Toll 樣受體的內(nèi)源性激活在糖尿病及糖尿病腎病中的作用——TLRs 表達(dá)、激活促進(jìn)DM 和DN 的發(fā)生、發(fā)展①

袁 婷 關(guān)曉菲 盧文冉 綜述 尹曉琳 魏 琳 審校

(河北醫(yī)科大學(xué)免疫實(shí)驗(yàn)室 河北省重大疾病的免疫機(jī)制及干預(yù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050000)

近年來，隨著人們生活水平的提高，飲食習(xí)慣的改變，平均壽命的延長(zhǎng)，糖尿病(Diabetes mellitus，DM)的發(fā)病率明顯增高。糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是在糖尿病病程中出現(xiàn)的以蛋白尿、腎功能不全等腎臟病變?yōu)樘卣鞯募膊。翘悄虿〕Ｒ姷牟l(fā)癥之一。越來越多的人認(rèn)識(shí)到糖尿病腎病是由新陳代謝紊亂、蛋白質(zhì)過載和血流動(dòng)力學(xué)異常激活了炎癥因素而導(dǎo)致的。Toll 樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是一種新的病原體相關(guān)分子模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors，PRRs)，識(shí)別高度保守的微生物組分-病原相關(guān)分子模式(Pathogenassociated molecular patterns，PAMPS)，同時(shí)也是一種損害相關(guān)的分子模式家族識(shí)別受體。迄今為止，在人類基因組中已發(fā)現(xiàn)11 個(gè)TLR 成員。關(guān)于TLR最新的認(rèn)識(shí)有:(1)TLRs 被非微生物來源的內(nèi)源性配體激活，即損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)，其參與了非感染性炎癥的發(fā)生［1］;(2)TLR 在腎臟固有細(xì)胞和白細(xì)胞中的表達(dá)促進(jìn)各種急慢性腎臟疾病(CKD)的發(fā)生［2］;(3)單核細(xì)胞TLR2 和TLR4 的過表達(dá)與T1DM 和T2DM 患者血紅蛋白HbA1C 的水平和胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)呈正相關(guān)［3-5］。鑒于此，我們綜述TLR 信號(hào)激活與DM 和DN 的關(guān)系及對(duì)其的作用和影響。

1 TLRs 及其配體

TLRs 屬于Ⅰ型跨膜蛋白，其結(jié)構(gòu)分為三部分:胞外區(qū)、跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)。胞內(nèi)區(qū)又被稱為Toll/IL-1 受體同源區(qū)(TIR)。胞外區(qū)由富含亮氨酸的串聯(lián)重復(fù)序列(LRR)組成，作用是對(duì)PAMP 進(jìn)行識(shí)別。TLR 的類型即由胞外區(qū)決定。不同的TLR 在與相應(yīng)的配體結(jié)合后，通過一系列的蛋白質(zhì)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，誘導(dǎo)部分快速反應(yīng)基因的活化，從而產(chǎn)生效應(yīng)分子，包括抗菌肽、一氧化氮合酶、炎癥細(xì)胞因子、共刺激分子、MHC 和趨化因子等，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)。目前已經(jīng)鑒定出的TLR 配體，包括脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)、肽聚糖、脂蛋白、細(xì)菌DNA、脂質(zhì)磷壁酸(Lipoteichoic acid，LTA)、鞭毛蛋白等，多數(shù)TLR 的配體屬于微生物的保守成分PAMP。TLRs 必須經(jīng)配體激活發(fā)揮作用，不同的TLRs 具有不同的配體。其中內(nèi)源性配體在DM 和DN 及其他炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用。如高遷移率簇蛋白1(HMGB-1):它可同TLR4 共同作用介導(dǎo)膿毒癥炎癥反應(yīng)，并在組織損傷引起的炎癥反應(yīng)中也發(fā)揮重要作用;熱休克蛋白:同樣作為TLR4 的內(nèi)源性配體，有上調(diào)IL-6、IL-12、IL-15、黏附素分子及TNF-α的作用;纖維蛋白原同炎癥、損傷、自身免疫性疾病均有關(guān)系，其免疫調(diào)節(jié)作用是由TLR4 共同介導(dǎo)完成的;硫酸乙酰肝素屬TLR4 內(nèi)源性配體，通過免疫細(xì)胞激活來監(jiān)視體內(nèi)損傷。以上說明TLR 可感知機(jī)體的無菌性組織損傷，進(jìn)而啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，顯示了其在非感染性炎癥的發(fā)生中的重要地位。

2 代謝紊亂啟動(dòng)TLRs 的激活

對(duì)TLRs 內(nèi)源性配體的識(shí)別很大程度上提高了我們對(duì)TLRs 在各種非感染性炎性疾病狀態(tài)下致病作用的研究，例如糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化和慢性腎臟疾病等。針對(duì)細(xì)胞應(yīng)激和損傷的蛋白:如HMGB-1、熱休克蛋白、S100 家族蛋白;細(xì)胞外基質(zhì)重塑的蛋白:如纖維蛋白原降解成分、表面活性蛋白A 純化的天然蛋白、硫酸乙酰肝素和乙酰透明質(zhì)酸，都在胞內(nèi)或胞外通過結(jié)合TLR2/TLR4 促進(jìn)炎癥反應(yīng)。

除了之前提到的損傷相關(guān)的內(nèi)源性配體外，新的研究顯示，TLRs 是炎癥和與紊亂相關(guān)的代謝綜合征之間的關(guān)鍵分子，如高血糖、血脂異常、高尿酸血癥和血流動(dòng)力學(xué)異常。(1)高血糖:體外研究表明，高糖(HG)會(huì)通過PKC 和二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶的激活誘導(dǎo)TLR2 和TLR4 表達(dá)，shRNA 干擾TLR2 和TLR4 表達(dá)可顯著下調(diào)HG 誘導(dǎo)的NF-κB的活化［6］。高糖誘導(dǎo)TLR 腎小管上皮細(xì)胞激活的機(jī)制之一可能是HMGB1 的分泌，其是一種DNA 結(jié)合蛋白，通過結(jié)合TLR2 和TLR4 調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄并促進(jìn)炎癥反應(yīng)［7-10］。(2)血脂異常:由于飽和游離脂肪酸(FFAs)是LPS 激活TLR 信號(hào)必不可少的組成部分，F(xiàn)FAs 通過TLRs 調(diào)節(jié)胰島素抵抗是先決條件。在體外實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)FAs 能在巨噬細(xì)胞、肌細(xì)胞、足細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中激活TLR2/4 的NF-KB 的信號(hào)傳導(dǎo)，這與胰島素抵抗的炎癥機(jī)制相關(guān)［11-14］。此外，F(xiàn)FAs 也可通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、足細(xì)胞的TLRs 和S100A8 的表達(dá)來增加HG 誘導(dǎo)的促炎效應(yīng)［13，15，16］。在體內(nèi)，TLR4 的缺乏可以通過抑制IγB激酶和c-Jun 氨基末端激酶途徑，來防止飲食引起的肥胖和胰島素抵抗［17，18］。此外，動(dòng)脈粥樣硬化脂蛋白，如輕度修飾的低密度脂蛋白和氧化低密度脂蛋白，通過與單核細(xì)胞TLR2/TLR4 的相互作用來觸發(fā)炎癥，而晚期糖基化終產(chǎn)物L(fēng)DL 可通過腎小管上皮細(xì)胞的TLR2/TLR4-MyD88 依賴途徑來誘導(dǎo)IL-6和IL-8 的產(chǎn)生［10，16，19-21］。此外，功能失調(diào)的高密度脂蛋白的血清淀粉樣蛋白A 可通過TLR2 途徑促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致慢性腎病的內(nèi)皮功能障礙［22，23］。(3)尿酸(UA):UA 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞釋放核HMGB1，然后通過TLR4 的自分泌/旁分泌的方式，活化NF-κB。(4)血流動(dòng)力學(xué)異常:血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)可以通過增加小鼠腎小球系膜細(xì)胞和足細(xì)胞AP-1 相關(guān)的TLR4 基因轉(zhuǎn)錄來促進(jìn)TLR4 的表達(dá)［24，25］。由坎地沙坦或醛固酮受體拮抗劑阻斷RAS 也能明顯減弱TLR4 的表達(dá)，及其下游相關(guān)的促炎和凋亡事件［26，27］。(5)氧化應(yīng)激:TLR4 介導(dǎo)的氧化應(yīng)激可引起出血性休克。體外實(shí)驗(yàn)中，在巨噬細(xì)胞中過氧化氫會(huì)誘導(dǎo)TLR4/MyD88 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［28］。

因此，同糖尿病相關(guān)的代謝產(chǎn)物可以直接或間接與TLR 結(jié)合，促進(jìn)TLRs 信號(hào)通路的激活，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)糖尿病的發(fā)展及其并發(fā)癥的出現(xiàn)。

3 TLRs 及其相關(guān)分子與DN 發(fā)展關(guān)系

3.1 TLR4 的作用 最近我們發(fā)現(xiàn)，TLR4 是DN 的主要調(diào)控者。有三個(gè)依據(jù):(1)在人類的DN 中，TLR2 和TLR4 均高表達(dá)于腎小管中，其中TLR4 與巨噬細(xì)胞間質(zhì)的浸潤(rùn)和HbA1C 的水平成正相關(guān)，與活檢時(shí)GFR 的評(píng)估成負(fù)相關(guān)。腎小管表達(dá)HMGB1，它是糖尿病狀態(tài)所激活的TLR4 的內(nèi)源性配體［5］，在DN 活組織切片中的表達(dá)也增加。(2)在人近端小管上皮細(xì)胞(PTECs)中，HG 通過PKC的活化誘導(dǎo)了TLR2 和TLR4 的表達(dá)，通過抑制NFκB 的激活，使IL-6 和CCL-2 的表達(dá)上調(diào)。(3)STZ-誘導(dǎo)的單側(cè)腎切除TLR4-/-小鼠較野生型小鼠而言，尿蛋白、腎功能不全、腎功能皮質(zhì)NF-κB 活化、管狀CCL-2 的表達(dá)及間質(zhì)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)均顯著減少。相較于未經(jīng)處理的小鼠而言，STZ 誘導(dǎo)的eNOSKO 小鼠(先進(jìn)的DN 模型)經(jīng)TLR4 抑制劑CRX-526 作用后，也觀察到了類似的有益作用［29］。CRX-526 可以通過下調(diào)炎癥趨化因子CCL-2、CCL-5 和骨膠蛋白抑制腎臟的炎癥和間質(zhì)巨噬細(xì)胞的侵潤(rùn)，從而減少尿蛋白［30］。這些作用都可能是通過抑制TGF-β 的過度表達(dá)和NF-κB 的活化來調(diào)節(jié)的。

除了腎小管間質(zhì)損傷外，TLR4 在尿蛋白的炎癥程度和腎小球損害中也發(fā)揮積極作用。在腎小球硬化癥和系膜增生性腎小球腎炎的動(dòng)物模型中［31］，足細(xì)胞中TLR4 的激活可以誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，并加速腎小球足細(xì)胞損傷［32］。體外研究表明，在小鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞或系膜細(xì)胞中，糖尿病組的游離脂肪酸、血管緊張素Ⅱ和HG 可能會(huì)促進(jìn)TLR4 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［24，25，33，34］。最近，TLR4 在糖尿病腎病中的作用在兩種T2DN 模型中得到了進(jìn)一步證明:(1)在高脂飲食結(jié)合STZ 誘導(dǎo)的糖尿病模型中，TLR4/TRIF 依賴途徑的激活和TLR4 的內(nèi)源性配體S100A8 產(chǎn)生，均通過高脂血癥促進(jìn)DN 的惡化。TLR4 缺陷鼠則表現(xiàn)為尿蛋白、腎小球系膜擴(kuò)張、巨噬細(xì)胞滲透、炎細(xì)胞和細(xì)胞外的腎小球基因表達(dá)均減少［16］。(2)在db/db 小鼠中，用非特異性的TLR抑制劑GIT-27 治療后，與對(duì)照組相比，尿白蛋白的排泄，腎小球硬化程度和促炎/促纖維化因子IL-2、TNF-α、PAI-1、TGF-β 的合成均明顯減少，同時(shí)也提高了組織脂質(zhì)代謝能力。在培養(yǎng)的足細(xì)胞和脂肪細(xì)胞中，GIT-27 的有益作用表現(xiàn)為抑制HG 和FFA 誘導(dǎo)的TLR4 上調(diào)和NF-κB、Nox4、TNF-α 的合成［13］。然而由于這些研究中使用的T2DN 動(dòng)物模型的限制，TLR4 在T2DN 腎小管間質(zhì)中纖維化的作用仍然不明。總體而言，這些結(jié)果進(jìn)一步表明TLR4 通過MyD-88 依賴和非依賴途徑促進(jìn)T1DN 和T2DN 的進(jìn)展。

3.2 TLR2 的作用 TLR2 在DN 中也發(fā)揮重要作用。在STZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠中，無論是腎小球內(nèi)還是腎小管間質(zhì)，TLR2 的表達(dá)都顯著上調(diào)，這與MyD88 的表達(dá)、CCL-2、NF-κB 的活化和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的增加相關(guān)。TLR4 的內(nèi)源性配體HSP70 和HMGB1 也被激活。而且在STZ 糖尿病TLR2-/-的小鼠模型中，糖尿病誘導(dǎo)了巨噬細(xì)胞TLR2/MyD88 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，TLR2 缺陷型小鼠較野生型小鼠表現(xiàn)出較少蛋白尿，降低了腎病膜蛋白和足細(xì)胞數(shù)，增加了TGF-β 和黏聯(lián)蛋白，這表明TLR2 可能在DN 早期促進(jìn)糖尿病炎癥和腎損傷［35］。總之，體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)一定程度上強(qiáng)調(diào)了TLR2 和MyD88 依賴性途徑在促進(jìn)和維持DN 的腎臟炎癥中的關(guān)鍵作用。單純的TLR2 基因缺陷，能顯著減少前炎癥狀態(tài)并減弱早期DN。

有幾個(gè)因素可能導(dǎo)致TLR2 和TLR4 作用的不同結(jié)果，包括人和嚙齒動(dòng)物種屬不同而導(dǎo)致DN 病理不同，在模型選擇中人類和動(dòng)物的T2DN 與STZ誘導(dǎo)的T1DN 動(dòng)物不同，體外研究中原代培養(yǎng)的永生化細(xì)胞不同等。這就需要進(jìn)一步確定TLR2 和TLR4 的不同作用，以及MyD88 依賴性和非依賴性途徑在T1DN 和T2DN 的發(fā)病機(jī)制中的關(guān)系［36，37］。另一方面，由于TLR2/4 已經(jīng)牽涉于β 細(xì)胞功能障礙和在T1DN 和T2DN 中的胰島素抵抗，這可能是區(qū)分TLR2/4 在DM 和DN 發(fā)展中作用的困難所在。然而，TLR2 或TLR4 的缺失可以改善腎功能異常而不改變血糖水平［38，35］，這意味著TLR2/4 可能是通過獨(dú)立特定的機(jī)制促進(jìn)DN 的進(jìn)展。

4 TLRs 激活的信號(hào)通路與DN 的炎癥

4.1 TLRs 信號(hào)通路 TLR 屬于“白介素-1 受體/Toll 樣受體家族”(Toll-IL-1 受體)，他們有著相同的胞質(zhì)域TIR 結(jié)構(gòu)域，并有著相似的活化途徑。當(dāng)被激活時(shí)，TLR 募集不同的銜接分子，然后啟動(dòng)不同的下游信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括MyD88 依賴性和非依賴性途徑，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的結(jié)合因子NF-κB 和IRF-3 分別產(chǎn)生下游的促炎細(xì)胞因子。在正常情況下，免疫細(xì)胞內(nèi)存在著多個(gè)不同層次不同靶點(diǎn)的TLR負(fù)性調(diào)節(jié)分子，他們可以對(duì)TLR 激活的信號(hào)通路的開放和傳導(dǎo)進(jìn)行負(fù)向調(diào)節(jié)，及時(shí)終止其信號(hào)的傳導(dǎo)，從而避免過強(qiáng)的免疫反應(yīng)。TLR 表達(dá)于腎臟的各種類型細(xì)胞中，包括樹突狀細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞以及腎內(nèi)細(xì)胞，如足細(xì)胞、系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞。除了炎癥和自身免疫性腎臟疾病之外，TLR 信號(hào)的特異性激活主要是由TLR2 和/或TLR4 介導(dǎo)，它們也參與了非免疫性腎病中腎臟炎癥、白細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維化等過程，例如缺血再灌注損傷(I/R)、尿路梗阻、腎小管間質(zhì)性腎炎、尿毒癥和DN［38-48］。

4.2 核轉(zhuǎn)錄因子作用及機(jī)制 NF-κB 家族是由5個(gè)成員構(gòu)成，是一種高度保守的轉(zhuǎn)錄因子。在靜止細(xì)胞內(nèi)，NF-κB p65 亞基和其抑制性蛋白IκB(Inhibitor of NF-κB，IκB)的錨蛋白重復(fù)序列區(qū)結(jié)合，以無活性的形式存在于胞漿中。而當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，激活I(lǐng)κB 激酶，IκB 磷酸化并降解，釋放NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，與DNA 鏈上的特異部位結(jié)合，從而引起轉(zhuǎn)錄激活活性［49-51］。在實(shí)驗(yàn)免疫復(fù)合物性腎炎中，發(fā)現(xiàn)NF-κB 的活性增加，而給予血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)能抑制NF-κB 活性并延緩腎炎的發(fā)生［52］。在由脂多糖所引起的腎損傷中，也可見腎組織NF-κB 活性增加［53］。在輸尿管單側(cè)梗阻所引起的間質(zhì)性腎炎中，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腎皮質(zhì)中NF-κB 活性增加，應(yīng)用ACEI 干預(yù)后，其活性下降，從而認(rèn)為活化的NF-κB 可能參與了腎組織損傷及纖維化的過程［54］。由此我們推斷如果可以通過不同方式阻斷NF-κB 的表達(dá)和活化，便可抑制腎臟炎癥反應(yīng)，延緩腎臟疾病的發(fā)生和進(jìn)展。

4.3 TLRs 信號(hào)通路在DN 中的作用 TLRs 信號(hào)通路與腎病綜合征、腎炎、腎功能不全、甲狀腺功能減低癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病等都有著密切的關(guān)系，在DM 及DN 的發(fā)生、發(fā)展中也起到重要作用［55-57］。研究發(fā)現(xiàn)，TLR4 和NF-κB 在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過程中，作為炎癥反應(yīng)應(yīng)激的重要調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)水平上調(diào)或過激化均可能是導(dǎo)致糖尿病腎損傷的重要機(jī)制之一［58］。缺血再灌注損傷中TLR4 通過MyD88 依賴和非依賴性途徑在腎臟的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。內(nèi)皮細(xì)胞中TLR4 能快速響應(yīng)I/R 損傷并激活I(lǐng)FN-γ 和TNF-α，它們隨后誘導(dǎo)腎小管細(xì)胞釋放TLR4 內(nèi)源性配體，如HMGB1 進(jìn)入到細(xì)胞外。這些TLR4 配體不僅間接地誘導(dǎo)血管內(nèi)皮表達(dá)黏附分子而促使巨噬細(xì)胞遷移到間質(zhì)，也可直接激活腎小管上皮細(xì)胞和少量巨噬細(xì)胞中的TLR4，以誘導(dǎo)炎癥性細(xì)胞因子如IL-6 等，從而引起腎小管間質(zhì)炎癥的擴(kuò)增和損傷的加重。另外，MyD88 依賴性或非依賴性途徑誘導(dǎo)NF-κB 使其活性增加，NF-κB 被激活后除了可以調(diào)節(jié)炎性因子的基因轉(zhuǎn)錄，同時(shí)還會(huì)調(diào)節(jié)多種纖維相關(guān)因子的基因轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)腎臟損傷。

5 結(jié)論與展望

綜上所述，TLRs 是強(qiáng)效的調(diào)控者，使糖尿病代謝紊亂轉(zhuǎn)化為糖尿病腎病的功能和結(jié)構(gòu)異常。腎臟固有細(xì)胞中的TLRs 在糖尿病狀態(tài)下能識(shí)別新陳代謝應(yīng)激和/或內(nèi)源性配體并對(duì)其做出反應(yīng)，誘導(dǎo)下游信號(hào)并分泌炎性細(xì)胞因子和趨化因子，而這些炎癥因子又會(huì)進(jìn)一步刺激巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維母細(xì)胞增殖，導(dǎo)致DN 中腎臟炎癥的一個(gè)自我持續(xù)周期，和隨后的腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化。隨著研究的深入，關(guān)于TLR 的認(rèn)識(shí)將對(duì)DN 和DM 發(fā)生發(fā)展的研究提供新的思路，也將為預(yù)防、干預(yù)和治療DN 和DM 提供新的策略和方案。

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