非水溶性供試品、敷料、腸線、縫合線、滅菌醫用器具、放射性藥品等特殊樣品的無菌檢查時有其明顯優勢。限定樣品的加入量與培養基體積的比例不大于10%，以避免培養基促生長能力的減弱或是不利于微生物生長的過高滲透壓。

4.7表1，2，3的變化

2015年版《中國藥典》整合了原表1，2，3的相關內容及生物制品的有關規定，重新形成了新的表1，2，3，分別為表1批出廠產品及生物制品的原液和半成品最少檢驗數量，表2上市抽驗樣品的最少檢驗數量，表3供試品的最少檢驗量，在表2和表3中合并了固體制劑和液體制劑，將上市抽驗樣品的最少檢驗量獨立成表2，將最少檢驗量和最少檢驗數量分開表述。表1，2均為形式上的整合，內容上基本無實質變化。表3中參考USP重新調整了液體制劑供試品裝量所對應的每支供試品接入每種培養基的最少量，整體上看，較小規格（V<100mL）最少檢驗量有所增大，增加檢驗量有利于污染微生物的檢出，大規格（V>100mL）有所減少，主要是為保護濾膜的完整性和截留微生物不會受到較大體積液體濾過的影響，同時，也有利于一些不易通過濾膜（如脂肪乳樣品）的無菌檢查。帶導管的一次性醫療器具（如輸液袋），要求每支供試品接入每種培養基的最少量為1/2的內表面積，相比之前要求更為科學、詳細。

4.8培養與觀察的變化

無菌檢查試驗中微生物培養時間是理論與經驗的總結，新版藥典無菌檢查法規定培養時間為14 d，如培養14 d后不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養液適量轉種至同種新鮮培養基中，再培養3 d觀察結果，這有別于2010年版《中國藥典》培養14 d轉種后細菌培養2 d，真菌培養3 d的規定。新版藥典在培養及觀察項下還要求對接種生物制品供試品的硫乙醇酸鹽流體培養基的容器應分成2等份，1份置30～35℃培養，1份置20～25℃培養。

5　偏差調查與菌種鑒定

2010年版與2015年版《中國藥典》在結果判斷上無變化，但更加強調了偏差調查。如果無菌產品的無菌檢查結果異常，應開展偏差調查。偏差調查關系著產品質量及質量管理體系的良好運行。偏差分析實施的過程可以概括為如下流程：偏差確認→偏差評估→實驗室調查→全范圍偏差調查→總結調查結果（糾偏措施+決定放行）［14］。微生物實驗室的偏差調查應對試驗進行全面回顧和溯源，從人員、檢驗方法、方法理解、注意事項、操作程序、儀器材料、對照試驗、試驗環境、培養基、試驗菌株等方面進行調查，查找原因深入分析，并及時采取糾偏措施，形成調查報告。一個完整的偏差調查報告至少應包括偏差概述、偏差調查（如果是試驗過程污染經進行菌種的相關鑒定，查找污染源）、偏差分析、結論與糾偏措施、糾偏結果的微生物學評價及建議措施。如實驗室調查確認異常/超標結果并非試驗偏差，則微生物實驗室要聯合質量管理部門和相關人員進行全面調查并形成調查報告［15］。無菌檢查以1次檢查為準，不允許復試。但若試驗經確認無效，可重試。對陽性結果分離的微生物進行鑒定，以判斷試驗是否重試。實驗室要結合具體狀況選擇適宜的方法對疑似菌確認，出現爭議時以現行版《伯杰氏系統細菌學手冊》為準［2015年版《中國藥典（四部）》通則9204微生物鑒定指導原則］。在微生物鑒定相關的核酸、脂肪酸，蛋白質的分析儀器設備基礎上建立起來的儀器分析法是菌種（株）鑒定未來發展的方向?，F階段的API檢測是細菌鑒定的常用方法，16SrDNA測序技術的應用也發展成熟，傅里葉紅外微生物溯源分析系統等也發展較快。文獻報道，生化鑒定操作相對復雜煩瑣，而16SrDNA測序技術鑒定細菌具有高效、準確、簡便、特異性強等優勢［16］，再輔以血清學實驗或其他分子生物學技術，能對細菌進行分型鑒定。藥品微生物實驗室在藥品無菌檢查的偏差調查時可根據自身的實驗條件和實驗目的，結合16SrDNA測序和生化鑒定，選擇適合的菌種鑒定方法。

6　無菌產品的全過程控制

無菌是指物品滅菌或除菌后不含活的微生物，如微生物和無菌檢查所用的物品經滅菌處理后不得含活的微生物，但在實際中沒有絕對無菌的存在，無菌產品的無菌性常以無菌保證水平（SAL）來表示，通常為10-n，一般采用終端滅菌的產品其SAL≤10-6，即在百萬件或以上物品中最多只允許有1件物品仍存在活微生物，視為合格［17］。由于無菌檢查法在采樣、培養條件等方面存在先天缺陷［18］，無菌產品的微生物安全性不能僅依賴于無菌檢查，應強調產品的全過程控制。無菌檢查是為了證明一個否定的結論，是一個推斷的統計學檢測結論，對于終端滅菌的產品這一假設是合理的，但前提是滅菌器的熱量分布均勻，或射線劑量分布均勻。參數放行需要反復、定期的監控和證明，為終端滅菌產品進入市場提供了依據。因此現階段下，結合我國國情，強調無菌產品的全過程質量控制理念，盡可能從設備、物料、環境、人員、技術、方法等角度達到對無菌產品生產工藝過程進行持續監控，以提高無菌檢查結果的可信度，從根本上保障無菌產品的安全性和有效性。

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R954；R921.2

A

1006-4931（2015）24-0007-05

楊曉莉，副主任藥師，研究方向為微生物檢驗，（電話）029-62288451（電子信箱）yangxiaoli0206@163.com。

2015-07-14）