酶聯免疫吸附試驗定量檢測血清肝素酶方法的應用價值

朱 妍朱 葉于 蕾郭海燕*

（1 長春醫學高等專科學校基礎醫學部中心實驗室，吉林 長春 130031；2 長春市中心血站血液檢測實驗室，吉林 長春 130000；3吉林省腫瘤醫院，吉林 長春 130012）

酶聯免疫吸附試驗定量檢測血清肝素酶方法的應用價值

朱 妍1朱 葉2于 蕾3郭海燕3*

（1 長春醫學高等專科學校基礎醫學部中心實驗室，吉林 長春 130031；2 長春市中心血站血液檢測實驗室，吉林 長春 130000；3吉林省腫瘤醫院，吉林 長春 130012）

目的 通過酶聯免疫吸附試驗定量檢測血清肝素酶，對腫瘤患者及健康患者的血清肝素酶進行比對分析，探討此種方法的應用價值。方法 分別選取50名健康患者和50例腫瘤患者的血清，通過雙夾心免疫吸附試驗的方法，檢測其肝素酶水平。結果 通過檢測血清中肝素酶D450nm值，由結果顯示腫瘤患者要大于健康患者。結論 酶聯免疫吸附試驗可以輔助臨床對腫瘤疾病進行診斷，而且方法可靠，靈敏度高，有較高臨床價值，值得推廣應用。

酶聯免疫吸附試驗；血清肝素酶；定量檢測；應用價值

肝素酶是可以使肝素及乙酰肝素分子的多糖裂解的一種內源性的β-葡萄糖苷內切酶。它既包括微生物裂解肝素及硫酸乙酰肝素，也包含動物體內通過水解產生內源性的硫酸乙酰肝素酶類。肝素酶能夠特異性辨識乙酰類肝素多糖上的硫酸肝素側鏈，從而破壞細胞及血管的完整性，發揮相應的作用，而且可以使存在其側鏈上的生長季趨化因子及酶分子等有活性物質進行釋放，這在腫瘤的出現及發展的進程中起到相關的作用。近些年來，通過免疫等手段進行肝素酶表達的檢測，可以得出包括白血病在內的惡性腫瘤患者，檢測其體內肝素酶的水平及活性程度，均比健康人的值要高，尤其是腫瘤處于轉移階段，其值明顯增高。這一病理現象可以幫助臨床采取相應手段進行腫瘤輔助的診斷。但就目前的研究狀況，沒有統一標準的相應檢測試劑，但就免疫組化等檢測方法相對比，對患者采用血清肝素酶輔助判斷疾病，對機體傷害相對較小，操作也相對簡便，為此，摸索出既簡單靈敏度又高的肝素酶檢測方法對國內肝素酶的探討及研究具有十分重要的意義［1］。本組就針對2013年7月至2014年7月，健康患者和腫瘤患者的血清各50例，通過雙夾心免疫吸附試驗的方法，檢測其肝素酶水平，其臨床資料如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：本組選擇在2013年7月至2014年7月，通過臨床檢查確診為腫瘤的患者50例，進行腫瘤標志物進行篩查是陰性，其中男性28例，女性22例，年齡在32～66歲，平均年齡49歲。肺癌21例，胃癌14例，肝癌15例。選取健康的志愿者50名，其中男性27名，女性23名，年齡36～69歲，平均年齡52.5歲，經過檢查健康狀況良好，經過其同意可以進行接下來的檢測。獲得的樣品均當天采集后進行離心處理。

1.2 雙夾心免疫吸附試驗步驟

1.2.1 制備過程：將鼠的抗肝素酶單克隆抗體包被于pH值為9.6的Na2CO3-NaHCO3的緩沖溶液中，從中取出50 μL的液體置于96孔酶標板中，在4 ℃條件下放置18 h，并用pH值為7.4的磷酸緩沖溶液反復沖洗干凈，置于有20 g/LBSA的磷酸鹽緩沖液進行96孔酶標板封閉1 h，隨后反復沖洗3～5次后，處于4 ℃環境下保存待用。

1.2.2 反應過程：在96孔酶標板中分別加入200 μL的血清樣品，相同血清樣品重復做三個，在室溫環境下放置2 h，隨后反復沖洗5次后，在向其中加入兔的抗肝素酶多克隆抗體100 μL，處于室溫環境下放置2 h，反復沖洗5次。將100 μL稀釋到20000倍的HRP標記羊抗兔IgG置于酶標板微孔中，在室溫環境下放置1 h，最后加入TMB顯色底物50 μL放置半個小時，隨后用硫酸100 μL結束反應進程。在D450 nm及D603 nm條件下應用酶標儀進行檢測。

1.2.3 酶聯免疫吸附試驗方法及其作用原理。①酶聯免疫吸附試驗的基本原理：酶和相應的抗體及抗抗體分子進行共價結合，共價鍵的結合特點就是不影響及改變抗體的免疫學性質，對生物學性質也不產生妨礙。被酶標記抗體可以和被吸附在相應載體上的抗原抗體進行連接。在上述溶液中加入底物，酶可以使底物的沒有顏色的還原型的供氫體轉變成有顏色的氧化型的狀態，呈現出顏色的變化來反應體系的進程。為此可觀察反應體系的顏色變化來判斷免疫反應是否發生。在反應體系中，呈現出的顏色深淺程度和樣品中的抗體抗原的量有關，相應的抗原抗體量多，反應的顏色就較深。這種顏色深淺的變化可以通過酶聯免疫吸附試驗的檢測儀器來定量測定檢測［2］。②酶聯免疫吸附試驗，在免疫技術中應用廣泛，其常用方法有雙抗體夾心法及間接法，雙抗體夾心法主要應用于分子量大的抗原檢測，間接法多用于特異性抗體的測定。雙抗體夾心法主要分為四個步驟，首先要進行特異性的抗體和載體想結合，反復洗滌去除雜質，然后加入需要檢測的樣品，并使之平衡一段時間，目的是使樣品中的抗原和相應的抗體結合上，同樣需要洗滌掉未結合的抗體以及雜質等。第三步需要加入酶標物，使上述免疫結合物的抗原和酶標物進行連接，同樣進行洗滌的步驟清除雜質。酶量和樣品中的要進行檢測的物質量有關系。最后將底物反應變成有色的物質，并根據顏色的深淺程度對進行定量判斷［3］。

1.4 統計學處理：選用SAS統計軟件分析處理實驗數據，對每個樣品的3個重復實驗計算平均值及標準偏差，對穩定性進行評估。分析健康患者血清D值的狀況，腫瘤患者血清D值的狀況，對兩組的血清肝素酶的水平進行對比，比較其差異水平，確定此種方法對血清肝素酶的檢測對輔助腫瘤的臨床價值。

2 結 果

對每個樣品平行測定三次進行平均值的計算，并計算微孔間的標準差都＜0.019，且相對標準偏差也要＜9.0%，從統計結果來看檢測方法穩定，可靠。經過數據處理：50名健康志愿者的血清肝素酶的D值呈現正態分布趨勢，其平均值是0.094，處于95%置信區間內其范圍在0.067～0.106。50例腫瘤的患者，血清肝素酶的D值也呈現正態分布趨勢，平均值是0.178，處于95%置信區間內其范圍在0.152～0.191。經兩組數據進行比較，存在顯著性差異，通過對血清肝素酶D值的檢測，腫瘤患者的D值要比健康志愿者的D值明顯增高。

3 討 論

肝素酶和腫瘤的產生及變化有著密切的關系，尤其腫瘤處于轉移階段的患者體內肝素酶的水平和腫瘤的動態變化息息相關。為此，對腫瘤患者血清肝素酶的有效檢測，可以輔助腫瘤的診斷，用于評價其惡化程度。但就目前的研究狀況來說，因為血清中的肝素酶的存在量很低，而且又存在特異性的免疫性質，反應性好的抗體價格很高，限制了此種方法的發展。現在，在國內及國外市場上并沒有相應的檢測試劑盒，相關的研究報道也很少見。因此，研究一個可以有效的檢測血清肝素酶的辦法對肝素酶的發展起到很重要的作用［4］。搭建靈敏度高，重現性好的酶聯免疫吸附試驗第一個需要解決的問題就是篩選出適合的抗體，本研究綜合考慮了實驗準確率及成本的因素，最終篩選出用鼠抗肝素酶單克隆抗體及兔抗肝素酶多克隆抗體，并采用雙抗體夾心法進行先關研究，最后得到的結果穩定好，重現性也較好。和別的檢測方法比較，此種檢測方法具有材料選擇簡便，操作簡單的優點，而且定量精準，可以影響定量的因素少，對于免疫組化及原位PCR等方法，會因為選取的部位不同，選取的樣品大小不一或是人為的一些因素對檢測的結果影響很大，此兩種方法需要在患者的身體上得到腫瘤的樣本或是一些癌癥組織，進行這樣的處理給患者的身體及心理上造成很大影響，產生較大負擔。采取雙抗體夾心法不僅不會給患者帶來身體上的傷害及心理上的負擔，還在準確及重現性上體現出自身方法的優點。最重要的是雙抗體夾心方法操作簡單易學，可以動手完成也可以用儀器機械化完成，更有利于腫瘤的篩查。本組對50例腫瘤患者的血清肝素酶水平進行檢測，其水平值顯著高于健康志愿者的血清肝素酶水平值，這一結果和國外對血清肝素酶水平的研究結果趨勢相同，這一結果可以在一定程度上說明可以選擇血清肝素酶代替組織肝素酶的檢測。

酶聯免疫吸附試驗是到目前為止使用最廣的一項技術，特異性的將抗原抗體相結合，并使之酶的催化底物進行有效的結合起來，檢測血清中微量的肝素酶，在操作的過程中需要對樣品進行采集、保存，準備相應的試劑，隨后進行加樣品，顯色比色等步驟，如果其中一個步驟出現人為的操作問題都會影響結果的準確性。顯色這一步驟對酶聯免疫吸附的方法得到的結果影響較大。目前來講，常用的測定顯色物質是四甲基聯苯胺及過氧化氫，在辣根過氧化物酶的作用下，產生顏色的變化。所以，目前把研究重點放在腫瘤患者血清肝素酶水平上的研究是十分有意義的，可以評估患者腫瘤的變化情況，為臨床的診斷提供了很好的參考和有力的依據。

［1］ 田曙光，虞立霞.酶聯免疫吸附試驗定量檢測血清肝素酶方法的建立及應用［J］.生物技術通訊，2009，20（4）:545-546.

［2］ 王曉秋.酶聯免疫吸附試驗在蛋白質/多肽類藥物藥代動力學研究中的應用［J］.中國藥理學與毒理學雜志，2013，27（3）:534-535.

［3］ 尹利民.動力學法在酶聯免疫吸附試驗定量檢測中的應用［J］.檢驗醫學與臨床，2012，9（7）:852-853.

［4］ 李穎，黃永升.比色時間與存放溫度對酶聯免疫吸附試驗結果判讀的影響［J］.檢驗醫學與臨床，2011，8（4）:450-452.

R446.6

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1671-8194（2015）13-0097-02