乳牙根尖周炎中HCMV和EBV誘導細胞因子表達的研究

馬貫立，蔡章成，胡偉杰，董 研

(1.杭州市蕭山區中醫骨傷科醫院口腔科，浙江 杭州 311200；2.溫州市龍灣區第一人民醫院口腔科，浙江 溫州 325000；3.臺州市天臺縣人民醫院口腔科，浙江 臺州 317200；4.浙江大學醫學院附屬第二醫院口腔矯形科，浙江 杭州 310009)

乳牙根尖周炎中HCMV和EBV誘導細胞因子表達的研究

馬貫立1，蔡章成2，胡偉杰3，董 研4

(1.杭州市蕭山區中醫骨傷科醫院口腔科，浙江 杭州 311200；2.溫州市龍灣區第一人民醫院口腔科，浙江 溫州 325000；3.臺州市天臺縣人民醫院口腔科，浙江 臺州 317200；4.浙江大學醫學院附屬第二醫院口腔矯形科，浙江 杭州 310009)

目的 研究人類巨細胞病毒(HCMV)和Epstein-Barr病毒(EBV)及其誘導的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、γ-干擾素(γ-IFN)、白介素(IL)-1β、IL-6、IL-10和IL-12在兒童乳牙根尖周炎中的表達情況。方法 收集15例有嚴重根尖病變的乳牙，取其根尖周肉芽組織作為實驗組；同時收集15例無病變的乳牙，取其正常牙髓組織作為對照組。設計并合成引物，通過聚合酶鏈反應(PCR)檢測HCMV、EBV及細胞因子的表達。結果 HCMV(χ2=17.368，P<0.05)和EBV(χ2=15.000，P<0.05)的表達在實驗組和對照組之間具有顯著性差異；細胞因子包括TNF-α(U=15.372，P<0.05)、γ-IFN(U=16.014，P<0.05)、IL-1β(U=13.833，P<0.05)、IL-6(U=10.416，P<0.05)、IL-10(U=12.105，P<0.05)和IL-12(U=11.961，P<0.05)的表達在兩組之間也存在著顯著性差異；在根尖周肉芽組織樣本中，皰疹病毒(HCMV、EBV)與TNF-α、γ-IFN、IL-1β和IL-12的表達均呈顯著正相關(r值為0.289～0.664，均P<0.05)。結論 HCMV和EBV及其誘導的組織破壞性細胞因子的釋放可能在兒童乳牙根尖周炎的發病機理中起重要作用。

人類巨細胞病毒；Epstein-Barr病毒；細胞因子；聚合酶鏈反應；根尖周炎

乳牙根尖周病是一種感染性的炎癥疾病，具有多種影像學臨床表現。根尖周病損的不同臨床征兆和/或臨床癥狀及其病理分型是否與微生物或宿主對感染性病原體的免疫反應有關，還有待研究。已有研究發現，根尖周肉芽腫與皰疹病毒的感染有關，這些研究表明人類巨細胞病毒(HCMV)和Epstein-Barr病毒(EBV)與有癥狀的根尖周病變呈明顯相關[1-4]。HCMV和EBV的活動性感染會激活巨噬細胞，生成大量的細胞因子和趨化因子，這些因子又會進一步誘導細胞活化和細胞因子生成，從而誘發一系列病理生理學變化。研究表明，細胞因子與根尖周炎的發生、發展和治療相關[5-7]。因此，本研究通過檢測HCMV和EBV及其誘導的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、γ-干擾素(γ-IFN)、白介素(IL)-1β、IL-6、IL-10和IL-12在兒童乳牙根尖周炎中的表達，為HCMV和EBV及其誘導的細胞因子參與兒童乳牙根尖周炎的發病機理提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

收集2014年9月至2015年3月就診于杭州市蕭山區中醫骨傷科醫院口腔科門診的因嚴重根尖周病變而拔除的乳牙及因恒牙異位萌出而拔除的滯留乳牙各15顆，以前者的根尖周肉芽組織作為實驗組，后者的乳牙牙髓組織作為對照組[8]。實驗組年齡在4～8歲，平均年齡6.1±1.7歲；男孩6名，女孩9名。對照組年齡在7～10歲，平均年齡6.5±1.5歲；男孩8名，女孩7名。納入標準：與乳牙根尖周炎診斷標準一致，患牙伴有叩痛、慢性竇道，X線片呈現根尖周陰影，但無牙根吸收，無明顯根分歧吸收。排除標準：①患牙有側穿、底穿、根折、根縱裂等明顯結構異常者；②急慢性感染者；③伴有嚴重心肺腎功能異常或其他全身性免疫疾病者；④近2周內接受抗病毒藥物治療者等。

1.2 樣本取材

局部麻醉前，患者用0.12%洗必泰漱口30s，并用其沖洗取樣部位的牙齒、牙齦及口腔粘膜，用消毒好的無菌牙鉗拔除患牙。實驗組乳牙立即用無菌刀片及剪刀分離根尖部粘連的肉芽組織，對照組乳牙經牙體再次沖洗后，用鋒利的無菌車針開髓，用蒸餾水沖洗髓腔，然后使用消毒過的拔髓針取出牙髓。將兩組樣本做好標記，置于無菌EP管中，立即凍存[8〗。

1.3 樣本處理

用低轉速設備進行組織樣本勻漿，之后把樣本分成兩份，一份用于病毒DNA提取，另一份用于總RNA提取。提取出的DNA或RNA懸于100μL蒸餾水中，分別取出5μL用于PCR分析。

1.4 引物及DNA擴增

用Oligoware 1.0軟件進行引物設計和分析，引物由上海生工合成。用50μL體系進行皰疹病毒PCR檢測，其中包括30pmol上下游引物(上海生工)，2μL Taq DNA聚合酶、1.5mmol/L MgCl2、0.1mmol/L dNTP混合物、5μL 10×反應緩沖液(均購自大連TAKARA公司)和5μL DNA樣本。PCR程序如下：94℃預變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，72℃末次延伸10min，33個循環。用感染和未感染的人外周血白細胞作為HCMV和EBV的陽性和陰性對照。

1.5 RNA提取及逆轉錄

參照EZ-RNA總RNA分離試劑盒(BioInd，Kibbutz Beit-Haemek，Israel)使用說明書從勻漿組織樣本中提取總RNA，用于檢測細胞因子基因轉錄物。用50μL RT混合物進行RT-PCR反應，其中包括10IU RT(Fermentas)，0.15mmol/L dNTP混合物，10μL 5×反應緩沖液(Fermentas)。42℃孵育之后，PCR程序同上。每個PCR分析均設置空白對照(蒸餾水)和陽性對照(質粒)，并用管家基因GAPDH作為內參。

1.6 結果檢測

PCR擴增產物在含有0.5μg/mL溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠上進行瓊脂糖凝膠電泳。條帶強度在凝膠成像分析系統(BioRad Laboratories，Hercules，CA)軟件上進行比較。

1.7 統計學方法

用SPSS 13.0統計分析軟件進行，計數資料用率或者百分比表示，采用卡方檢驗；兩組之間PCR檢測結果比較，采用Mann-WhitneyU檢驗；HCMV和EBV與細胞因子表達相關性，采用Spearman秩相關檢驗。檢驗水準取α=0.05。

2 結果

2.1 兩組人類巨細胞病毒和Epstein-Barr病毒表達情況

從結果可以看出，HCMV和EBV在所有對照組的樣本中都沒有陽性表達，而兩者在實驗組樣本中卻有較高的陽性表達率。對于HCMV來說，有11例實驗組樣本檢測呈陽性，檢出率為73.3%，與對照組相比，χ2=17.368，P<0.05，差異具有顯著性意義；對于EBV來說，有10例實驗組樣本檢測呈陽性，檢出率為66.7%，與對照組相比，χ2=15.000，P<0.05，差異具有顯著性意義。見表1、表2和圖1。

圖1 HCMV和EBV在兩組中的電泳結果

Fig.1 Electrophoretogram of HCMV and EBV in two groups

2.2 兩組細胞因子的表達情況

從結果可以看出，TNF-α、γ-IFN、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-12在對照組的所有樣本中都沒有陽性表達，而在除了編號5和12的兩例實驗組樣本外，這些細胞因子在實驗組樣本中都有很高的陽性表達。與對照組相比，TNF-α(U=15.372，P<0.05)、γ-IFN(U=16.014，P<0.05)、IL-1β(U=13.833，P<0.05)、IL-6(U=10.416，P<0.05)、IL-10(U=12.105，P<0.05)和IL-12(U=11.961，P<0.05)在實驗組中的表達均呈現出顯著性差異。除此之外，在HCMV和EBV陽性表達的實驗組樣本中，TNF-α、γ-IFN、IL-1β和IL-12也相應地陽性高表達，這表明HCMV和EBV與這些細胞因子的表達均有明顯的正相關。見表3和表4。

注：nd表示未檢出。

表4 HCMV和EBV與細胞因子之間的相關性

Table 4 Correlation between HCMV and EBV and cytokines

3 討論

3.1 人類巨細胞病毒和Epstein-Barr病毒參與乳牙根尖周炎的發病機理

Sunde等(2008年)研究指出，HCMV和EBV的感染可參與到邊緣及根尖周炎的發病過程中。Hernádi等[9]發現EBV DNA在根尖周炎病損的發生率要明顯高于HCMV的發生率。Li等(2009年)發現與健康對照樣本相比，EBV的DNA和RNA在原發性根尖周炎、治療性根尖周炎和不可復性牙髓炎中的發生率顯著性增高。然而，在往的研究中，HCMV在根尖周炎的發生率在0%～15.9%之間，而在本研究中，該病毒在兒童的乳牙根尖周炎中卻有比較高的檢出率。同時，在無病變乳牙的正常牙髓組織中，本研究沒有檢測到HCMV和EBV的陽性，這也與以往研究相一致[9]。兩者相比之下，推測HCMV和EBV可能參與了兒童乳牙根尖周炎的發病過程當中。除此之外，很多以往的研究都是采用普通的PCR技術進行病毒的定性檢測，而本研究采用了實時熒光定量PCR技術對病毒及細胞因子的表達進行定量，以便于分析其表達量是否與兒童乳牙根尖周炎的發病機理密切相關。

3.2 細胞因子的存在加劇根尖周炎的炎癥反應

該研究發現HCMV和EBV能誘導細胞因子在病變乳牙的肉芽組織中高表達，兩者呈正相關。這提示病毒感染之后，會導致細胞大量分泌和釋放炎癥因子，從而加重整個炎癥反應過程。病毒DNA的存在預示著HCMV和EBV寄生于宿主細胞，其RNA的存在則表明其正在進行活躍的轉錄。HCMV和EBV在細胞間黏附分子表達，細胞粘附、激活核因子κB以及生成大量的細胞因子和趨化因子如TNF-α、γ-IFN、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10、IL-2的反應過程中發揮著很明顯的作用[7,10]。同時，皰疹病毒也會激發宿主產生一系列反應，甚至會導致吞噬細胞和白細胞功能異常，降低機體抵抗病毒入侵的免疫反應。以往研究發現，HCMV感染會刺激促炎癥因子IL-6、IL-12、IL-1β、TNF-α、γ-IFN等的生成。EBV感染也會刺激IL-1受體拮抗劑、IL-1β、IL-8、γ-IFN、TNF-α等的生成。特別是IL-6、γ-IFN和TNF-α具有高效的抗病毒活性。

通常，非特定菌群的多種細菌也會普遍存在于正常、無癥狀的以及有癥狀的根尖周。因此，細菌的感染也可能作為一個輔助因素來誘導細胞因子的表達，從而在乳牙根尖周炎的發病機理中發揮作用。但本研究并沒有對細菌感染進行檢測，主要關注于HCMV和EBV感染所引起的后果。

3.3 總結

本研究發現，在兒童乳牙根尖周炎的疾病中，伴隨有HCMV和EBV的感染，而病毒感染會導致促炎癥細胞因子的表達水平大大提高，兩者之間具有明顯的正相關性。這些病毒的感染及其誘導的組織破壞性細胞因子可能是兒童乳牙根尖周炎發生、發展的因素之一，它們在該疾病的發病機理中起重要作用。

[1]Hernádi K, Szalmás A, Mogyorósi R,etal. The prevalance of herpesviruses in human apical periodontitis samples[J]. Fogorv Sz,2012,105(4):135-140.

[2]Jakovljevic A, Andric M. Human cytomegalovirus and Epstein-Barr virus in etiopathogenesis of apical periodontitis: a systematic review[J]. J Endod,2014,40(1):6-15.

[3]Ozbek S M, Ozbek A, Yavuz M S. Detection of human cytomegalovirus and Epstein-Barr Virus in symptomatic and asymptomatic apical periodontitis lesions by real-time PCR[J]. Med Oral Patol Oral Cir Bucal, 2013, 18(5): e811-e816.

[4]Ferreira D C, Paiva S S, Carmo F L,etal. Identification of herpesviruses types 1 to 8 and human papillomavirus in acute apical abscesses[J]. J Endod,2011,37(1):10-16.

[5]Hernádi K, Gy?ngy?si E, Mészáros B,etal. Elevated tumor necrosis factor-alpha expression in periapical lesions infected by Epstein-Barr virus[J]. J Endod,2013,39(4):456-460.

[6]Sabeti M, Kermani V, Sabeti S,etal. Significance of human cytomegalovirus and Epstein-Barr virus in inducing cytokine expression in periapical lesions[J]. J Endod,2012,38(1):47-50.

[7]Jakovljevic A, Knezevic A, Karalic D,etal. Pro-inflammatory cytokine levels in human apical periodontitis: Correlation with clinical and histological findings[J]. Aust Endod J,2015,41(2):72-77.

[8]曾令芳.乳牙尖周病損中HCMV和EBV片段表達的研究[D].山東:山東大學, 2010:4-8.

[9]Hernádi K, Szalmás A, Mogyorósi R,etal. Prevalence and activity of Epstein-Barr virus and human cytomegalovirus in symptomatic and asymptomatic apical periodontitis lesions[J]. J Endod,2010,36(9):1485-1489.

[10]Rechenberg D K, Bostanci N, Zehnder M,etal. Periapical fluid RANKL and IL-8 are differentially regulated in pulpitis and apical periodontitis[J]. Cytokine,2014,69(1):116-119.

[專業責任編輯：趙東方]

Expression of cytokines induced by HCMV and EBV in children’s deciduous teeth with periapical periodontitis

MA Guan-li1, CAI Zhang-cheng2, HU Wei-jie3, DONG Yan4

(1.DepartmentofStomatology,ChineseMedicineOrthopedicsHospitalofXiaoshanDistrictofHangzhouCity,ZhejiangHangzhou311200,China;2.DepartmentofStomatology,FirstPeople’sHospitalofLongwanDistrictofWenzhouCity,ZhejiangWenzhou325000,China;3.DepartmentofStomatology,People’sHospitalofTiantaiCountyofTaizhouCity,ZhejiangTaizhou317200,China;4.DepartmentofProstheticDentistry,SecondAffiliatedHospitalofMedicalCollegeofZhejiangUniversity,ZhejiangHangzhou310009,China)

Objective To study the expressions of human cytomegalovirus (HCMV) and Epstein-Barr virus (EBV) and the expressions of tumor necrosis factor α (TNF-α), γ-interferon (γ-IIFN), interleukin (IL)-1β, IL-6, IL-10 and IL-12 induced by them in children’s deciduous teeth with periapical periodontitis. Methods A total of 15 deciduous teeth with severe root apex disease were collected, and periapical granulation tissues were obtained to serve as experimental group. Meanwhile, a total of 15 normal deciduous teeth were collected, and pulp tissues were gained to serve as control group. Primers were designed and synthesized, and polymerase chain reaction (PCR) was conducted to detect the expressions of HCMV, EBV and cytokines. Results There were significant differences in the expressions of HCMV (χ2=17.368,P<0.05) and EBV (χ2=15.000,P<0.05) between experimental group and control group, and the differences in expressions of cytokines including TNF-α, γ-IFN, IL-1β, IL-6, IL-10 and IL-12 were also significant between two groups (Uvalue was 15.372, 16.014, 13.833, 10.416, 12.105 and 11.961, respectively, allP<0.05). In periapical granulation tissue samples, there was a remarkable positive correlation between herpesvirus (HCMV and EBV) and the expressions of TNF-α, γ-IFN, IL-1β and IL-12 (rvalue ranged 0.289-0.664, allP<0.05). Conclusion HCMV and EBV as well as the tissue-destructive cytokines induced by them may play an important role in the pathogenesis of children’s deciduous teeth with periapical periodontitis.

human cytomegalovirus (HCMV); Epstein-Barr virus (EBV); cytokines; polymerase chain reaction (PCR); periapical periodontitis

2015-09-06

馬貫立(1985-)，男，住院醫師，主要從事口腔臨床相關工作。

董 研，博士后/主任醫師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.06.005

R781.34

A

1673-5293(2015)06-1122-04