長鏈非編碼RNA對能量代謝和相關疾病發生發展的作用*

榮 燦，胡 云

隨著高通量測序技術的發展和ENCODE計劃揭示，曾一度被認為是無功能的“轉錄噪音”的非編碼RNA(noncoding RNA，ncRNA)，近年來被證實在細胞分化、生物發育及疾病發生發展過程中發揮巨大作用［1］。其中長鏈非編碼 RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一類轉錄本長度超過200 nt的非編碼RNA，在哺乳動物基因組中，有4% ～9%的序列產生的轉錄本是lncRNA(相應的蛋白編碼RNA的比例是1%)，其中許多lncRNA與人類疾病密切相關，參與調節基因表達、招募染色質修飾物、調節X染色體失活、染色體重組、基因組印記、蛋白質折疊和蛋白質活性等［2］。與微小 RNA(microRNA，miRNA)相比，lncRNA序列更長、空間結構更復雜、信息含量更加豐富，可能是遺傳信息表達調控網絡的一個核心［3-4］。目前lncRNA的功能和作用機制雖然尚不完全清楚，但已有研究顯示lncRNA參與內分泌代謝疾病的發生發展，成為診斷和治療肥胖、糖尿病、高脂血癥等疾病標志物和潛在的治療靶點。本文就lncRNA的生物學功能及其在內分泌代謝疾病研究中的進展作綜述。

1 lncRNA的生物學特性和作用機制

lncRNA是RNA聚合酶Ⅱ轉錄的副產物，位于細胞核或胞質內，缺乏蛋白質編碼功能。根據lncRNA與其相鄰蛋白編碼基因的位置關系，lncRNA可分為正義lncRNA、反義lncRNA、雙向lncRNA、基因內lncRNA和基因間 lncRNA［2］，這種位置關系對于推測lncRNA的功能有很大幫助。lncRNA具有保守的二級結構、剪切形式以及精確的亞細胞定位［5］，在不同組織和發育階段的表達具有特異性［6-7］，這些特征對其在疾病發生中的作用有很重要影響。

lncRNA可通過各種分子機制在X染色體失活、基因印跡、染色體修飾、轉錄、翻譯、蛋白質的活性調控以及RNA的可變剪切調控等過程中發揮著重要的調節作用。研究表明lncRNA的作用方式如下:(1)lncRNA通過招募染色質重構和組蛋白修飾復合體到特定位點，改變DNA/RNA甲基化狀態、染色體結構和修飾狀態，進而控制基因表達。如HOXC基因簇轉錄的lncRNA HOTAIR，會募集染色質修飾復合體PRC2，并將其定位到HOXD基因簇位點，改變該區域的染色質修飾狀態，進而抑制HOXD基因表達［8］。同樣，Xist、Airn 及 Kcnq1ot1 這些 lncRNA 能通過招募相應的重構復合體，實現表觀遺傳學沉默［9-11］。(2)lncRNA通過作為配基，與轉錄因子結合形成復合體，控制基因轉錄活性，如小鼠的lncRNA Evf2，一段轉錄自Dlx5和Dlx6基因間的超保守遠端增強子，它能募集轉錄因子DLX和MECP2蛋白至 Dlx5/6附近，調控 Dlx5、Dlx6和 Gadl的表達［12］。還有一些lncRNA本身就是轉錄因子，如lncRNA HSR1可以同HSF1、eEF1A共同形成復合物，在細胞熱休克應激反應時調節熱休克蛋白表達［13］。(3)lncRNA通過與編碼蛋白基因轉錄本形成互補雙鏈，直接參與到mRNA可變剪切、RNA編輯、蛋白翻譯及轉運等轉錄后調控過程中，如lncRNA Zeb2能夠與HOX位點轉錄的mRNA的一個內含子的5’端剪切位點形成雙鏈，抑制該內含子被剪切［14］，該區域含有Zeb2蛋白表達必須的核糖體結合點，從而增加Zeb2蛋白的表達量。lncRNA BACE1-AS與正義BACE1 mRNA相結合增強BACE1 mRNA的穩定性，從而增加BACE1蛋白的表達量［15］。(4)lncRNA可作為一種競爭性內源性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)與miRNA之間互相調控［16］。在一些腫瘤細胞和特定組織中，lncRNA攜帶有某些miRNA的“種子序列”，像海綿一樣結合miRNA，從而阻止miRNA同其靶mRNA結合［17］。(5)lncRNA可加工產生小分子RNA，作為小分子RNA(如miRNA、piRNA、mascRNA)的前體分子轉錄［18］。

另外，隨著對lncRNA研究越來越深入，研究者也將發現更多lncRNA調控模式。最新研究發現lncRNAs還可以輕易地找到并結合附近的基因，在可重組遺傳物質的幫助下，拉動其它的相關基因，遷移到新的位點，構建起一個“功能空間”(compartment)，在那里許多基因同時受到調控［19］。

2 lncRNA參與調控糖尿病的發生發展

糖尿病是一種由遺傳因素與環境因素相互作用而引起的糖代謝性疾病。目前，已經報道的2型糖尿病基因易感位點有近60個。而Pullen等［20］發現55個2型糖尿病的易感基因位點中，有9個主要SNP位點150 kb范圍內含有胰島 lncRNA，提示lncRNA與糖尿病易感性相關。Morán等［21］檢測了人胰島β細胞基因組轉錄圖譜發現1 128個lncRNAs，Refseq數據庫中具有注釋的基因中只有9.4%是胰島特異性表達的，但是55%的基因間 lncRNA和40%的反義 lncRNA具有胰島組織特異性，這些lncRNA在胚胎胰腺祖細胞時是失活的，在胰島細胞分化和成熟過程中逐漸被激活，推測人類的胰島細胞lncRNA是以高度組織特異模式轉錄的。

胰島β細胞功能缺陷和胰島素抵抗是2型糖尿病的主要發病機制。胰島β細胞位于胰島內，是體內胰島素的唯一來源。Morán等［21］進一步檢測了14個具有胰島細胞特異性lncRNA在2型糖尿病患者胰島β細胞中的表達情況，發現lncRNA HI-LNC25顯著上調，抑制其表達可正向調節胰島轉錄因子GLIS3 mRNA的表達。GLIS3編碼一種胰島轉錄因子，它的突變發生在包括2型糖尿病風險變異位點在內的單基因糖尿病中，提示反義lncRNA能調控人類胰島β細胞單基因疾病的蛋白編碼基因。同樣，細胞周期素依賴性激酶4抑制因子(inhibitor of cyclin-dependent kinase 4，INK4)位點的反義 lncRNA(antisense noncoding RNA in the INK4 locus，ANRIL)作為一個基因敏感位點與冠心病及2型糖尿病密切相關。Jarinova等［22］發現 ANRIL轉錄物與 p15INK4b有很好的相關性，在全血中，ANRIL轉錄物能夠直接影響p15INK4b的表達。而動物模型研究顯示p15INK4b的過表達可引起小鼠胰島發育不全并出現糖尿病癥狀［23］。Cunnington 等［24］發現 lncRNA ANRIL 表達下降與糖尿病相關風險的易感基因突變(rs10811661-T和rs2383208-A)密切相關，其表達下調可以導致糖尿病在內的多種疾病的發生。

迄今發現80%已知的印記基因傾向于成簇分布于16個不同的基因組區域內，進而形成不同的印記基因簇，這些基因簇內包含著來源于不同父母本的多個基因［25］。有趣的是，在目前已知的印記簇內，都包含有lncRNA。一些印記基因編碼與生長因子和能量代謝相關的劑量敏感性蛋白，且與在同一等位基因相連的抑制蛋白質編碼基因表達的lncRNA相關。lncRNA MEG3(maternal expressed gene 3)是小鼠母系印記基因Glt2(gene-trap locus 2)的人類同系物，位于人染色體14q32.3上，長度約為1.6 kb，由10 個外顯子組成［26］。Wallace等［27］發現與 1 型糖尿病相關性最強的SNP rs941576位于14號染色體14q32.28的一個完整印跡區域，而此區域位于lncRNA MEG3的第6個內含子內。進一步研究發現lncRNA MEG3單核苷酸多態性可調節父系表達基因跨膜蛋白delta-like 1(DLK1)和逆轉錄轉座子樣1(retrotransposon-like 1，RTL1)的表達，從而導致1型糖尿病的發生與發展。Kameswaran等［28］發現 lncRNA MEG3在2型糖尿病患者的胰島內表達下調，其表達下調可能與MEG3啟動子超甲基化有關，而MEG3啟動子的超甲基化可能是miRNA-29a調控通路作用的結果［29］，因此miRNA-29a可能通過某種調控通路參與lncRNA MEG3的甲基化，從而導致糖尿病的發生與發展。Kcnq1ot1是由遺傳印記Kcnq1區的一個內含子的印跡控制區父源性非等位基因轉錄而成的、長度為91.5 kb的長鏈反義非編碼RNA［11］。Kcnq1ot1的啟動子在母本染色體上被甲基化而在父本染色體上非甲基化，在父本中Kcnq1ot1 RNA產物與8～10個蛋白質編碼基因的沉默相關聯。Morán等［21］發現2型糖尿病患者胰島β細胞內Kcnq1ot1表達明顯高于正常人，上述研究提示，lncRNA通過參與調控印記基因表達，在一定程度上影響胰島β細胞的功能，可能是人群糖尿病發生發展的遺傳因素之一。

胰島素抵抗主要指胰島素敏感細胞對胰島素介導的葡萄糖攝取及處置的抵抗。胰島素通過與靶器官上特異的胰島素和胰島素樣生長因子受體(insulin-like growth factor receptor，IGFR)結合調節葡萄糖的代謝。目前已有研究發現，lncRNA能夠通過調控IGFR參與調控胰島素信號轉導系統［30］。Keniry等［31］發現lncRNA H19通過加工生成miR-675，抑制胰島素樣生長因子1型受體(IGF-1R)mRNA的翻譯，間接減少IGF-1R的表達。Mutskov等［32］發現用高濃度葡萄糖刺激胰島β細胞后，lncRNA Airn表達上調。進一步研究發現Airn通過折疊胰島素樣生長因子2型受體(IGF-2R)啟動子區域抑制RNA聚合酶Ⅱ的募集，最終抑制IGF-2R表達［33］。此外，Ellis等［34］發現用胰島素和胰島素樣生長因子(IGF)處理大腸癌細胞后，lncRNA CRNDE的核轉錄本表達下降，反之，當干擾lncRNA CRNDE中一段高度保守序列后，細胞內胰島素/IGF信號通路應答受抑制，提示結直腸瘤差異表達轉錄物lncRNA CRNDE可能既受到胰島素/IGF的調節，又反作用于胰島素/IGF信號通路。

上述研究表明，lncRNA在胰島細胞功能和胰島素信號轉導方面起著重要作用，為糖尿病發病機制的研究提供了一個新的方向。

3 lncRNA參與調控脂肪代謝

肥胖是一種遺傳、環境等多種因素所致體內能量過剩而引起機體脂肪總含量過多和(或)局部含量增多及分布異常，并可導致胰島素抵抗、2型糖尿病、高血壓、高脂血癥、冠心病甚至危及生命的慢性代謝性疾病。機體內主要存在2類脂肪組織:白色脂肪組織(white adipose tissue，WAT)以儲存脂肪為主要功能，過多積聚會形成肥胖;棕色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)通過非寒顫性產熱機制，將儲存的脂肪以熱能的形式釋放出來，在機體的能量代謝與體溫維持等生物過程中發揮著重要的作用。

Sun等［35］通過對脂肪細胞分化過程中mRNA及帶polyA尾的長鏈非編碼RNA的表達譜進行了系統分析，發現1 734個編碼基因及175個lncRNAs在白色及棕色脂肪細胞分化過程中被強烈誘導表達，其中有26種lncRNA在棕色和白色脂肪細胞由脂肪前體細胞分化為成熟細胞的過程中上調，敲除其中調控作用最強的10種lncRNA后，成熟脂肪細胞幾乎完全可以去分化為前體脂肪細胞，且脂肪細胞內脂質積累顯著下降。Yi等［36］分析了在3T3-L1細胞脂肪形成過程中帶polyA尾長鏈非編碼RNA的潛在功能，發現一類長度約為136 kb的超長鏈基因間非編碼 RNA(slincRAD)參與脂肪分化，進一步用slincRAD特異性的小干擾RNA使前脂肪細胞中的slincRAD表達沉默后，發現脂滴形成調控因子過氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPARγ)水平降低，脂質積累減少，證實了slincRAD參與脂肪細胞分化過程的作用。Xu等［37］發現PPARγ的共轉錄激活子lncRNA SRA在成熟的白色脂肪組織高表達，參與3T3-L1細胞脂肪脂滴形成，增加脂肪細胞胰島素敏感性及葡萄糖攝取功能，參與調控細胞周期、胰島素和炎癥信號的信號通路。

lncRNA除了可調控白色脂肪的形成外，還參與了棕色脂肪細胞的分化與代謝功能。棕色脂肪細胞表面有腎上腺素受體，細胞內含有大量線粒體。線粒體內膜上的解偶聯蛋白1(uncoupling protein 1，UCP1)可引起線粒體氧化呼吸的電子傳遞和ATP產生解偶聯作用，從而降低脂肪酸氧化代謝的產能效率，大量能量以熱能的形式散發［38］。Zhao等［39］發現棕色脂肪lncRNA 1(Blnc1)作為核lncRNA，通過與轉錄因子EBF2形成核糖核蛋白復合物刺激UCP1基因和線粒體基因的表達，從而促進棕色和米色脂肪細胞分化和功能。另外，研究發現棕色脂肪與骨骼肌細胞有共同的分化來源，都源自Myf5+成肌細胞［40］。而在分化成熟過程中，棕色脂肪和骨骼肌在形態和功能上逐漸產生一定的差異。Zhang等［41］比較了棕色脂肪和骨骼肌的長鏈非編碼RNA表達譜，發現了704上調和896下調差異表達的lncRNAs，進一步發現lncRNA AK003288可能通過作用于親聯蛋白2(Jph2)在棕色脂肪和骨骼肌分化成熟及相互轉化中發揮作用。上述研究提示，lncRNA參與了棕色脂肪前體細胞向成熟的脂肪細胞分化的過程，并且可能在成肌祖細胞向功能特異性細胞定向分化過程中起到了指導性的作用，以lncRNA為靶標，挖掘參與棕色脂肪生成的分子機制，將有可能促進解決棕色脂肪獲取的技術難題，從而為肥胖的治療帶來新的方向。

然而，機體內不同部位的脂肪組織也存在一些差異，lncRNA在脂肪中的作用具有位點的特異性。Divoux等［42］通過分析人體脂肪異質性的基因調控通路，發現lncRNA HOTAIR表達于臀部脂肪組織中而在腹部脂肪組織中無表達，這種差異在體外分化過程中依然存在且第4天差異最為顯著，腹部前體脂肪細胞中異位表達的HOTAIR可增加細胞成脂分化率，且成脂分化相關基因PPARγ和LPL的表達顯著增加。

上述研究均表明，lncRNA參與脂肪前體細胞向成熟脂肪細胞分化的過程和脂滴的積累過程，且具有位點特異性，但具體的機制尚未闡明，尚需進一步的研究探索。

4 總結和展望

疾病的發生是細胞內多個分子多個環節作用失調的結果，蛋白編碼基因僅僅是疾病發生過程中復雜分子網絡相互作用中的一部分。相對于蛋白編碼序列以及小分子RNA，lncRNA的研究還僅僅處于起步階段。lncRNA在哺乳動物基因組中普遍存在，擁有信號分子、誘餌分子、引導分子和骨架分子等不同角色，基因表達的每一個階段幾乎都有lncRNA參與調控，包括轉錄起始、延長、RNA加工、RNA穩定和翻譯等生物學過程。

眾多證據表明許多內分泌代謝疾病的發生發展與lncRNA的突變或失調有關，成為遺傳學和分子生物學關注的新熱點。lncRNA作為疾病診斷的標志物和潛在的治療靶點，對于診斷和治療肥胖、糖尿病、高脂血癥等內分泌代謝疾病具有重要意義。

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