腦缺血灌注損傷的相關細胞通路調節研究進展

樊鴻浩, 李茹冰

(廣州軍區廣州總醫院藥劑科, 廣東 廣州 510010)

腦缺血灌注損傷的相關細胞通路調節研究進展

樊鴻浩, 李茹冰

(廣州軍區廣州總醫院藥劑科, 廣東 廣州 510010)

腦缺血灌注損傷主要指缺血腦組織恢復血液灌注后，腦組織損傷加重的病理現象。涉及缺血再灌注損傷后的相關細胞分子通路十分廣泛，如NF-κB通路、酸敏感離子通路、超極化激活環核苷酸門控陽離子通路、絲裂原激活蛋白激酶通路、基質金屬蛋白酶通路和水通道蛋白通路等，其主要參與再灌注損傷機制包括基于炎癥、凋亡相關通路調節機制；基于鈣離子作用相關通路調節機制；基于細胞凋亡通路調節機制以及腦水腫變化的通路機制。本文擬總結主要參與腦缺血再灌注損傷后的細胞分子通路及其作用機制，為進一步了解再灌注損傷機制提供參考。

腦缺血再灌注; 酸敏感陽離子通道; 基質金屬蛋白酶; 絲裂原激活蛋白激酶; 水通道

腦缺血灌注主要為缺血腦組織恢復血液灌注后，腦組織損傷反而加重，電鏡觀察表現為腦微血管內皮細胞固縮，內皮細胞連接間隙和通透性增加，部分可見連接內皮細胞的基質和基膜缺失、膠質細胞偽足腫脹、進行性退變和微血管腔狹窄等[1]。目前研究已經證實，導致腦缺血再灌注后損傷作用的直接原因主要有自由基生成增多、鈣離子超載、興奮氨基酸過度釋放、蛋白酶通路激活和內皮細胞黏附因子表達等。目前臨床仍無有效的治療缺血性腦損傷方法，主要因于缺血再灌注損傷涉及細胞通路及作用機制十分廣泛并互相交叉，而單一的藥物干預治療無法有效減輕腦缺血再灌注損傷[2]。因此，本文回顧總結國內外缺血再灌注后細胞分子通路的變化，深入了解腦再灌注損傷后分子作用機制，為開發新的藥物靶點提供參考。

1 基于炎癥和凋亡相關的NF-κB通路調節

研究已經表明，核轉錄因子NF-κB參與了腦缺血再灌注后的血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)破壞，NF-κB具有多向性調節作用，從成熟B淋巴細胞的核抽提物中檢測到的一種能與免疫球蛋白κ輕鏈基因增強子上一段10 bp的核苷酸序列(GGGACCTTTCC)特異結合的核蛋白[3]。NF-κB隸屬Rel蛋白家族，包括 p50(NF-κBl), p65(Rel-A), RelB, C-Rel和p52 (NF-κB2)，其以同源或異源二聚體形式組成NF-κB，以p50/p65異源二聚體最為常見，也以RelA(p65)最為深入研究。在正常非激活狀態下，RelA(p65)與IκB蛋白結合，不表現轉錄功能，并滯留在胞漿中。當中樞神經系統發生某些病理改變時，IκB的上游激酶(IκB-kinase，IKK)磷酸化而被特異性激活。IKK使IκB降解，由于p50有核定位信號，缺少IκB的束縛，p50/p65將往細胞內傳遞。RelA(p65)可識別特定的DNA序列，并與之結合，從而調控靶基因的轉錄。NF-κB分布在內皮細胞、神經元、神經膠質細胞、腦室壁和血管壁平滑肌上，其表達情況與腦缺血再灌注高度相關，普遍認為腦缺血再灌注6 h后，BBB上NF-κB激活達高峰，并呈動態調節過程[4]。腦缺血再灌注后，腦內皮細胞產生大量自由基，攻擊生物膜，誘發內皮細胞NF-κB表達，NF-κB通路激活傳遞細胞核內相應炎癥靶基因轉錄，同時基膜的損害也加劇BBB的完整性缺失。研究表明，NF-κB表達是一種快速的適應性反應，與胞漿內對NF-κB 的活化有抑制作用的蛋白IκB，包括IκBα, IκBβ, IκBγ, IκBδ, IκBε和Bcl-3等相互調節[5]。因此，缺血再灌注發生后，合理調整NF-κB與IκBα結合的平衡，對維持BBB正常功能、保護腦神經細胞具有重要的臨床意義。NF-κB通路廣泛涉及缺血再灌注后機體損傷機制。動物實驗顯示，某些中藥成分，如皂苷類、黃酮類、有機酸、酚類、生物堿和萜類等中藥活性成分都發現在腦缺血再灌注的大鼠模型中顯示一定的保護作用[6]，這些活性成分多數具有抗氧化和抗炎癥的自身特質。Zhang 等[7]發現，厚樸酚能減少炎癥因子生成，如一氧化氮、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和大鼠正常T細胞表達和分泌因子，可減輕大鼠缺血再灌注模型中腦損傷，保護腦神經細胞，其保護機制可能通過抑制神經膠質細胞NF-κB通路活性。體內外實驗也顯示，厚樸酚具有良好的抗炎作用。炎癥反應貫穿整個缺血再灌注發生過程，抗炎因子通路有望成為再灌注損傷保護的靶點。Cui等[8]報道，丙泊酚(異丙酚, propofol)通過NF-κB/P53信號途徑能減輕缺血再灌注后的神經損傷，下調P53蛋白水平表達，同時抑制自噬相關基因和微管相關蛋白1輕鏈表達，顯示NF-κB通路激活與自體吞噬和凋亡相關作用。可見，NF-κB通路的激活與缺血再灌注后的炎癥發生、自噬凋亡、氧化反應和自由基攻擊互相聯系，與腦再灌注損傷密切相關。然而缺血再灌注發生后，BBB通透性雖有所改變，藥物靜脈注射后是否能有效穿透顱內卻仍然有待探索。Feng 等[9]使用電針刺激治療缺血再灌注大鼠模型中顯示良好的預后結果，電針刺激百會穴和神庭穴能下調凋亡相關基因Bax和Fas表達，抑制神經細胞凋亡，減少腦梗死面積，通過刺激此兩穴能抑制大鼠腦細胞NF-κB通路激活。電針刺激穴位法有望在臨床上應用。

2 基于Ca2+相關的酸敏感離子通道及超極化激活環核苷酸門控陽離子通道調節

關于酸敏感離子通道(acid sensing ion channels, ASIC)在腦缺血再灌注作用機制的研究相對較早。ASIC廣泛分布于哺乳動物的外周和中樞神經系統中，有4個功能基因編碼，分別為ASIC1，ASIC2，ASIC3和ASIC4。ASIC作為酸性的傳感器通道，在正常腦組織氧化代謝產物更新轉換和維持正常細胞功能微環境上具有重要的作用[10]。正常狀態下細胞內外pH維持需要ASIC通道輸運氫離子調節，腦缺血再灌注后，組織炎癥，BBB完整性破損等病理過程都能誘發細胞和組織代謝功能障礙，以厭氧性葡萄糖代謝為主的代謝性酸積累，導致細胞內pH值明顯下降[11]，缺血重度損傷時，pH值降至7.10±0.04，pH變化大小與缺血后灌注處理，如時間間隔和灌注血量明顯相關[12]。細胞內氫離子增多能損傷神經細胞，以ASIC受體誘發的細胞鈣離子超載最為嚴重，鈣離子通道與ASIC相互關聯，在腦缺血再灌注研究中，越來越受到重視。更有人認為，神經細胞內鈣離子超載才是腦缺血再灌注后神經組織不可逆損傷的關鍵因素[13]。早期研究就已經證實，局部缺血后引起組織酸化，ASIC通道被激活并轉運鈣離子進入細胞內[14]，鈣離子流向胞內過程可能由鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase, CaMK)介導。程慧嫻等[15]建立大鼠全腦缺血再灌注模型后，利用ASIC阻斷劑狼蛛毒素阻斷ASIC轉運氫離子，發現ASIC阻斷劑能減輕大鼠全腦缺血再灌注損傷，同時提示其抗損傷作用與CaMKⅡ表達下調有關，這意味著ASIC阻斷劑極可能通過減低胞內鈣離子濃度來減輕神經細胞損傷。CaMKⅡ是Ca2+的一個重要靶酶，CaMKⅡ在腦組織含量非常豐富，尤其在海馬區中，調節機體記憶和神經活動[16]。病理條件下，細胞內Ca2+超載可激活CaMKⅡ產生磷酸化，引起磷酸化的CaMKⅡ增多累積，這種級聯反應可破壞細胞離子平衡，由于Ca2+內流增加生成更多的自由基, 誘發更多溶酶體溶解和酶的釋放, 并加重磷酸鹽和蛋白酶對膜的破壞, 最終損傷神經細胞和組織[17]。近年來，腦缺血再灌注后引起細胞超極化激活環核苷酸門控陽離子通道(hyperpolarization-activated cyclic-nucleotide-gated channel，HCN)變化也備受關注。HCN主要影響動作電位發放的頻率重要通道之一，包括HCN1，HCN2，HCN3和HCN4 4種亞型，HCN在學習記憶功能，炎癥痛，竇房結缺血再灌注保護都發揮著重要作用[18-19]。在神經元及心肌細胞中，由電壓依賴性的鈣離子內流作為誘導動作電位產生起點，參與其神經遞質釋放和心肌收縮的過程，而HCN通道早期已經被證實能通過激活神經元的起搏離子通道易化動作電位引起細胞分泌[20]。文獻報道，應激條件下HCN通道可增強大腦神經元鈣離子內流，改變其可塑性及興奮性遞質釋放，引起興奮性損傷，這可能是癲癇發作發生的原因之一[21-22]。黃維等[ 23]應用膜片鉗技術和熒光測鈣技術證實，大鼠大腦內存在鈣離子依賴性的神經遞質分泌，并通過腺嘌呤核苷酸受體調控的HCN通道，有可能參與機體感覺信息傳遞。He等[24]利用低劑量HCN通道阻斷劑4-(N-乙基-N-苯氨基)-1,2-二甲基-6-(甲氨基)嘧啶氯化物，即ZD7288處理氧糖剝奪的海馬細胞，抑制動作電位依賴性的長時效增強(long-term potentiation，LTP)，該過程可抑制由LTP相關的興奮遞質釋放激活系統，減輕其興奮性毒性, 并減少突觸后致密物質-95表達。實驗結果表明， ZD7288可改善海馬神經元突觸塑型，保護海馬神經。然而，盡管目前仍沒有直接證據表明腦缺血再灌注后HCN通過增加鈣離子內流，誘發神經元興奮毒性，參與缺血再灌注損傷的分子機制。但前期實驗已表明，HCN通道參與缺血再灌注損傷的興奮性調節過程，而鈣離子作為腦神經元興奮的信使之一，很有可能通過誘導興奮性遞質釋放或鈣離子超載參與HCN通道調控機制。杜雅瑩等[25]觀察發現，假手術組HCN1 mRNA表達百分率為0.95±0.13，而單純缺血組為0.21±0.03，缺血再灌注2 h組為0.43±0.02，缺血再灌注6 h為0.27±0.07，缺血再灌注24 h為0.59±0.09，提示HCN可能參與腦缺血再灌注后保護作用進程，缺血再灌注6 h后表達最低，與前文所述的腦缺血再灌注6 h后BBB上NF-κB激活高峰時間相一致，亦是腦缺血再灌注的最為嚴重的時間點，HCN表達與缺血再灌注保護強度的相關性需要進一步研究。

3 基于細胞凋亡通路的絲裂原激活蛋白激酶通路

絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)存在整個中樞神經系統中，MAPK參與調節細胞生長和發育等過程，可被各種細胞因子、神經遞質因子和應激反應等條件激活。在真核生物中，MAPK信號通路包括細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)通路、c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)通路、P38通路和ERK5通路。這些通路都與缺血再灌注損傷密切相關，以MAPK激酶(MEK)/ERK通路研究最多。MEK1/2是MAPK的一員，分子質量依次為44和45 ku，而ERK1/2為MEK1/2下游蛋白，分子質量依次為44和42 ku。MEK/ERK通路調節細胞生長和分化過程，當Raf被激活后，能與MEK1/2結合，激活MEK1/2催化區第217位和221位絲氨酸磷酸化，并激活ERK，被激活的 ERK進入細胞核后，啟動一些即早基因的表達如c-jun和c-fos等，表達的c-jun和c-fos蛋白以異二聚體或c-jun同二聚體(即 AP-1轉錄因子)形式結合到AP-1啟動子結合位點，誘導細胞周期蛋白D、 細胞周期蛋白E、 細胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase 2， CDK2)和CDK4等基因轉錄與翻譯，促進細胞從G1期進入 S期。活化的ERK 能夠磷酸化并滅活P27和P21等細胞周期抑制蛋白，刺激細胞的增殖；活化的ERK 能夠抑制胱天蛋白酶的激活，并可以誘導一些抗凋亡因子的表達，如內質網跨膜蛋白需肌醇酶1和凋亡蛋白抑制因子，而胱天蛋白酶的激活可以裂解維持細胞生存的蛋白，從而導致細胞死亡。研究表明，MAPK通路參與腦缺血再灌注后腦神經細胞凋亡途徑，當腦缺血發生時，腦組織中的神經元細胞處于缺血缺氧的條件時，神經元細胞會發生自噬和凋亡。Zhan等[26]通過延遲缺氧后處理在成年大鼠中可減少缺血后神經細胞損傷，其神經細胞保護作用與激活Akt/FoxO通路和抑制MEK/ERK通路激活相關。Wang等[27]也發現，MEK/ERK通路的抑制可減少缺血區中促炎因子白細胞介素1(interleukin-1，IL-1)表達，對保護局灶性缺血發揮重要作用，保護機制可能通過抑制下游Elk-1磷酸化，進一步減少IL-1β的mRNA生成，但不通過下調TNF-α、IL-1α或趨化因子巨噬細胞炎癥蛋白-α表達。可見MEK/ERK通路激活后級聯的下游因素非常廣泛，并涉及到凋亡途徑，炎癥反應過程。事實上，MEK/ERK通路并非孤立，它與其他的轉導途徑相互交叉聯系，如 PI3K/AKT 通路、JNK通路、糖原合酶激酶-3(glycogen synthase kinases-3β， GSK3β)通路和胱天蛋白酶3等。JNK通路是其中一支重要的促凋亡通路，與缺血再灌注損傷有著密切聯系。JNK信號通路介導的細胞凋亡機制可活化c-Jun/AP1，上調促凋亡蛋白表達，如Bcl-2家族蛋白；活化p53和p73，引起p53/73依賴性凋亡。Wu 等[28]在心肌缺血再灌注模型中發現， JNK抑制劑SP600125預處理后的心肌再灌注模型，明顯增強離體心臟收縮力，減少缺血面積和乳酸脫氫酶活性，同時減少凋亡率，而ERK1/2抑制劑PD98059單獨使用卻效果不佳；更有趣的是，PD98059處理后能增加JNK表達，SP600125能激活心肌再灌注模型的ERK1/2通路，顯示心肌再灌注模型中 JNK通路可能處于ERK1/2通路上游位置，并共同調節細胞凋亡方向。由此可見，細胞凋亡涉及的轉導途徑互相交叉影響，單一的細胞分子信號通路阻斷治療，并無法有效治療再灌注損傷。中藥成分多具有抗氧化、抗炎癥或抗凋亡作用，這為尋找有效治療缺血性腦損傷藥物提供一定參考思路。黃芩苷、紫草素、小檗堿(黃連素)和川穹等中藥成分都被表明具有抗凋亡或抗氧化作用，如利用碘化丙啶顯示缺血區的細胞死亡情況，證實小檗堿能減少細胞死亡數量，提高神經細胞存活率；Western蛋白印跡分析結果表明，Akt的蛋白質、GSK3β、ERK和JNK蛋白都參與其神經保護過程，而小檗堿20 μmol·L-1能有效抑制胱天蛋白酶3活化，具有良好的神經保護作用[29]。然而中藥有效成分十分復雜，難以明確藥物作用具體靶點，同時藥效成分是否能較好通過血腦屏障，這些都是阻礙中藥成分應用于臨床的原因之一。因此，藥物開發應更多注重中藥有效成分提取工藝的優化及藥物分子結構的簡化。

4 基于腦水腫變化的蛋白金屬酶通路和水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)

基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)是一組鋅依賴性蛋白水解酶，具有降解多種細胞外基質成分的功能， 具有不同程度的特異性。再灌注損傷發生后，最初的表現往往為腦水腫，其中與之密切相關的通路是MMP-9/MMP-2通路和AQP5水通路。 腦缺血及再灌后已經表明，MMP的表達明顯增高，尤其是MMP-2和MMP-9活性增加，這與腦微血管通透性、BBB通透性、BBB的崩潰、炎性細胞侵入和腦水腫明顯相關。MMP-2和MMP-9作為明膠酶類最為顯著的特征，能夠激活多種促炎因子如IL-8、IL-1β和TNF-α產生。此外， MMP-9更參與基膜主要成分-Ⅳ型膠原蛋白的消化和緊密連接蛋白消化，可促進白細胞跨內皮或血漿蛋白透過，破環顱內滲透性平衡，進一步促進腦水腫[30]。Smimbo等[31]認為，再灌注引起的損傷是由中性粒細胞高度表達MMP-9和髓過氧化酶，生成大量活性氧破環細胞膜，引起腦水腫；使用脂質體血紅蛋白動脈灌注療法可減輕缺血區大鼠的神經損傷，其保護機制可能由于血紅蛋白灌注能減緩缺血區內滲透平衡，而血紅蛋白參與了活性氧的消除過程。也有學者使用褪黑素注射缺血模型組大鼠發現，褪黑素能夠減少MMP-9表達，抑制明膠酶活性，保護基膜完整性，維持顱內外滲透平衡，減少腦水腫，其保護效果與MMP-9基因敲除后大鼠效果并無統計學差異，提示MMP-9阻斷劑有可能作為新型的藥物靶點對早期腦水腫產生起有重要預防和治療作用[32]。有人認為，MMP-9早期參與腦缺血再灌注后腦水腫的形成及再灌注損傷，而MMP-2可能主要參與后期組織修復及壞死組織清除[33]。Piao等[34]研究也表明，腦缺血后2 h MMP-9活性升高，損傷后6 h顯著增強，48 h后達到高峰，而72 h后恢復到基線水平；相比之下MMP-2在6 h后才檢測出活性上調，72 h后才達到高峰并持續7 d，提示MMP-2在腦損傷后6 h后才會參與BBB通透性調節，這結果和國內研究結果一致[35]。當然，也有學者通過MMP-2基因敲除大鼠在缺血1 h后再灌注模型中發現，Ⅳ型膠原蛋白和細胞閉合蛋白完整性相對野生型對照組好，水腫程度、出血量和梗死面積也大量減少，側面說明MMP-2也參與了早期腦水腫的形成及再灌注損傷[36]。因此筆者認為，MMP-2和MMP-9都有可能參與早期腦損傷機制，其中MMP-9為早期主要參與者，而MMP-2主要參與后期繼發性損傷和神經修復過程。腦水腫調節通路中還存在其他通路，研究較多的通路還有AQP水通道，AQP為疏水特性的小分子蛋白家族，其分子質量介于26～34 ku之間。迄今為止，人們在哺乳類動物已經發現13種AQP，并廣泛分布在機體組織和細胞膜中，介導水分子進出細胞過程。AQP4是由4個獨立的具有活性的亞單位組成異聚體結構，存在于腦星形膠質細胞，腦表面的軟腦膜、 腦室系統的室管膜、 脈絡叢、 下丘腦的視上核和室旁核等中，AQP4參與了腦再灌注損傷后初期減緩腦水腫形成，其可能機制是，再灌注后細胞間隙中K+、H+和谷氨酸等興奮性氨基酸濃度上升，激活蛋白激酶C對AQP4進行磷酸化反應，從而在一定程度上減少經由破壞的血腦屏障進入腦組織細胞間隙, 以及經膠質細胞膜進入細胞內的水分子的量，進而減緩腦水腫[37]。抑制AQP4 表達或功能的藥物能限制人類細胞毒性腦水腫，但是 AQP4 基因敲除會使血管源性腦水腫加劇。在細胞毒性水腫中 ，AQP4 基因敲除會使水進入大腦的速率降低， 但是在血管源性水腫中 AQP4 敲除還會使水從大腦中轉移出的速率下降。因此，AQP4在轉基因小鼠中過度表達會加劇細胞毒性腦腫脹，然而AQP4 基因沉默可以誘導神經膠質瘤細胞的凋亡，抑制AQP4表達后膠質瘤細胞Bcl-2表達減少，可能為誘導瘤細胞凋亡的機制[38]。近年來， AQP8和AQP9發現廣泛表達在腎、肝和腦組織線粒體內膜上，并顯示可能通過釋放細胞色素c來參與線粒體腫脹調節機制，線粒體腫脹進一步誘發凋亡刺激物產生。前期研究也顯示，AQP4表達量與細胞色素c釋放量呈負相關，提示AQP4的促凋亡作用還可能誘導細胞色素c釋放引起線粒體腫脹，誘導凋亡刺激物產生[39]。

5 展望

參與腦缺血再灌注損傷的細胞通路或機制還有WNt通路、細胞黏附分子和內質網應激等，由于缺血再灌注損傷涉及體內分子通路或機制十分廣泛并互相影響和級聯，在早期研究中White等[2]已證實，單用胱天蛋白酶抑制劑可抑制細胞凋亡進程，卻無法解釋其抗脂質過氧化作用和快速修復細胞轉錄功能作用，相反，同樣適用于抗氧化物質的抗氧化作用和抑制凋亡進程關系。他們表示單一的藥物干預無法進行有效的治療，并提出聯合治療設想：包括恢復細胞轉錄功能、抑制凋亡進程、減少自由基產生和抑制蛋白降解的聯合治療方案。如按廣泛性的細胞通路或機制看聯合方案十分明確和合理，然而在缺血再灌注后細胞分子信號通路變化并不是同時發生。Shaller等[40]認為，腦缺血階段主要為氧化應激和炎癥為主導的通路調節，而再灌注階段為細胞轉錄抑制和細胞凋亡為主導的通路調節。因此，認識各階段腦缺血再灌注損傷后BBB通透性的分子通路機制具有非常重要的意義。不僅如此，據前文所述，筆者認為中藥藥物開發及中醫療法，如電針刺激穴位法在對日后臨床治療和預后方面同樣具有臨床應用價值。

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(本文編輯: 喬 虹)

Cerebral ischemia-reperfusion injury and related cellular signalpathways: research advances

FAN Hong-hao, LI Ru-bing

(DepartmentofPharmacy,GeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand,Guangzhou510010,China)

Cerebral-ischemia reperfusion injury refers to cerebral tissue exacerbation injury after blood perfusion is restored in ischemic area. The related cellular pathways involved in ischemia reperfusion are varied, such as NF-κB signal pathway, acid sensing ion channels, hyperpolarization-activated cyclic-nucleotide-gated, MAPKs signal pathway, Matrix metalloproteinases and AQP4. The main mechanism that participates in reperfusion injury involves the cellular pathway based on inflammation reaction and apoptosis, pathway based on calcium interaction, pathway based on cell apoptosis and the one based on brain edema. This article is intended to summarize the changes of cellular signal pathways and their mechanisms in ischemia reperfusion injury, thus shedding light on the injury mechanism after cerebral ischemia reperfusion.Key words: ischemia reperfusion; acid sensing ion channels; matrix metalloproteinases; mitogen-activated protein kinases; aquaporins

LI Ru-bing, E-mail: lrb90927@126.com, Tel: (020)88654670

廣東省教育部產學研結合項目(2012B09- 1100170)

樊鴻浩(1989-), 男, 碩士研究生, 主要從事藥理學及新藥研究。

李茹冰, E-mail: lrb90927@126.com, Tel: (020)88654670

Foundation item: The project supported by Ministry of Education Combination Project of Industry and Research of Guangdong Province(2012B091100170)

2014-07-03 接受日期: 2014-11-22)

R972

A

1000-3002(2015)02-0310-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2015.02.020

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