TCMC在慢性肺動(dòng)脈高壓肺血管重塑中的作用及色甘酸鈉的影響

李俊麗　范琰琰　葉光華　林刻智　董繆武　喻林升*

（浙江省溫州醫(yī)科大學(xué) 法醫(yī)學(xué)系 司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所，浙江 溫州 325035）

TCMC在慢性肺動(dòng)脈高壓肺血管重塑中的作用及色甘酸鈉的影響

李俊麗范琰琰葉光華林刻智董繆武喻林升*

（浙江省溫州醫(yī)科大學(xué) 法醫(yī)學(xué)系 司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所，浙江 溫州 325035）

目的 探究TCMC對(duì)慢性低O2高CO2性大鼠肺血管重塑的作用及色甘酸鈉的影響。方法建立慢性低氧高二氧化碳肺血管重塑模型，分為三組：Ⅰ組（常氧空白對(duì)照組），Ⅱ組（低O2高CO2實(shí)驗(yàn)組），Ⅲ組（色甘酸鈉實(shí)驗(yàn)組）。Ⅲ組給予色甘酸鈉腹腔注射處理。光鏡下、透射電鏡下觀察肺動(dòng)脈血管壁及其周圍肥大細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)改變，甲苯胺藍(lán)染色法和免疫組織化學(xué)法對(duì)肺動(dòng)脈周圍的肥大細(xì)胞及其脫顆粒狀態(tài)進(jìn)行定性定量測(cè)定，免疫組織化學(xué)法（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）測(cè)定肺動(dòng)脈平滑肌內(nèi)PCNA蛋白表達(dá)，并用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。結(jié)果①Ⅱ組肺細(xì)小動(dòng)脈管壁/管總面積（WA/TA）、管腔/管總面積（EA/TA）均高于Ⅰ組（P＜0.05），Ⅲ組低于Ⅱ組（P＜0.05）。②電鏡下，Ⅱ組肺細(xì)小動(dòng)脈中膜平滑肌增生，外膜膠原纖維密集，內(nèi)彈力板扭曲，內(nèi)皮細(xì)胞突起，血管外肥大細(xì)胞內(nèi)顆粒減少，胞膜不完整，Ⅲ組血管結(jié)構(gòu)基本正常，平滑肌增生及膠原增生較Ⅱ組輕，肥大細(xì)胞膜完整。③Ⅱ組甲苯胺藍(lán)染色肥大細(xì)胞細(xì)胞數(shù)（NMC）、肥大細(xì)胞脫顆粒率（DR）及類胰蛋白酶陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（TBS）高于Ⅰ組（P＜0.05），Ⅲ組低于Ⅱ組（P＜0.05）。結(jié)論①M(fèi)C參與慢性低O2高CO2導(dǎo)致的大鼠肺血管重塑的過(guò)程。②色甘酸鈉可抑制慢性低O2高CO2導(dǎo)致的大鼠肺血管重塑改變。

慢性低O2高CO2；肥大細(xì)胞；肺動(dòng)脈；色甘酸鈉

慢性低氧性肺動(dòng)脈高壓（hypoxic hypercapnia pulmonary hypertension，HHPH）是慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）發(fā)展到肺心病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而慢性低氧性肺動(dòng)脈高壓的主要發(fā)病則是低氧引起的肺血管重塑。引起肺血管重塑的重要病理學(xué)基礎(chǔ)是肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增生，血管膠原沉積，管壁增厚，因此，抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增生作用，從而逆轉(zhuǎn)肺血管重塑，減輕低氧性肺動(dòng)脈高壓成為研究的重要課題。近年來(lái)，炎癥以及肥大細(xì)胞（mast cell，MC）參與形成并維持肺動(dòng)脈高壓的機(jī)制研究得到廣泛重視［1-2］。肺中含MC豐富，其分為兩類，一類是僅含類胰蛋白酶（Tryptase）的（TMC型），另一類是含類胰蛋白酶和類糜蛋白酶（Chymase）的（TCMC型）。本實(shí)驗(yàn)在以往的研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探究，TCMC對(duì)慢性低O2高CO2性大鼠肺血管重塑的作用及色甘酸鈉影響，以及MC在這一機(jī)制中的意義。

1　材料與方法

1.1材料：雄性SD大鼠由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；兔抗大鼠TBS抗體、Ki67抗體及SABC試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋，姜黃素購(gòu)自Sigma公司，其余試劑均為市售分析純。

1.2模型建立：從溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)得180～200 gSD（Sprague-Dawley）雄性大鼠18只，普通清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，室內(nèi)溫度20～25 ℃，濕度40%～70%，隨機(jī)分為4組：Ⅰ組（常氧空白對(duì)照組），Ⅱ組（低O2高CO2實(shí)驗(yàn)組），Ⅲ組（色甘酸鈉實(shí)驗(yàn)組）。低氧氧艙內(nèi)O2濃度為8%～11%，CO2濃度為3%～5%（氧艙內(nèi)水蒸汽用無(wú)水氯化鈣吸收）。Ⅰ組常氧下正常飼養(yǎng)4周，Ⅱ、Ⅲ組同樣飼養(yǎng)4周，但給予每周6 d，每天8 h置于低氧氧艙中的處理，Ⅲ組入艙前給予色甘酸鈉腹腔注射處理。

1.3肺細(xì)小動(dòng)脈顯微結(jié)構(gòu)觀察：放血處死大鼠后，取肺葉組織，10%福爾馬林溶液固定，脫水透明，浸蠟包埋，石蠟組織切片（4 μm），HE染色后，光鏡下觀察肺細(xì)小血管顯微結(jié)構(gòu)并拍照。每張切片中選取5支直徑100～200 μm肺動(dòng)脈，利用圖像分析系統(tǒng)（IPP6.0）測(cè)定肺細(xì)小動(dòng)脈管壁/管總面積（vessel wall area/total area，WA/TA）、管腔/管總面積（vessel cavity area/total area，EA/TA）。

1.4電鏡觀察肺小動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)：取肺門處肺動(dòng)脈周圍組織0.1 cm× 0.1 cm×0.1 cm組織塊，2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，乙醇、丙醇梯度脫水，EPON812包埋，固化，LKB-V型超薄切片機(jī)切片，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，H-600型透射電鏡下觀察肺小動(dòng)脈壁周圍肥大細(xì)胞及其內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)彈力板、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、膠原增生情況，并拍照記錄。

1.5甲苯胺藍(lán)染色肥大細(xì)胞測(cè)定：石蠟包埋組織切片（4 μm），二甲苯脫蠟，酒精梯度水化，甲苯胺藍(lán)染色，脫水，中性樹(shù)膠封固。光鏡下觀察，肺細(xì)小血管周圍甲苯胺藍(lán)染色陽(yáng)性肥大細(xì)胞，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)含肺細(xì)小動(dòng)脈高倍鏡視野，計(jì)數(shù)個(gè)視野中肥大細(xì)胞細(xì)胞數(shù)（the number of mast cell，NMC），肥大細(xì)胞均數(shù)=每組肥大細(xì)胞總數(shù)/所取視野數(shù)；肥大細(xì)胞脫顆粒率（degranulation rate，DR）=脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù)/肥大細(xì)胞總數(shù)。

1.6類胰蛋白酶酶（TBS）的免疫組化法檢測(cè)：石蠟包埋組織切片，脫蠟、水化，常溫下3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性10 min，微波熱修復(fù)抗原活性，進(jìn)口山羊血清封閉常溫20 min，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗37 ℃孵育20 min，DAB顯色，蘇木素核復(fù)染，陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)含肺細(xì)小動(dòng)脈高倍鏡視野，計(jì)數(shù)個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.7肺細(xì)小動(dòng)脈平滑肌內(nèi)PCNA（Ki67）蛋白表達(dá)：石蠟包埋組織切片，脫蠟、水化，常溫下3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性10 min，高壓熱修復(fù)抗原10 min，進(jìn)口山羊血清封閉常溫20 min，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗37 ℃孵育20 min，DAB顯色，蘇木素核復(fù)染，陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)含肺細(xì)小動(dòng)脈高倍鏡視野，觀察各組血管平滑肌細(xì)胞Ki67表達(dá)。

2　結(jié)　果

2.1大鼠肺小動(dòng)脈顯微結(jié)構(gòu)觀察：肺組織經(jīng)HE染色光鏡下觀察，低O2高CO2組相比正常組肺細(xì)小動(dòng)脈管壁明顯增厚，平滑肌細(xì)胞增生，內(nèi)彈力板扭曲明顯，管腔狹窄，同時(shí)低O2高CO2組管壁/管總面積（WA/ TA）、（EA/TA）比正常組明顯增高（P＜0.05）；色甘酸鈉組相比低O2高CO2組肺動(dòng)脈管壁未增厚，平滑肌細(xì)胞未見(jiàn)明顯增生，內(nèi)彈力板自然彎曲，管腔未見(jiàn)明顯改變，同時(shí)兩組管壁/管總面積（WA/TA）都比低O2高CO2組降低（P＜0.05）。

2.2肺細(xì)小動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)觀察：電鏡下，正常組血管結(jié)構(gòu)正常，平滑肌細(xì)胞及膠原未增生，內(nèi)彈力板自然彎曲，內(nèi)皮細(xì)胞扁平，肥大細(xì)胞膜完整；低O2高CO2組肺細(xì)小動(dòng)脈中膜平滑肌增生，外膜膠原纖維密集，內(nèi)彈力板扭曲，內(nèi)皮細(xì)胞突起，血管外肥大細(xì)胞內(nèi)顆粒減少，胞膜不完整；姜黃素組、色甘酸鈉組血管結(jié)構(gòu)基本正常，平滑肌增生及膠原增生較低O2高CO2組輕，肥大細(xì)胞膜完整。

2.3肥大細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色情況：顯微鏡下觀察可見(jiàn)肺細(xì)小動(dòng)脈周圍肥大細(xì)胞內(nèi)粗大顆粒染成紫紅色，未脫顆粒細(xì)胞胞膜完整，胞質(zhì)染色加深，脫顆粒細(xì)胞形態(tài)不規(guī)整，胞質(zhì)淡染。低O2高CO2組相比正常組肺細(xì)小動(dòng)脈周圍肥大細(xì)胞數(shù)量明顯增多（P＜0.05），脫顆粒率增高（P＜0.05）；色甘酸鈉組相比低O2高CO2組肥大細(xì)胞數(shù)量較少（P＜0.05），脫顆粒率降低（P＜0.05）。

2.4肥大細(xì)胞類胰蛋白酶（TBS）免疫組化檢測(cè)：光鏡下可見(jiàn)，肺細(xì)小動(dòng)脈周圍肥大細(xì)胞胞質(zhì)染成棕黃色，低O2高CO2組相比正常組肺細(xì)小動(dòng)脈周圍肥大細(xì)胞細(xì)胞數(shù)明顯增多（P＜0.05）；姜黃素組、色甘酸鈉組相比低O2高CO2組肥大細(xì)胞細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）。

2.5肺細(xì)小動(dòng)脈平滑肌內(nèi)PCNA（Ki67）蛋白表達(dá)：光鏡下，免疫組化法檢測(cè)肺細(xì)小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞Ki67，Ⅰ組呈陰性，Ⅱ組則可見(jiàn)部分陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，Ⅲ組呈弱陽(yáng)性。

3　討　論

慢性低氧性肺動(dòng)脈高壓是一個(gè)有著高發(fā)病率和病死率的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，其病理學(xué)改變的研究已十分清楚，主要是低氧引起的肺血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞增生，細(xì)胞外基質(zhì)分泌增多，血管壁增厚，導(dǎo)致肺血管重塑，肺動(dòng)脈壓力增高［3］。低氧刺激肥大細(xì)胞激活并脫顆粒，顆粒中含有大量細(xì)胞因子和酶類，其中類胰蛋白酶、類糜蛋白酶、MMPs、VEGF與低氧下肺血管增生和肺血管重塑有關(guān)［4］。

肺中含MC豐富，其分為兩類，一類是僅含類胰蛋白酶（Tryptase）的（TMC型），另一類是含類胰蛋白酶和類糜蛋白酶（Chymase）的（TCMC型）。類胰蛋白酶可通過(guò)多種特性促進(jìn)血管重塑：具有促進(jìn)纖維化的生物學(xué)功能，通過(guò)肺成纖維細(xì)胞表面的蛋白酶活化受體（proteinase-activated receptor，PAR）-2的激活誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞增殖，肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞增生，肺血管壁Ⅰ型膠原的合成，最終導(dǎo)致肺血管壁的膠原纖維過(guò)量生成，膠原沉積［5］，從而導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓。

本實(shí)驗(yàn)中Ⅱ組相比Ⅰ組肺動(dòng)脈管壁/管總面積比值增大（P＜0.05），管壁增厚，光鏡下肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增生，超微結(jié)構(gòu)觀察內(nèi)皮細(xì)胞向管腔突起，基底縮窄，內(nèi)彈力板明顯扭曲，血管外膜膠原大量密集，證明慢性低O2高CO2可以導(dǎo)致肺血管壁發(fā)生明顯改變。甲苯胺蘭染色實(shí)驗(yàn)及透射電鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ⅰ組相比Ⅱ組肥大細(xì)胞胞膜穩(wěn)定，減少脫顆粒現(xiàn)象。表明慢性低O2高CO2環(huán)境誘導(dǎo)肺小血管周圍肥大細(xì)胞增生，促進(jìn)低氧性肺動(dòng)脈高壓的形成，支持前述低氧下肥大細(xì)胞增生并促進(jìn)肺動(dòng)脈高壓形成的理論。

色甘酸鈉是常見(jiàn)的肥大細(xì)胞膜穩(wěn)定劑，抑制肥大細(xì)胞裂解、脫顆粒。Banasova等發(fā)現(xiàn)，在慢性常壓低氧肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型中早期預(yù)防性給予色甘酸鈉治療，可減輕肺血管重塑和低氧性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生［6］。在肺動(dòng)脈高壓相關(guān)動(dòng)物模型中，早期給予色甘酸鈉治療，與非治療組相比，肺動(dòng)脈管壁增厚減輕，血管平滑肌增生減少，血管壁/管腔比值降低，血管壁重塑被部分抑制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ⅲ組相比Ⅱ組WA/TA比值降低（P＜0.05），光鏡下肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞不明顯增生，超微結(jié)構(gòu)觀察內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)彈力板等結(jié)構(gòu)基本正常，血管外膜膠原未見(jiàn)明顯沉積，證明色甘酸鈉可以抑制慢性低O2高CO2性肺血管壁改變。甲苯胺蘭染色實(shí)驗(yàn)及透射電鏡觀察實(shí)驗(yàn)，Ⅱ組發(fā)生明顯脫顆粒現(xiàn)象，Ⅲ組相比Ⅱ組肥大細(xì)胞胞膜穩(wěn)定，減少脫顆粒現(xiàn)象，因此肥大細(xì)胞膜脫顆粒參與慢性低O2高CO2性肺血管增生性改變的過(guò)程，色甘酸鈉可通過(guò)抑制肥大細(xì)胞活性而抑制慢性低O2高CO2導(dǎo)致的肺血管增生性改變。

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R563

B

1671-8194（2015）11-0039-02

溫州市科技局科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20100185）；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（Q13H150005）