三種除蛋白方法對復方乙肝寧多糖及蛋白的影響

李 靜 王定雪

1.貴陽中醫學院實驗中心，貴州 貴陽 550002;2.貴陽中醫學院第一附屬醫院，貴州 貴陽 550002

三種除蛋白方法對復方乙肝寧多糖及蛋白的影響

李 靜1王定雪2

1.貴陽中醫學院實驗中心，貴州 貴陽 550002;2.貴陽中醫學院第一附屬醫院，貴州 貴陽 550002

目的：對乙肝寧復方多糖進行三種除蛋白處理，考查除蛋白效果。方法：采用苯酚-硫酸法在490 nm處測定糖的含量，以多糖回收率和蛋白去除率為指標。結果：Sevag法、5%三氯乙酸法、三氯乙酸-正丁醇法的多糖回收率分別為57.41%、88.27%、64.90%，蛋白去除率分別為53.06%、20.23%、28.90%。結論：5%三氯乙酸法對多糖的保留效果最好，Sevag法除蛋白效果最好，本實驗為多糖除蛋白的方法提供了實驗依據。

乙肝寧復方；多糖；苯酚-硫酸法；除蛋白

目前公認的多糖物質是主要吸濕性成分之一，所以首先對乙肝寧顆粒復方水提液中的多糖進行探討。乙肝寧顆粒[1]是《中國藥典》2010年版(Ⅰ部)收載的成方制劑，具有補氣健脾、活血化瘀、清熱解毒的作用，主要用于慢性遷延性肝炎、慢性活動性肝炎屬濕熱內蘊、肝郁脾虛、氣虛血瘀證者，對急性肝炎也有一定療效。多糖是乙肝寧顆粒的主要有效成分之一，具有多種生理活性，但由于多糖和蛋白質結合緊密，采用傳統水提醇沉法得到的沉淀主要是多糖和蛋白質的混合物，為了最大限度地保留多糖和去除蛋白質，本實驗采用苯酚-硫酸法測定乙肝寧復方多糖的含量，對比Sevag法、5%三氯乙酸法、三氯乙酸-正丁醇法的多糖回收率和蛋白質去除率。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 SP-756可見分光度計(上海光譜儀器有限公司)；AR124CN電子天平(奧豪斯儀器有限公司)；RE52-99型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-D(Ⅲ)型循環水多用真空泵(鞏義予華儀器有限責任公司)；HH-S型水浴鍋(鄭州長城科工貿有限公司)；低速離心機；DZF-6050真空干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)。

1.2 試劑 苯酚(AR，湖南匯虹試劑有限公司，20090824)；硫酸(AR，湖南省株洲市化學工業研究所)；葡萄糖(AR，天津市科密歐化學試劑有限公司，20101023)；乙醇(AR，湖南匯虹試劑有限公司，20110521)；三氯乙酸(AR，天津市科密歐化學試劑有限公司，批號20090120)；氯仿(AR，天津市大茂化學試劑廠，20070803)；正丁醇(AR，湖南匯虹試劑有限公司，20090810)。中藥材有十二味：白花蛇舌草、茵陳、金錢草、黨參、蒲公英、制何首烏、牡丹皮、丹參、茯苓、白芍、白術、川楝子(中藥飲片購自安徽惠隆中藥飲片有限公司，質量檢測皆符合《中國藥典》2010年版Ⅰ部的規定)。

2 方法與結果

2.1 乙肝寧復方多糖溶液的制備 按照2010版藥典乙肝寧顆粒[1]處方的十二味中藥材，加十倍量水浸泡30min，水蒸氣回流法提取2h，過濾，濾渣加八倍量水回流提取2h，過濾，合并濾液，用旋轉蒸發儀在0.9kPa和65℃條件下濃縮至適量，向濃縮液中加入無水乙醇使其含醇量達到70%，搖勻，置4℃冰箱，靜置過夜。離心，過濾，濾液收集備用；離心、過濾后的沉淀，放置于真空干燥箱中以60℃恒溫干燥至恒重，得粗多糖至冰箱中備用。精確稱取上述粗多糖3g，放入100ml容量瓶中，超聲溶解，加蒸餾水定容至刻度即得到乙肝寧復方多糖溶液。

2.2 乙肝寧復方多糖含量測定方法的建立

2.2.1 6%苯酚溶液的配制 量取苯酚6ml，加蒸餾水定容至100ml，置棕色瓶內，放于4℃冰箱備用。

2.2.2 標準溶液的配制 精密稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖20.20mg，用蒸餾水溶解定容至100ml，搖勻，即得0.2020mg/ml的葡萄糖標準溶液。

2.2.3 最大吸收波長[2]的確定 取葡萄糖標準溶液1ml，加入具塞試管中，迅速加入6%苯酚溶液1.0ml，濃硫酸5.0ml，搖勻，室溫放置5min，沸水浴15min，流水速冷至室溫。以蒸餾水同法操作為空白，置比色杯中于400～700nm波段處進行掃描，光譜掃描曲線確定最大吸收波長為490nm。(見圖1)

2.2.4 標準曲線的建立 采用苯酚-硫酸法，用移液槍分別吸取0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml葡萄糖標準液至10ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度。搖勻后，用移液槍分別吸取1ml加入具塞試管中，并加入6%苯酚溶液1.0ml，濃硫酸5.0ml，搖勻，室溫放置5min，沸水浴15min, 流水速冷至室溫，以第一份為空白于490nm測定吸光度。(見表1)

以吸光度A對葡萄糖濃度C回歸，得回歸方程為:A=0.0087C-0.0112，其中R2=0.9995，葡萄糖濃度在10.1～101μg/ml范圍內與吸光度線性關系良好。

2.2.5 精密度試驗 精密量取葡萄糖標準溶液200μL共六份，分別置具塞試管中，加蒸餾水補足至1ml，自“并加入6%苯酚溶液1.0ml”按標準曲線的制備項下操作，結果吸光度分別為0.315、0.319、0.321、0.315、0.322、0.322，則RSD=1.55%(n=6)。

2.2.6 穩定性試驗 精密量取葡萄糖標準溶液200μl，置具塞試管中，加蒸餾水補足至1ml，自“并加入6%苯酚溶液1.0ml”按標準曲線的制備項下操作，將供試品溶液完成顯色后，每隔15min測吸光度一次，連續測定八次(見表2)。

試驗結果表明葡萄糖標準溶液在90min內顯色穩定性良好，90min時吸光度的RSD=2.51%(n=7)，105min時吸光度的RSD=3.69%(n=8)。

2.2.7 重復性試驗 精密稱取乙肝寧復方多糖(批號為20100102)六份各3.00g，加蒸餾水定容至100ml，精密量取50μl溶液于10ml容量瓶中，加蒸餾水補足至刻度，分別精密量取1ml溶液置具塞試管中，自“并加入6%苯酚溶液1.0ml”按標準曲線的制備項下操作，顯色并測定吸收度分別為0.514、0.549、0.546、0.549、0.531、0.527，結果按照平均含量計算為41.93%，RSD=2.62%(n=6)，表明本法的重復性良好。

2.2.8 回收率試驗 分別精密量取已知含量的乙肝寧復方多糖溶液六份，每份1ml，每組分別加入葡萄糖標準溶液 (60.25μg/ml)1ml混合均勻，精密移取1ml溶液置具塞試管中，按標準曲線的制備項下方法顯色并測定吸光度，結果測定平均回收率為101.12%，RSD=1.09%(n=6)(見表3)。

2.2.9 乙肝寧復方多糖的含量測定 精密量取3批乙肝寧復方多糖3.00g，加蒸餾水定容至100ml，精密量取50μl溶液于10ml容量瓶中，加蒸餾水補足至刻度，分別精密量取1ml溶液置具塞試管中，自“并加入6%苯酚溶液1.0ml”按標準曲線的制備項下操作，顯色并測定吸收度分別為0.569、0.526、0.575，從標準曲線上讀出供試品溶液中多糖以葡萄糖計的含量，計算即得多糖百分總含量[3]。結果表明乙肝寧復方多糖的平均百分含量以葡萄糖計是43.77%，RSD=3.68%(n=3)(見表4)。本實驗使用500g中藥材，經過提取純化得到70g沉淀，由計算可知乙肝寧復方藥材中所含多糖的量為6.13%。

2.3 蛋白質的含量測定 以生理鹽水(0.9%氯化鈉溶液)為空白對照，采用紫外吸收直接測定法[4]，測定待測溶液在280nm和260nm兩種波長的吸光度，并將A280nm和A260nm波長處的的吸光度值代入下面公式計算蛋白質的濃度。

C=1.45 A280nm-0.74 A260nm

式中C：蛋白質濃度(mg/ml)；A280nm：溶液在280 nrn處測得的吸光度；A260nm：溶液在260nm處測得的吸光度。

2.4 除蛋白方法

2.4.1 Sevag法(Sevag method) 取20ml乙肝寧多糖溶液，加入氯仿4ml，正丁醇0.8ml，混合物劇烈震蕩，靜置一段時間后， 1500r/min離心30min，分出水層和有機層交界處的變性蛋白。重復上述操作三次，直至無變性蛋白出現，收集上清液加水定容至40ml，測定其多糖濃度和蛋白質濃度。

2.4.2 5%三氯乙酸法[5](5% TCA method) 取20ml乙肝寧多糖溶液，加入20ml 5%三氯乙酸溶液，混合均勻后4℃下靜置4h，1500r/min離心15min，棄去沉淀，收集上清液加水定容至40ml，測定其多糖濃度和蛋白質濃度。

2.4.3 三氯乙酸-正丁醇法[6](TCA-Butanol method) 取20ml乙肝寧多糖溶液，加入三氯乙酸16.5ml，正丁醇3.5ml，混合震蕩1min，靜置1h，離心棄去沉淀，收集上清液加水定容至40ml，測定其多糖濃度和蛋白質濃度。

2.4.4 不除去蛋白的溶液(The retention of protein solution) 作為空白組 取20ml乙肝寧多糖溶液，加水定容至40ml，離心取上清液，測定其多糖濃度和蛋白質濃度。

2.4.5 結果 精密量取50μl待測溶液，加水定容至5ml，取1ml溶液于具塞試管，按照苯酚-硫酸法測定多糖的含量，記錄A490nm，另外精密量取200μl待測液，加水定容至6ml，按照紫外吸收直接測定法測定蛋白質濃度，記錄A280nm，A260nm，實驗結果見表5。

3 討論

本實驗采用水蒸氣回流提取法，向濃縮液中加入乙醇使含醇量達到70%，使用水提醇沉法分離多糖，以除去單糖、寡糖、苷類及生物堿等醇溶性成分，得到乙肝寧復方多糖。

用苯酚-硫酸法，以葡萄糖計算測定乙肝寧復方多糖溶液中的總多糖含量，多糖在硫酸作用下水解成單糖，并能迅速脫水生成糠醛衍生物，與苯酚縮合反應生成橙黃色化合物，用分光光度法測定其含量，簡便快捷，適合乙肝寧復方多糖的含量測定。

對比三種除蛋白方法，Sevag法的多糖回收率最低(57.41%)，蛋白去除率最高(53.06%)；三氯乙酸-正丁醇法的多糖回收率(64.90%)和蛋白去除率(28.90%)居中;5%三氯乙酸的蛋白去除率雖然最低(20.23%)，但是比較接近三氯乙酸-正丁醇法(28.90%)，并且該法的多糖回收率最高(88.23%)，相比Sevag法多糖回收率高出了30.82%，可以避免Sevag法反復操作，有機試劑消耗量大，其中氯仿是毒性物質，有可能會造成多糖活性下降和有機試劑殘留的缺點。同時對比三種處理方法的多糖溶液靜置后的穩定性，放置于4℃冰箱，72h后觀察現象，結果顯示5%三氯乙酸法溶液穩定性較好，澄明度優于其他兩種方法。實驗表明，5%三氯乙酸法對多糖的保留效果最好，Sevag法除蛋白效果最好，但是多糖損失量較多。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫藥科技出版社,2010:403-404.

[2]周燦,楊梓懿,許李,等.不同炮制去心法對巴戟天多糖含量的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2011,31(1):49-51.

[3]張家富,孟楣.紫外分光光度法測定糖腎康顆粒中總多糖的含量[J].安徽中醫學院學報,2005,8, 24(4):48-49.

[4]陳鈞輝.生物化學實驗[M].3版.北京:科學出版社,2002:61.

[5]李春玲等.白花蛇舌草多糖的提取工藝研究[J].中獸醫醫藥雜志,2008,27(6):26-27.

[6]方升平,王維香,雒小龍.川芎多糖除蛋白方法研究[J].時珍國醫國藥,2009,20(9):2176-2177.

Influence of three methods of removing protein about compound Polysaccharide in Yiganning

LI Jing1WANG Dingxue2

1.GuiYang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550002,China; 2.The first Hospital Affliated to Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550001,China

Objective In order to test effect to three methods to removing protein of compound polysaccharides in Yiganning. Methods The polysaccharide content was determined by phenol-sulfuric acid method comparing colors at 490 nm . With polysaccharide recovery rate and protein removal rate as an indicator. Results Sevag method, 5% TCA method ,TCA-Butanol method of polysaccharide recovery rates were 57.41%,88.27%,64.90%, while protein removal rates were 53.06%,20.23%,28.90%. Conclusion 5% TCA method on polysaccharide retention effect is better, Sevag method protein removal effect is better. The experiment provides basis for the study of removing protein method.

compound Yiganning; polysaccharide; phenol-sulfuric acid method; removing protein

R914

A

1007-8517(2015)18-0020-03

2015.06.25)