附子炮制品水煎液對比格犬心臟急性毒性研究

張 雪 宋玉琴 楊雨婷 賀 抒 謝曉芳彭 成

成都中醫藥大學藥學院／中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137

附子炮制品水煎液對比格犬心臟急性毒性研究

張 雪 宋玉琴 楊雨婷 賀 抒 謝曉芳*彭 成

成都中醫藥大學藥學院／中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137

目的：比較附子不同炮制品 （刨附片、炮天雄、黑順片）對比格犬的心臟急性毒性的影響。方法：比格犬16只，隨機分為空白對照組、刨附片組、炮天雄組、黑順片組，按照4g生藥／kg灌胃比格犬濃縮液，檢測灌胃前和灌胃后1h，1d、3d、7d和14d后比格犬體重、體溫變化和心電圖心率變化，并測定血液中乳酸脫氫酶 （LDH）和肌酸激酶同工酶 （CK－MB）的含量。結果：給藥后1h內黑順片組犬出現嘔吐，其余組未觀察到癥狀；給藥后14d內比格犬體重、體溫正常，給藥組乳酸脫氫酶和肌酸激酶同工酶含量，心電圖心率與空白組相比，差異無統計學意義 （P＞0.05）。結論：刨附片，炮天雄，黑順片水煎液按照4g生藥／kg給犬灌胃，沒有明顯心臟毒性。

刨附片；炮天雄；黑順片；比格犬；急性毒性

附子為毛茛科（Ranunculaceae）植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.的子根的加工品［1］。附子始載于《神農本草經》，味辛、甘，性大熱，有毒，被譽為 “亂世之良將，回陽救逆之第一品，補命門真火第一要藥”。但因其性剛烈迅捷，歷代醫家及本草著作皆言附子 “有毒”，用之不當，易出現嚴重的毒副作用［2］。研究表明附子主要活性成分為二萜類生物堿，包括雙酯型、單酯型和脂性生物堿。其中雙酯型生物堿毒性最大［3－4］，其毒性主要作用于中樞神經系統、心臟、和肌肉組織［5］。因此如何合理使用附子成為研究熱點?！侗静輪柎稹酚涊d，“四川彰明縣采制附子，必用鹽腌，其腌附子之鹽，食之毒人至死，并無藥可解，可知附子之毒甚矣。然將腌附子之鹽，放于竹筒中用火煅過，則無毒，入補腎藥，又溫而不烈，反為良藥”。表明附子經加工炮制后，可降低毒性，便于內服，為回陽救逆第一品，廣受醫生和患者青睞。目前，附子作為一種中藥商品，其最大的特點在于規格較多，不同的商品體現了精湛復雜的產地加工和炮制技術，一些炮制品甚至被制備藥膳或外形美觀的保健食品，如炮天雄、刨附片等。為了確保附子炮制品的安全使用，本實驗就附子的炮制品刨附片、炮天雄及黑順片 （大中張）的水煎液對比格犬的心臟急性毒性進行研究。

1 材料與儀器

1.1 動物 比格犬，雌雄各半，7.5～10.0kg，7～8月齡，由四川養麝研究所比格犬繁育中心提供，動物質量合格證號SCXK（川）2009－01。檢疫后備用。

1.2 藥物 刨附片、炮天雄、黑順片（大中張）飲片，均由四川省好醫生藥業有限公司提供，均按以下方法制備水煎液：第一次以10倍量水煎5個h，過濾后再以8倍量水煎3h，混合兩次水煎液，濃縮。試驗前各藥物均濃縮成4.0g生藥／m l。

1.3 試劑 乳酸脫氫酶（LDH，批號：130706）、肌酸激酶同工酶（CK－MB，批號：228320）試劑盒均由上海華臣生物試劑有限公司提供。

1.4 儀器 7180型全自動生化分析儀（日本日立）；ACCESS型全自動化學發光分析儀（德國貝克曼公司）；PC－80B型快速心電檢測儀 （深圳科瑞康實業有限有公司）；電子體溫計。

2 方法

2.1 分組與給藥 經預試無法測定各試驗藥物灌胃比格犬的LD50，故進行最大給藥量測定。取健康、合格比格犬16只，適應性飼養1周。隨機分為4組，即空白組、刨附片組、炮天雄組、黑順片組，每組4只犬，雌雄各半。給藥前禁食不禁水12h，測定體重、肛溫、心電圖 （肢體II導聯）。然后灌胃給藥，其中空白組給予蒸餾水，其余各給藥組給予相應藥液4g生藥／kg，給藥體積均為20ml／kg。然后密切觀察犬的活動、對外界反應、分泌物等一般狀態，隨后常規飼養14d，每日觀察1次。并于給藥后1h及1、3、7、14d時測定體重、肛溫和心電圖變化，同時取血測定血清中LDH、CK－MB含量。

2.2 統計學方法 數據以SPSS 17.0統計軟件包建立數據庫后，采用配對t檢驗對同組動物給藥前后進行比較，采用單因素方差分析比較組間的變化。P＜0.05表示有統計學差異。

3 結果

3.1 對比格犬一般狀態的影響 觀察給藥后犬的活動，發現3個給藥組犬在給藥后短時間內表現為精神不振或煩躁，尤其以黑順片組犬表現明顯，且黑順片組3只犬均出現不同程度嘔吐，在給藥后10～20min出現，為白色泡沫；隨后未見明顯異常反應，進食正常；其余組未觀察到嘔吐癥狀，進食正常。

3.2 對比格犬體重和肛溫的影響 附子不同炮制品灌胃后比格犬后經過14d的觀察，發現附子不同炮制品組和空白組的犬體重基本保持同步增長的變化，與空白組相比，未見統計學差異。給藥后藥物對比格犬肛溫基本無影響，結果見表1和表2。

表1 刨附片、炮天雄和黑順片水煎液對比格犬體重的影響 （kg，±s）

組別 n 給藥前給藥后70±0.49 8.90±0.34刨附片 4 8.08±1.04 8.16±1.08 8.36±1.24 8.37±1.14 8.11±0.98 8.38±1.12炮天雄 4 8.05±0.74 8.21±0.76 8.28±0.72 8.25±0.80 7.99±0.48 8.37±0.58黑順片 4 8.87±0.46 8.95±0.50 8.95±0.54 8.97±0.66 8. 1h 1d 3d 7d 14d空白 4 8.65±0.40 8.75±0.39 8.79±0.44 8.89±0.52 8. 84±0.25 8.87±0.42

表2 刨附片、炮天雄和黑順片水煎液對比格犬肛溫的影響 ±s，℃）

組別 n 給藥前給藥后49 38.45±0.66 38.20±0.50刨附片 4 38.53±0.46 38.98±0.26 39.00±0.33 38.60±0.59 38.08±0.22 38.28±0.15炮天雄 4 38.48±0.30 38.80±0.34 38.90±0.24 38.63±0.28 38.40±0.29 37.97±0.64黑順片 4 38.58±0.21 38.78±0.29 38.73±0.36 38.48±0. 1h 1d 3d 7d 14d空白 4 38.35±0.34 38.78±0.46 38.70±0.35 38.40±0. 36 38.30±0.35 38.15±0.30

3.3 對比格犬心電圖的影響 刨附片、炮天雄、黑順片水煎液對比格犬的心電圖心率影響不大，其中刨附片組在給藥1小時后心率顯著加快（P＜0.05），其余組變化不顯著（P＞0.05）；給藥后14d刨附片組與空白組相比Q－T波明顯延長，有統計學差異（P＜0.05）；其余各組的犬Q－T波沒有明顯差異（P＞0.05）。結果見表3、4、5。

表3 刨附片、炮天雄和黑順片水煎液對比格犬心率的影響 （次／分，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05。

組別 n 給藥前給藥后.00±14.07 104.00±23.99 92.50±17.56刨附片 4 120.00±19.24 127.75±8.34* 116.75±7.27 120.75±11.70 106.00±6.48 108.75±14.08炮天雄 4 108.75±20.27 114.25±6.95 113.50±25.41 103.50±22.05 106.25±19.36 111.25±29.30黑順片 4 103.00±5.35 90.25±20.66 101.00±11.16 97.0 1h 1d 3d 7d 14d空白 4 117.50±11.90 105.50±16.11 99.75±17.33 111 0±16.69 98.00±17.30 92.50±10.25

表4 刨附片、炮天雄和黑順片水煎液對比格犬心電圖QRS波的影響 （mv，±s）

組別 n 給藥前給藥后29±0.18 1.22±0.21刨附片 4 1.26±0.10 1.22±0.12 1.07±0.30 1.26±0.10 1.27±0.21 1.29±0.16炮天雄 4 1.00±0.38 1.12±0.42 1.11±0.26 1.10±0.46 1.13±0.43 1.10±0.48黑順片 4 1.12±0.38 1.10±0.33 1.15±0.40 1.05±0.32 1. 1h 1d 3d 7d 14d空白 4 1.09±0.16 1.11±0.11 1.03±0.20 1.10±0.24 1. 21±0.34 1.17±0.36

表5 刨附片、炮天雄和黑順片水煎液對比格犬心電圖Q－T波的影響 （s，±s）

注：與空白組相比，**P＜0.01。

組別 n 給藥前給藥后24±0.02 0.25±0.02刨附片 4 0.29±0.04 0.28±0.01 0.27±0.02 0.28±0.04 0.28±0.02 0.31±0.03**炮天雄 4 0.21±0.03 0.24±0.04 0.21±0.05 0.23±0.04 0.24±0.05 0.23±0.03黑順片 4 0.21±0.03 0.24±0.04 0.22±0.01 0.21±0.02 0. 1h 1d 3d 7d 14d空白 4 0.24±0.03 0.25±0.05 0.24±0.03 0.23±0.01 0. 21±0.03 0.23±0.02

3.4 對比格犬血清LDH、CK－MB的影響 比格犬被給藥后血清中的LDH含量有變化，但組間比較都沒有顯著統計學差異，其中黑順片的乳酸脫氫酶含量在給藥后1h，1d和14d均低于空白組，未見統計學差異（P＞0.05）；而空白組和刨附片組和炮天雄組犬血清內肌酸激酶同工酶穩定，黑順片組比格犬的肌酸激酶同工酶在給藥后隨著時間的推移逐漸降低，與空白組相比，未見統計學差異 （P＞0.05），具體如表6、7。

表6 刨附片、炮天雄和黑順片水煎液對比格犬血清LDH含量的影響 （U／L，±s）

給藥后組別 n 00±69.56刨附片 4 119.25±62.10 226.50±201.47 147.25±87.74 177.00±87.01炮天雄 4 140.25±104.21 107.25±79.87 74.50±17.37 110.00±28.60黑順片 4 64.75±6.45 71.25±9.18 91.75±30.08 90.50±1 1h 1d 3d 14d空白 4 114.75±63.47 95.75±35.50 75.25±13.84 142. 0.63

表7 刨附片、炮天雄和黑順片水煎液對比格犬血清CK－MB含量的影響 （U／L，±s）

給藥后組別 n 3.30±1.95 2.63±0.97 2.93±0.73 3.00±1.79刨附片 4 2.88±1.57 2.33±1.10 2.45±1.21 3.00±0.67炮天雄 4 2.85±1.35 2.03±0.43 2.83±0.92 2.55±0.77黑順片1h 1d 3d 14d空白4 4 4.28±3.56 3.73±0.66 1.98±0.62 1.55±0.25

4 討論

附子為有毒中藥，其毒性主要是由雙酯型烏頭類生物堿引起。研究表明2.5mg／m l以上濃度烏頭堿可影響體外大鼠胚胎生長發育和器官形態分化，誘發以心臟和神經系統為主的器官畸形，加入體外代謝活化系統S9可以減輕烏頭堿對大鼠胚胎的毒性作用［6］。經炮制、水煎、合理配伍等，雙酯型烏頭類生物堿含量下降，毒性也明顯降低。因此，臨床應用通常選擇附子的炮制品，而附子的炮制品種類也逐漸增多。附子在加工中，由于藥材使用的用途、方式的不同形成了不同的藥材商品規格，按照臨床使用情況分為可直接使用和半成品兩大類。而直接使用的附子商品又按照使用目的的不同，其加工方式也不一樣。臨床處方使用多為黑順片、白附片等，制備藥膳或保健食品多為外形美觀的加工品，如炮附子 （炮天雄）、刨附片等［7］。研究發現，附子水煎醇沉液 （酯型生物堿烏頭堿的含量為0.0364%）給小鼠灌胃，LD50為31.24g／kg，換算成人臨床用量為240.31g／d。給藥后即可見部分動物躁動不安、呼吸增強、頭部顫動繼而全身抽搐，繼而蜷臥，體表溫度下降，直至死亡。鏡檢可見中毒死亡小鼠肝臟、腎臟呈暗紅色，心肌有輕微瘀血，內有少量積液，其余未見異常［8］。黑順片水煎液按15、30、45、60、75、90g／kg的劑量給小鼠灌胃，連續10d，60g／kg以上劑量組能使小鼠死亡率顯著增加，中毒反應較多且較嚴重，對心電圖也有一定影響，對肝有一定損傷，還可顯著降低血尿素氮［9］。但研究集中在3種炮制品對小鼠的急毒情況，現本實驗主要探究其對犬的心臟急性毒性。

附子急性心臟毒性反應表現特點為：先出現心率加快和心律不齊，皮膚、尾、足墊發紅，體熱，心前區搏動明顯加快；逐漸轉為體涼，唇爪、尾部、耳、足墊蒼白，唇爪發紺；最后心前區搏動減弱，心率減慢，死亡［10］。本實驗為探討和比較附子不同炮制品 （刨附片、炮天雄、黑順片）對比格犬的急性心臟毒性，采用標準工藝煎煮刨附片、炮天雄、黑順片，其水煎液濃度濃縮為4.0g生藥／m l，按照4g生藥／kg劑量灌胃比格犬，擬人劑量為160g／次（人以60kg計），除黑順片組可觀察到嘔吐外，其余組未出現明顯反應，在灌胃一次后14d內比格犬的體溫體重均正常，各組犬心電圖心率均沒有明顯差異，對血液中乳酸脫氫酶和肌酸激酶同工酶也沒有顯著影響，說明這3種附子的炮制品刨附片、炮天雄、黑順片安全性高，在劑量為4g／kg時，附子炮制品刨附片、炮天雄、黑順片對比格犬未見明顯心臟毒性，而刨附片和炮天雄相比黑順片在等劑量時安全性更高，這可能與炮制工藝相關。

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Studies on the Acute Toxicity of Aconitum Carmichaeli Debx Processed products Decoction in Heart of Beagle Dogs

Zhang Xue Song Yuqin Yang Yuting He Shu Xie Xiaofang*Peng Cheng
Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research Development and Utilization of Chinese Medicine Resources，Sichuan Province And Ministry of Science and Technology，Chengdu 611137，China

ObjectiveTo investigate and compare the different processed Aconitum carmichaeli（Paofupian，PaoTianxiong，Heishunpian）for acute cardiac toxicity in beagle dogs.Methodssixteen Beagle dogs，random ly divided into control group，Paofupian group，PaoTianxiong group，Heishunpian group，according to the 4 g crude drug／kg gavaging to Beagles，observe fourteen days，and detect theweight，temperature changing and ECG heart rate and blood lactatemeasurements dehydrogenase and creatine kinase MB before administration and atone hour、one day、three day、seven day、fourteen day after administration.Resultswithin one hour after administration，heishunpian group dogs bagan to vomite，the symptomswere notobserved in other groups；fourteen days after administration Beagle dogs’sweight，temperature are normal，comparing the administration groups to the control group，the lactate dehydrogenase and creatine kinase isoenzyme content，ECG heart rate have no significant difference.Conclusionthe different processed Aconitum carmichaeli（Paofupian，PaoTianxiong，Heishunpian）decoctions according 4g／kg orally to fill beagle dog’s stomach，have no significant cardiac toxicity.

Paofupian；PaoTianxiong；Heishunpian；beagle dog；acute toxicity

R285.1

A

1007－8517（2015）16－0021－03

2015.05.11）

國家“973”項目，基于西部道地藥材的創新藥物研究（2012CB723502）；國家科技支撐計劃項目，西南區域附子、燈盞花等大宗中藥材質量標準提高及其綜合利用（2011BAI13B05）。

張雪，女，碩士研究生，專業中藥藥理學，從事中藥藥理與毒理研究。

謝曉芳，女，博士，助理研究員，研究方向為中藥藥理與毒理研究。E－mail：xxfl4544＠163.com