亞甲基四氫葉酸還原酶多態性與早期妊娠丟失風險的關系研究

楊文方，樊 靜，李丹陽，王 翔，姚 屹，王加麗，曾令霞，于學文，張昌寧

(1.西安交通大學第一附屬醫院，陜西 西安 710061；2.中國疾病預防控制中心婦幼保健中心，北京 100081；3.西安交通大學醫學部，陜西 西安 710061；4.西安市衛生和計劃生育委員會，陜西 西安 710021)

亞甲基四氫葉酸還原酶多態性與早期妊娠丟失風險的關系研究

楊文方1，樊 靜1，李丹陽1，王 翔1，姚 屹2，王加麗1，曾令霞3，于學文1，張昌寧4

(1.西安交通大學第一附屬醫院，陜西 西安 710061；2.中國疾病預防控制中心婦幼保健中心，北京 100081；3.西安交通大學醫學部，陜西 西安 710061；4.西安市衛生和計劃生育委員會，陜西 西安 710021)

目的 探討亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因C677T位點多態性與早期妊娠丟失風險的關系。方法 采用PCR-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)方法檢測232例妊娠13+6周之內曾有不良孕史及先兆流產史的患者(病例組)和369例孕前檢查的正常婦女(對照組)MTHFRC677T基因多態性。結果 不良孕史及先兆流產史患者MTHFRC677T位點3個基因型多態性與對照組有顯著性差異(χ2=37.768，P<0.05)；與CC基因型個體相比，TT 基因型的個體發生早期妊娠丟失的風險高達3.596倍(OR=3.596，95%CI: 2.232～5.794)，CT基因型的個體發生早期妊娠丟失的風險為3.277倍(OR= 3.277，95%CI: 2.137～5.026)。病例組T等位基因頻數分布顯著高于C 等位基因頻數分布(57.1% vs. 40.1%，χ2=33.094，P<0.05,OR=1.988，95%CI: 1.571～2.517)。結論 MTHFR C677T突變可能是早期妊娠丟失的遺傳易感性因素。

亞甲基四氫葉酸還原酶；基因多態性；不良孕史；先兆流產史

亞甲基四氫葉酸還原酶(methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR)是葉酸和同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)代謝的關鍵酶，與DNA甲基化和合成密切相關。MTHFR基因的突變會引起酶活性有所降低，結果使葉酸水平降低，血漿Hcy濃度升高，導致一系列病理的改變引發代謝綜合征[1]。妊娠期高同型半胱氨酸血癥已是許多妊娠相關疾病的一個獨立危險因素，如神經管缺陷、胎盤早剝或血栓栓塞、子癇前期和不明原因的復發性流產等[2]。本研究采用PCR-限制性片段長度多態性方法檢測西安交通大學第一附屬醫院優生門診就診患者 MTHFRC677T基因多態性，以探討其與早期妊娠丟失風險的關聯性。

1 臨床資料及方法

1.1 資料來源

按知情同意原則，選擇收集2013年3月至2014年7月西安交通大學第一附屬醫院優生門診就診，曾經在妊娠早期有過不良孕史和先兆流產史的患者232例為病例組，年齡為20～43歲，平均年齡(28.41±3.62)歲；隨機選擇同期正常孕前檢查者(經臨床檢查排除自然流產史、早產史、宮內死胎和妊娠高血壓疾病等病史)369例為對照組，年齡為20～42歲，平均年齡(28.75±3.69)歲。所有研究對象均來自西北地區，年齡為20～43歲，平均年齡(28.62±3.66)歲。病例組和對照組之間，年齡無顯著性差異，具有可比性(t=1.108，P>0.05)。

1.2 病例組的納入和排除標準

妊娠早期不良孕史：在妊娠13+6周內，至少曾經發生過一次自然流產、稽留流產(包括復發性流產)。排除夫婦染色體異常、子宮畸形、宮頸機能不全。

妊娠早期先兆流產史：在妊娠13+6周內，曾確診為先兆流產，但經過治療后，繼續妊娠超過13+6周。

1.3 實驗方法

抽取患者空腹外周靜脈血2mL于EDTA抗凝管中待提取DNA。用人全血DNA提取試劑盒(上海百傲科技股份有限公司)提取DNA后，存放于-20℃冰箱用作下一步實驗。MTHFR基因型測定采用PCR-芯片雜交顯色試劑盒(上海百傲科技股份有限公司)檢測MTHFR基因型。PCR擴增引物序列如下:上游5'-CAAAGGCCACCCCGAAGC-3'和下游5'-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3'，反應體系25μL:1mmol/L MgCl2、dNTP200μmol/L、正反引物各0.5 μmol/L、TaqDNA聚合酶2 U、模板DNA5 μg。PCR擴增條件如下:94℃5min，94℃30s，56℃40s，72℃40s，35個循環，末次延伸5min。取10uLPCR反應產物進行雜交顯色，然后用芯片識讀儀讀取患者基因型。

1.4 統計學處理

采用SPSS 18.0軟件進行統計分析，計數資料采用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗，基因頻率采用基因計數法計算，以P<0.05為具有統計學顯著性意義。

2 結果

2.1 研究對象的亞甲基四氫葉酸還原酶分布頻率

MTHFR基因多態位點3種基因型在對照組和病例組之間的分布頻率不同，差異有統計學意義(χ2=37.768，P<0.05)，見表1。病例組T 等位基因頻數分布與C 等位基因頻數分布見表2。

表1 對照組與病例組MTHFR C677T基因型頻率與等位基因頻率的分布[n(%)]

Table 1 Genotypic and allelic frequencies of MTHFR C677T between case group and control group [n(%)]

表2 對照組與病例組MTHFR C677T等位基因頻率的分布[n(%)]

Table 2 Allelic frequency of MTHFR C677T between case group and control group [n(%)]

2.2 亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性與早期胚胎丟失的關系

表1結果提示，MTHFR基因位點多態性和不良孕史及先兆流產史顯著相關。TT基因型的個體發生早期妊娠丟失的危險度顯著增高，是CC基因型個體的3.596倍(OR=3.596，95%CI: 2.232～5.794)，CT基因型是CC基因型個體的3.277倍(OR=3.277，95%CI: 2.137～5.026)。TT與CT 基因型頻數比較差異無顯著性(χ2=0.205，P=0.651)。表2結果提示，T 等位基因是不良孕史及先兆流產史發生的危險因素，病例組T等位基因頻數分布顯著高于C 等位基因頻數分布(57.1% vs. 40.1%，χ2=33.094，P<0.05,OR=1.988，95%CI: 1.571～2.517) 。

3 討論

3.1 亞甲基四氫葉酸還原酶缺陷是神經管缺陷及不明原因妊娠丟失的危險因素

血液高凝狀態與不良孕史和先兆流產史的發生密切相關。高同型半胱氨酸血癥易造成血管內皮損傷，導致血栓形成，是近年發現的血液高凝狀態形成的重要原因之一。Hcy代謝酶的基因突變引起缺陷或活性下降從而導致Hcy升高。人類的MTHFR基因位于染色體1p36.3，整個編碼區長1 980bp，包含11個外顯子，長度從102～432bp不等，內含子250～1.5kb，MTHFR是在同型半胱氨酸甲基化代謝途徑中起關鍵酶作用。MTHFR催化5，10-亞甲基四氫葉酸生成5-甲基四氫葉酸，從而使甲基轉移至鈷胺素，生成的5-甲基四氫葉酸可以為同型半胱氨酸提供甲基形成蛋氨酸。MTHFR C677T基因有3種基因型：CC是正常或野生型，CT是雜合子，TT是突變型。目前研究發現，MTHFR基因第4外顯子的C677T堿基突變最為常見，MTHFR基因第677 位密碼子胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)置換，從而使一個高度保守的丙氨酸(Ala)變成了纈氨酸(Val)，使MTHFR活性降低，并產生不可耐熱性，從而引起Hcy在血漿中的蓄積[3]。低葉酸和高同型半胱氨酸水平與妊娠并發癥如低出生體重嬰兒、早產、先兆子癇、死胎、以及反復妊娠丟失有關。它們也與先天性畸形，如神經管缺陷、馬蹄內翻足、心臟缺陷、肢體缺陷、唇腭裂、和唐氏綜合征7相關[4]。近幾年研究者發現流產發生的一個重要原因與蛻膜絨毛缺血性壞死有關[5]。

3.2 MTHFR基因多態性與早期妊娠丟失的關系特點

鐘慧軍等[6]研究發現，中國寧夏地區漢族人口MTHFR677C→T突變與復發性流產危險性之間有相關性，帶有TT基因型的個體發生復發性流產的危險度明顯增高，是CC基因型個體的8.44倍。病例組T等位基因頻率高于C等位基因頻率，差異具有顯著性。張家穎等[7]研究發現，病例組MTHFR C677T 位點CC、CT 和TT基因型頻數與對照組比較差異具有顯著性，TT與CC基因型頻數分布比較差異具有顯著性，TT 與CT 基因型頻數比較差異無顯著性，病例組T 等位基因頻數與C等位基因頻數比較差異具有顯著性。本研究結果發現，MTHFR基因多態位點3種基因型在對照組和病例組之間的分布頻率不同，差異有統計學意義(P<0.05)。帶有TT基因型的個體發生早期妊娠丟失的危險度增高，是CC基因型個體的3.596倍(OR=3.596，95%CI: 2.232～5.794)。CT基因型是CC基因型個體的3.277倍(OR=3.277，95%CI: 2.137～5.026)。但是TT與CT 基因型頻數比較在病例組與對照組之間無顯著性差異(P>0.05)。病例組T 等位基因頻數分布與C 等位基因頻數分布比較差異有顯著性(P<0.05)，與鐘慧軍等[6]及張家穎等[7]報道的結果一致。本文已確診的不良孕史和先兆流產史患者與正常孕前檢查者進行對比分析，結果表明不良孕史和先兆流產史患者突變等位基因頻率與純合突變基因型頻率均明顯高于對照組，證明亞甲基四氫葉酸還原酶基因的多態性可能是早期妊娠丟失的一個遺傳風險因素，值得進一步研究。

[1]Yang B, Fan S, Zhi X,etal. Associations of MTHFR C677T and MTRR A66G gene polymorphisms with metabolic syndrome: A case-control study in Northern China[J]. Int J Mol Sci, 2014, 15(12): 21687-21702.

[2]Cao Y, Zhang Z, Zheng Y,etal. The association of idiopathic recurrent early pregnancy loss with polymorphisms in folic acid metabolism-related genes[J].Genes Nutr,2014, 9(3): 402.

[3]Anderson C A, Beresford S A, McLerran D,etal. Response of serum and red blood cell folate concentrations to folic acid supplementation depends on methylenetetrahydrofolate reductase C677T genotype: results from a crossover trial[J].Mol Nutr Food Res, 2013, 57(4): 637-644.

[4]Summers C M,Mitchell L E, Stanislawska-Sachadyn A,etal. Genetic and lifestyle variables associated with homocysteine concentrations and the distribution of folate derivatives in healthy premen opausal women[J].Birth Defects Res A Clin Mol Teratol, 2010, 88(8): 679-688.

[5]白慧健,馬太芳,李釗,等.胚胎血紅蛋白基因變異與自然流產的相關性研究[J].吉林醫學,2011,32(36):7689-7690.

[6]鐘慧軍,劉軍紅,朱永生,等.MTHFR C677T基因多態性與復發性自然流產的相關性研究[J]. 寧夏醫學雜志,2010,32(8):675-676.

[7]張家穎,左文靜,武廣恒,等.MTHFR 基因C677T 多態性與習慣性流產的關聯性分析[J]. 吉林大學學報(醫學版),2009,35(4):698-701.

[專業責任編輯：韓 蓁]

Association between MTHFR C677T and risk of early pregnancy loss

YANG Wen-fang1, FAN Jing1, LI Dan-yang1, WANG Xiang1, YAO Yi2, WANG Jia-li1, ZENG Ling-xia3, YU Xue-wen1, ZHANG Chang-ning4

(1.FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710061,China;2.ChineseCenterforDiseaseControlMaternalandChildHealthCenter,Beijing100081,China;3.HealthScienceCenter,Xi’anJiaotongUniversityShaanxiXi’an710061,China;4.Xi’anHealthandFamilyPlanningCommission,ShaanxiXi’an710021,China)

Objective To discuss the relationship between methylene tetrahydrofolate reductase (MTHFR) C677T and early pregnancy loss risk. Methods PCR-RFLP method was used to detect the MTHFRC677T gene polymorphism of 232 patients with adverse pregnant history or threatened abortion history within 13+6week (case group) and 369 normal women checked before pregnancy (control group). Results There was significant difference in the polymorphism of three genotypes of MTHFRC677T site between case group and control group (χ2=37.768，P<0.05). The risk of early pregnancy loss among the patients with TT gene type significantly increased and reached to 3.596 times compared with CC gene type (OR=3.596， 95%CI: 2.232-5.794), and that among patients with CT gene type showed 3.277 times (OR= 3.277，95%CI: 2.137-5.026). The allelic frequency of T was significantly higher than C in case group (57.1% vs 40.1%，χ2=33.094，P<0.05,OR=1.988，95%CI: 1.571-2.517). Conclusion MTHFR C677T mutation might be the genetic susceptibility factor leading to early pregnancy loss.

methylene tetrahydrofolate reductase (MTHFR); gene polymorphism; adverse pregnant history; threatened abortion history

2015-12-02

中國疾病預防控制中心婦幼保健中心資助項目(2015FYJ002)；西安市衛生和計劃生育委員會資助項目(HX201549)

楊文方(1972-)，女，副主任醫師，主要從事優生與出生缺陷研究工作。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.06.007

R714.2

A

1673-5293(2015)06-1128-03