復方腎炎片聯合強的松對阿霉素腎病幼鼠治療作用

王英娟，潘凱麗，強 歡，趙曉莉

(1.第四軍醫大學西京醫院兒科，陜西 西安710032；2.榆林市第一醫院兒科，陜西 榆林719000；3.西安市兒童醫院，陜西 西安710003)

復方腎炎片聯合強的松對阿霉素腎病幼鼠治療作用

王英娟1,2，潘凱麗1，強 歡3，趙曉莉1

(1.第四軍醫大學西京醫院兒科，陜西 西安710032；2.榆林市第一醫院兒科，陜西 榆林719000；3.西安市兒童醫院，陜西 西安710003)

目的 研究復方腎炎片聯合強的松對阿霉素腎病幼鼠的治療作用。方法 32只4周齡雄性大鼠建立阿霉素腎病模型后，隨機分為模型對照組(B組)、復方腎炎片組(C組)、強的松組(D組)和聯合用藥組(E組)，每組8只，另取8只做為正常對照組(A組)。于造模前1天、造模后2周末、4周末、8周末、12周末共5個時間點檢測大鼠24h尿蛋白，12周末檢測各組大鼠血白蛋白、血脂及腎功并行腎臟病理檢查。結果 ①A組大鼠5個時間點尿蛋白水平無顯著變化(F=5.03，P>0.05)；B組、C組、D組、E組大鼠2周末、4周末、8周末及12周末尿蛋白較各自0周末均有顯著變化(F值分別為23.59、18.17、14.53、19.61，均P<0.05)。B、C、D、E組8周末及12周末尿蛋白水平均有顯著性差異(F8周末=15.66，F12周末=25.43；均P<0.05)，其中B組平均尿蛋白水平最高，8周末為(170.80±38.56)mg/24h，12周末為(141.29±36.55)mg/24h；E組最低，8周末為(37.59±15.36)mg/24h，12周末為(12.40±4.10)mg/24h。②12周末5組間的白蛋白及總膽固醇、甘油三酯較比較，差異有統計學意義(F白蛋白=27.13、F總膽固醇=19.80、F甘油三酯=19.05，均P<0.05)，但其中E組白蛋白、總膽固醇、甘油三酯較A組無統計學差異(均P>0.05)，5組間尿素氮及肌酐水平無統計學差異(F尿素氮=10.75、F肌酐=9.43、均P>0.05)。③E組相較B、C、D組有較輕病理損害，腎間質無增生，腎小管未見蛋白管型。結論 復方腎炎片聯合強的松治療阿霉素腎病大鼠可顯著降低尿蛋白及血脂水平，維持血清白蛋白水平，起到有效的治療作用。

阿霉素；腎病綜合征；復方腎炎片；幼鼠

兒童原發性腎病綜合征(primary nephrotic syndrome，PNS)是小兒最常見的腎小球疾病之一，臨床多首選糖皮質激素(glucocorticoid，GC)治療，但長期應用可出現代謝紊亂、庫欣貌等并發癥，且PNS的預后很大程度上取決于患兒對激素治療敏感性或耐藥程度，據報道約有23%PNS患兒為激素耐藥型腎病綜合征(steroid-resistant nephrotic syndrome，SRNS)，且呈逐年上升趨勢。因此選擇一種可提高激素治療療效并減輕激素副作用的藥物具有重要意義。復方腎炎片含有丹參、黃芪等中藥成分，臨床應用對PNS患兒有較好的輔助治療效果。本研究旨在明確復方腎炎片對阿霉素(adriamycin，ADR)腎病幼鼠血生化及病理學改變，以明確其治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4周齡SPF級雄性SD大鼠40只，體質量(122.4±16.8)g，由解放軍第四軍醫大學實驗動物中心提供，動物生產批號：SCXK-(軍)2007-007。

1.2 主要試劑

復方腎炎片(生產批號：Z20025123)；強的松片(生產批號：110207)；考馬斯亮藍溶液(批號：B-1131)；注射用鹽酸阿霉素(生產批號：100401)，使用時用生理鹽水稀釋為2g/L的溶液。

1.3 動物模型的建立及干預方案

40只SD幼鼠簡單隨機化法選出8只為正常對照組(A組)，剩余32只一次性尾靜脈注射阿霉素6.5mg/kg后隨機分為4組，即模型對照組(B組)、復方腎炎片組(C組)、強的松組(D組)、聯合用藥組(E組)，每組各8只。對照組給予等量生理鹽水尾靜脈注射。

造模后第1周至第12周次日晨灌胃，A組、B組給予蒸餾水灌胃，C組予以復方腎炎片水提取液6.75g/kg灌胃，D組給予強的松混懸液6mg/kg灌胃，E組給予強的松6mg/kg+復方腎炎片6.75g/kg灌胃，灌胃容積為每公斤體重1mL。

1.4 觀察指標及檢測方法

1.4.1 一般情況

每日觀察大鼠一般情況，包括飲食，精神狀態、體毛、活動情況、二便、水腫變化等，每周稱重并記錄。

1.4.2 尿蛋白及血清生化

造模前1天及造模后2、4、8、12周末將各組大鼠置于清潔代謝籠中，禁食不禁水留取24h尿液，測量尿液總量后抽取1mL存于EP管中-20℃保存備檢。尿蛋白檢測方法為考馬斯亮藍法。

12周末，各組大鼠采用3%戊巴比妥鈉每公斤體重0.1mL麻醉后剪開胸腹腔，抽取下腔靜脈血5mL，3 000r/min離心10min后分離血清-20℃保存備檢。大鼠血清白蛋白、總膽固醇、甘油三酯、肌酐、尿素氮檢測采用全自動生化分析儀進行檢測。

1.4.3 腎組織病理檢查

打開大鼠腹腔后從距離腎門約lmm處切取雙側腎臟，用預冷的生理鹽水反復灌洗腎臟，待腎臟蒼白后，沿縱軸剖開，一半置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋后切片，厚度3μm，行HE染色后進行光鏡檢查。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 一般情況

阿霉素尾靜脈注射后第4天，B、C、D、E組大鼠飲食活動減少，蜷曲、弓背，個別出現腹瀉，注射后7～14天，B、C、D、E組大鼠被毛枯黃無光澤、脫毛、消瘦、倦怠少動，出現陰囊及四足的水腫，尤其以后足明顯，足尾紫紅，舌質紫黯。B組和D組大鼠較C、E組體重下降明顯。實驗末B、C、D組各死亡3只，E組死亡2只。

2.2 各時間點大鼠尿蛋白定量檢測比較

對5組大鼠0周、2周末、4周末、8周末及12周末尿蛋白進行測定。5組大鼠0周末尿蛋白水平無顯著性差異(F=7.58，P>0.05)。A組大鼠5個時間點尿蛋白水平無顯著變化(F=5.03，P>0.05)；B組、C組、D組、E組大鼠2周末、4周末、8周末及12周末尿蛋白較各自0周末均有顯著變化(F值分別為23.59、18.17、14.53、19.61，均P<0.05)。B、C、D、E組8周末及12周末尿蛋白水平均有顯著性差異(F8周末=15.66；F12周末=25.43，均P<0.05)，其中B組平均尿蛋白水平最高，8周末為(170.80±38.56)mg/24h，12周末為(141.29±36.55)mg/24h；E組最低，8周末為(37.59±15.36)mg/24h，12周末為(12.40±4.10)mg/24h。見表1。

2.3 12周末大鼠白蛋白及腎功、血脂比較

12周末5組間的白蛋白及總膽固醇、甘油三酯較比較，差異有統計學意義(F白蛋白=27.13；F總膽固醇=19.80；F甘油三酯=19.05，均P<0.05)，但其中E組白蛋白、總膽固醇、甘油三酯較A組無統計學差異(均P>0.05)，5組間尿素氮及肌酐水平無統計學差異(F尿素氮=10.75；F肌酐=9.43，均P>0.05)。見表2。

2.4 各組大鼠腎臟病理學檢查

A組大鼠光鏡可見腎小球形態正常，腎間質無增生，腎小管未見蛋白管型。B組大鼠腎小球形態正常，基底膜無明顯增厚，腎間質增生，結締組織破壞正常腎小管，有再生腎小管形成，腎小管可見大量蛋白管型及空泡，腎小動脈管壁增厚，部分有空泡形成。C組大鼠腎小球形態正常，腎小球致密斑輕度增生，大動脈管壁變薄，基底膜無明顯增厚，腎間質無增生，小動脈管壁增厚，腎小管可見少量蛋白管型。D組腎小球形態正常，基底膜無明顯增厚，腎間質無增生，小動脈管壁增厚，腎小管可見少量蛋白管型。E組大鼠光鏡可見腎小球形態正常，腎間質無增生，腎小管未見蛋白管型。見附圖。

附圖 各組大鼠腎臟病理學檢查

Fig.Renal pathological examinations of rats in each group

3 討論

3.1 中西醫結合治療兒童原發性腎病的必要性

兒童原發性腎病綜合征具有病程長、反復發作等特點，相較于成人，兒童有較高的發病率，隨著病變逐漸進展，大量蛋白從尿中排出，造成血漿白蛋白降低，進而導致脂代謝紊亂。長期單獨采用糖皮質激素治療可帶來代謝紊亂、免疫功能低下等副作用。傳統醫學認為該病久病必傷絡，氣虛則血瘀，以扶正祛邪，健脾益氣，溫陽利水，滋養肝腎，活血祛瘀為法[1]。因此，在采用糖皮質激素治療的基礎上結合傳統中成藥物治療，有助于改善腎病綜合癥患兒濕、熱、毒、淤的阻滯和臟腑功能虛損導致的腎濁。

3.2 復方腎炎片聯合強的松對阿霉素腎病的治療作用

本研究采用改良的Bertaini法建立阿霉素腎病模型，可在短期內形成微小病變性腎病，可較好的模擬兒童腎病綜合征。造模后24小時尿蛋白定量示模型組大鼠2周末、4周末、8周末及12周末尿蛋白顯著高于對照組。3個治療組8周末及12周末尿蛋白水平較模型組有顯著下降，而聯合用藥組12周末較對照組無顯著性差異，且較單藥治療有顯著性下降。提示復方腎炎片聯合激素較單獨采用糖皮質激素及復方腎炎片可有效降低蛋白尿水平。同時對血漿白蛋白及血脂水平檢測發現，12周末模型組出現白蛋白及總膽固醇、甘油三酯明顯代謝紊亂，單一治療后白蛋白及總膽固醇、甘油三酯較模型組具有顯著性改善。而聯合用藥可顯著較單一用藥可以顯著改善白蛋白及總膽固醇、甘油三酯水平。腎組織病理結果也反映了復方腎炎片與激素聯合應用能明顯減少阿霉素腎病大鼠腎臟損害。提示復方腎炎片在可防止腎病大鼠出現低蛋白血癥，強的松組大鼠體型消瘦明顯，可能與長期應用強的松治療有關。相關研究表明，糖皮質激素可對大鼠的體重增長有明顯影響，尤其是肝、脾、腎、子宮等臟器重量顯著降低，同時明顯降低大鼠骨密度，造成骨質疏松[2]。這可能與糖皮質激素加速組織蛋白分解有關，復方腎炎片補氣固表、利尿排毒、健脾益腎的作用可以較好的緩解強的松的副作用。

3.3 復方腎炎片治療作用的臨床機理

復方腎炎片全方由益母草、丹參、蒲黃、茜草、黃芪、黃芩、黃精、茯苓、半枝蓮、菟絲子、牽牛子、山楂、蘆根、白茅根、車前子等15味傳統中藥組成，以化瘀、利水、解毒、益腎、健脾組方，活血化瘀藥與利尿消腫、清熱解毒之品配伍。方中丹參、益母草具有活血化瘀、利尿消腫之功效為君藥，黃芪、菟絲子、茯苓、黃精具有補氣固表、利尿托毒、健脾益腎、滲濕寧心的功效為臣藥，黃芩、蒲黃、半枝蓮、菟絲子、牽牛子、山楂、車前子等為佐藥，蘆根、白茅根為使藥，君臣佐使相配而用，針對腎臟病瘀血、熱毒、濕熱的標實證與氣陰兩虧的本虛證，起到了補虛瀉實、標本兼顧的作用[3]。此方中黃芪性溫，味甘，具有益衛固表、補氣升陽、益氣利水的功效，現代藥理研究證實，黃芪可使血液中多核粒細胞增加，增強網狀內皮系統吞噬功能，對血漿、肝、脾中環磷酸腺苷(gyclic adenosine monophosphate，cAMP)、環磷酸鳥苷(gyclic guanosine monophosphate，cGMP)的含量與比值起調節作用，促進B細胞增生，使抗體產生增多[4]。有研究發現，黃芪具有調節輔助性T淋巴細胞1( helper T cell 1，Th1)和輔助性T淋巴細胞2(helper T cell 2，Th2)的細胞功能作用[5]。同時黃芪還有類激素作用[6]。益母草有明顯的清熱解毒、活血利水的作用，可以用于治療急慢性腎炎時消除蛋白尿，丹參活血化瘀，可以有效地改變腎微循環中的血流，同時具有顯著的抗凝、抑制纖維組織增生的作用[7]。白茅根清熱生津，涼血止血，利尿、抗菌，有促進凝血酶生成，緩解腎小球血管痙攣，增強機體非特異性免疫的作用[8]。

本實驗證實了復方腎炎片聯合激素治療阿霉素腎病大鼠能延緩尿蛋白升高速度，有效降低尿蛋白，減少低蛋白血癥、高脂血癥的發生，能有效保護腎臟功能，減少腎組織損害，同時可減少激素對大鼠體重降低的副作用。由于本研究對象數量較少，實驗時間較短，因此對復方腎炎片長期的治療作用仍需要進一步觀察。該實驗研究人員目前正在對復方腎炎片的作用機理進行進一步研究中。

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[專業責任編輯：黃燕萍]

Effects of compound Shenyanpian and Prednisoneon on juvenile rats with Adriamycin-induced nephropathy

WANG Ying-juan1,2，PAN Kai-li1，QIANG Huan3，ZHAO Xiao-li1

(1.DepartmentofPediatrics，XijingHospital，FourthMilitaryMedicalUniversity,ShaanxiXi’an710032,China; 2.DepartmentofPediatrics，FirstHospitalYulin,ShaanxiYunlin719000,China;3.Xi’anChildren’sHospital,ShaanxiXi’an710032,China)

Objective To explore the effect of compound Shenyanpian and Prednisoneon on juvenile rats with Adriamycin-induced nephropathy. Methods After establishing Adriamycin models, 32 4-week-old male rats were randomly divided into model control group (group B), compound Shenyanpian group (group C), Prednisone group (group D) and combination therapy group (group E) with 8 in each group. Another 8 were recruited in normal control group (group A). One day before modeling and at the end of 2, 4, 8 and 12 weeks after modeling 24h urine protein was detected. At the end of 12 weeks serum albumin, lipids and renal function were detected, and renal pathology examination was done. Results In group A the urine protein levels at five time points showed no significant change (F=5.03,P>0.05). Compared with the urine protein levels at 0 week, those at the end of 2,4,8 and 12 weeks were significantly different in group B, C, D and E (Fvalue was 23.59, 18.17, 14.53 and 19.61, respectively, allP<0.05). There were significant differences in urine protein levels at the end of 8 weeks and 12 weeks in group B, C, D and E (F8 week=15.66，F12 week=25.43, bothP<0.05). In group B the mean urine protein level was highest, 170.80±38.56mg/24h at the end of 8 weeks and 141.29±36.55mg/24h at 12 weeks, respectively. However, that was lowest in group E, 37.59±15.36mg/24h at the end of 8 weeks and 12.40±4.10mg/24h at 12 weeks, respectively. At the end of 12 weeks there were significant difference among 5 groups in albumin, total cholesterol and triglycerides (FAlb=27.13,FCho=19.80,FTG=19.05, allP<0.05), but group E was not significantly different from group A (allP>0.05). There was no significant difference among 5 groups in urea nitrogen and creatinine (Furea nitrogen=10.75,Fcreatinine=9.43, bothP>0.05). Compared with group B, C and D, group E had less severe pathological damage. Renal interstitium showed no hyperplasia and no tubular protein casts. Conclusion Compound Shenyanpian and Prednisone can reduce urinary protein and lipid level remarkably and maintain serum albumin level with good therapeutic effect in nephropathy rats.

Adriamycin; nephrotic syndrome; compound Shenyanpian; juvenile rats

2014-08-20

王英娟(1981-)，女，主治醫師，在讀碩士研究生，主要從事兒童腎臟病及新生兒疾病的治療工作。

潘凱麗，教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.01.008

R725

A

1673-5293(2015)01-0019-03