CFP10-ESAT6融合蛋白用于結核分枝桿菌感染診斷ELISA方法的初步研究

許 艷，陳海麗，劉曉茜，熊延青，席秀紅，宰淑蓓，蔡金鳳，盧水華，朱召芹

CFP10-ESAT6融合蛋白用于結核分枝桿菌感染診斷ELISA方法的初步研究

許 艷，陳海麗，劉曉茜，熊延青，席秀紅，宰淑蓓，蔡金鳳，盧水華，朱召芹

目的 制備結核分枝桿菌CFP10-ESAT6融合蛋白，探討CFP10-ESAT6融合蛋白在結核分枝桿菌免疫診斷中的應用價值。方法 PCR擴增得到CFP-10、ESAT6基因片斷，將其先后克隆入pET-28a表達載體。優化表達條件、用鎳親和層析的方法純化帶His標簽的重組CFP10-ESAT6融合蛋白(rCFP10-ESAT6)。制備兔多克隆抗體，建立rCFP10-ESAT6為抗原的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法，以健康者血清為對照，檢測170例結核患者血清的抗體。結果 重組質粒 pET28a-CFP10-ESAT6靶基因測序結果與預計設計完全一致。融合蛋白在E.coliBL21(DE3)工程菌中均為可溶性表達，表達量占菌體總蛋白的40%。利用金屬螯合親和層析直接純化重組蛋白，純度達到95%以上。Western blot分析表明，重組蛋白能與結核患者血清發生特異性免疫結合反應，與健康者血清不發生反應。CFP10-ESAT6的兔多克隆抗體的效價為1∶8 000，CFP10-ESAT6作為包被抗原的檢測結核病人血清中特異性抗體的間接ELISA最佳包被濃度為0.002 μg/mL，患者血清的最佳稀釋度為1∶500。檢測結果與臨床診斷的符合率，ELISPOT>ELISA(rCFP10-ESAT6)>ELISA(kit)。結論 CFP10-ESAT6融合蛋白具有較高的抗原特異性和免疫反應性，有可能成為結核病免疫學診斷的特異抗原，對結核的診斷具有重要參考價值。

結核分枝桿菌；CFP10-ESAT6；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)

結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)引起的一種慢性傳染病，是危害人類健康的重要傳染病之一。控制結核病的流行與蔓延的關鍵在于找到簡便、快速、靈敏度高、特異性強的診斷方法[1-3]。雖然細菌學檢查仍是結核病診斷的金標準，但由于涂片陽性率較低，培養又需時太久，所以發展免疫學診斷對結核病的診斷具有重要參考價值[3，8]。

目前臨床上使用ELISA診斷方法的特異性較差，主要原因是現行的ELISA方法無法區分致病性結核桿菌感染和BCG接種者[4-5]。卡介苗及其它非致病性分枝桿菌中不存在RD1區，因此RD1區基因所編碼的蛋白在結核分枝桿菌疫苗研制開發和檢驗診斷方面都受到了廣泛的關注。CFP10和ESAT6的編碼基因均位于RD1區，是重要的T細胞抗原，具有良好的免疫原性，能誘導機體產生特異性免疫應答，且具有強烈的免疫原性，成為研究結核病診斷與預防的熱點[6，9-10]。因此可將CFP10和ESAT6作為診斷結核桿菌感染的特異性試劑[7，11]。

由于單一蛋白在診斷上靈敏度較差，因此我們通過基因工程的方法在大腸桿菌中表達了重組融合蛋白CFP10-ESAT6，建立檢測人血清中抗結核桿菌抗體的間接ELISA方法，并探討CFP10-ESAT6融合蛋白在結核分支桿菌免疫診斷中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、質粒與菌株 結核分支桿菌H37Rv、大腸工程菌TOP10、BL21(DE3)由本實驗室是保存，pET28a(+)表達質粒購自Novagen(USA)。

1.1.2 主要試劑 限制性核酸內切酶NdeI、BamH I、SacI和HindⅢ、PCR相關試劑及DNA marker購自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶購自Promega公司；DNA回收試劑盒購自Qiagen公司；IPTG購自捷瑞生物公司；抗His-tag單克隆抗體及蛋白質純化試劑盒購自Novagen公司；除鹽柱購自Millipore公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠二抗購自Sigma公司；羊抗人二抗購自Proteintech group公司；其它試劑均為國產分析純試劑。

1.1.3 結核免疫診斷試劑 奧普結核分枝桿菌抗體膠體金法診斷試劑盒購自上海奧普生物技術有限公司，操作按診斷試劑說明書進行。

1.1.4 實驗動物 雌性新西蘭大白兔1只，質量3 kg左右,來自上海市公共衛生臨床中心動物中心。

1.1.5 血清 血清取至上海市公共衛生臨床中心住院患者，TB并排除HIV感染病人血清170例。查閱病例病史，入選TB病例均符合中華人民共和國衛生部頒布的《中華人民共和國傳染病防治法》所規定結核病病例診斷標準，主要為痰涂片結果、痰培養結果、影像學結果、入院診斷、初步診斷及出院診斷等相關病史，并參照前期ELISPOT檢測結果進行分組[14]。在研究的170位病例中，明確診斷陽性：即痰涂片或痰培養陽性55人，痰涂片或痰培養均陰性，但胸x線片有肺結核特征病灶的有53人，故傳染性肺結核診斷明確的有108人；痰涂片和痰培養陰性，但具備菌陰性肺結核診斷標準1～6中3項或7～8條中任何1項的有22人；排除結核病的有40人。同時，選取婦產科排除TB病例60例作為對照組。

1.2 方法

1.2.1 擴增目的基因 實驗用到的引物見表1。引物由上海生工生物工程公司合成，擴增條件為：94℃ 預變性5 min， 94 ℃,30 s；55 ℃,30 s；72 ℃, 45 s，共30個循環。

1.2.2 重組質粒pET28a-CFP10-ESAT6的構建 用Qiagen PCR產物純化試劑盒純化CFP10和ESAT6表達片段PCR產物，分別連入pMD18-T 載體，將連接產物轉化TOP10感受態細胞，提取質粒、酶切和測序鑒定。用NdeI和HamH I雙酶切pET28a(+)和pMD18-T-CFP10重組質粒，連接后轉化TOP10感受態細胞，提取質粒、酶切和測序鑒定。SacI和HindⅢ雙酶切pMD18-T-ESAT6和pET28a-CFP10，回收ESAT6片斷與線性化的載體pET28a-CFP10,連接后轉化TOP10感受態細胞，提取質粒后進行酶切鑒定。

1.2.3 重組融合蛋白誘導表達和鑒定 將鑒定正確的重組質粒pET28a-CFP10-ESAT6轉入大腸桿菌BL21(DE3)中，挑取單克隆接種于5 mL含卡那霉素的LB中37 ℃振蕩培養至OD600=0.6，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，誘導4 h后離心收集菌體。洗滌后重懸菌體沉淀，用超聲破碎細菌，離心后分別取少量上清與沉淀SDS-PAGE檢測。并用Western-Blotting的方法進行蛋白鑒定。

1.2.4 重組蛋白純化和多抗制備 用Novagen 的試劑盒純化蛋白，純化方法及過程見操作手冊，并經除鹽柱除鹽。以Novagen蛋白純化試劑盒中的Binding Buffer做對照，用nanodrop1000儀器測定純化蛋白濃度，然后用Binding Buffer稀釋成使用濃度為1mg/mL。將不完全弗氏佐劑和融合蛋白CFP10-ESAT6(1 mg/mL)各0.5 mL混合,分別于第0周、2周、4周、6周采用背部皮下多點注射的免疫方式，6周后從耳靜脈采血，間接ELISA測效價為1∶16 000時心臟采血，分離血清備用。

1.2.5 間接ELISA檢測方法檢測 以不同濃度的重組蛋白CFP10-ESAT6作為包被抗原，并且用免疫家兔獲得的抗CFP10-ESAT6的多克隆抗體血清作為陽性血清，正常人血清作為陰性血清，倍比稀釋后進行方陣滴定。尋找最佳的抗原包被濃度、患者血清的最佳稀釋、最佳封閉條件，根據結果確定ELISA最佳反應條件。倍比稀釋重組蛋白CFP10-ESAT6加入ELISA檢測板中，每孔100 μL，37 ℃包被2 h；棄去孔內的液體，用1×PBST洗滌液洗滌5次，每次5次；每孔加200 μL含5%脫脂乳的PBS，37 ℃封閉2 h；拍干，每孔加入倍比稀釋100 μL患者血清，37 ℃孵育1 h；洗滌后加入HRP標記的羊抗人第二抗體(1∶2 500稀釋)，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h；洗滌后加入新鮮配制的底物液，每孔加100 μL，避光反應15 min，加入2 mol/L H2SO4終止反應，在酶聯免疫檢測儀上讀取OD490值。

1.2.6 統計分析 對比融合蛋白ELISA試劑盒檢測的靈敏度和特異度，且應用Stata7.0統計軟件，分別采用配對卡方檢驗和普通卡方檢驗對各組檢出陽性率進行統計學分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 目的基因擴增和誘導表達鑒定 CFP10與ESAT6擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，與預期一致，見圖1。融合蛋白經IPTG誘導后的菌體進行12% SDS-PAGE鑒定，結果顯示，在相對分子質量24 kD處可見一明顯蛋白表達條帶(圖2)。用抗His抗體Western blot檢測目的蛋白，無非特異性條帶出現(圖2)。

Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified product of target genes

2.2 融合蛋白純化 將誘導后的表達菌，集菌后冰上超聲裂解，將全菌、超聲后的菌液上清、超聲后的菌體沉淀進行SDS-PAGE檢測。目的蛋白存在于上清中，說明重組蛋白CFP10-ESAT6為可溶性表達。將超聲后的裂菌上清用試劑盒按照試劑盒說明書經Ni2+親和層析對蛋白進行純化，并收集過程中的緩沖液，分別SDS-PAGE，確定純化效率(圖4)。

M: Protein maker; 1: BL-21; 2: pET28a; 3: CFP10-ESAT6.

圖3 目的蛋白Western-Blot驗證

Fig.3 Western-Blot verification for targeted protein

M: Protein maker; 1: Whole-cell protein; 2: Supernatant after ultrasound; 3: Ultrasound after precipitation; 4: Flowthrough liquid; 5: Binding buffer; 6: Washing liquid; 7: Eluate was purified protein.

圖4 融合蛋白純化

Fig.4 Fusion protein purification

2.3 融合蛋白純化后除鹽濃縮 用Millpore的除鹽柱除鹽后作12%SDS-PAGE可見純度較高的蛋白條帶。

M: Protein maker; 1-3: Desalted protein.

圖5 純化后用millpore的除鹽柱除鹽

Fig.5 Purified CFP10-ESAT6 was desalinated using a millpore desalting column

2.4 間接ELISA檢測方法的應用 選取170例確診結核患者和60份健康患者的血清[15]，利用棋盤法，將不同稀釋度蛋白濃度包被后(包被液為5%脫脂乳)，加入不同稀釋度確診患者和健康血清，根據檢測ELSIA孔結果的讀取值比較，確定融合蛋白CFP10-ESAT6的最佳包被濃度為0.002 μg/mL，患者血清的最佳稀釋度為1∶500稀釋。

2.5 CFP10-ESAT6融合蛋白ELISA檢測方法比較

2.5.1 總體陽性率比較 在130位病例中，用CFP10-ESAT6融合蛋白ELISA檢測方法檢測，陽性87例，陰性27例，無法判斷16例；用商品化的膠體金試劑盒檢測，陽性79例，陰性51例，其陽性檢出率分別為66.92%和55.39%。而ELISPOT檢測陽性109例，陰性17例，無法判斷4例，總體陽性檢出率為83.84%(見表2)。

表2 ELISPOT、ELISA(rCFP10-ESAT6)和膠體金檢測結果

Tab.2 Outcome of ELISPOT, ELISA (rCFP10-ESAT6) and Colloidal gold

2.5.2 ELISPOT和ELISA診斷結果與明確診斷的符合程度對比 ELISPOT、ELISA(rCFP10-ESAT6)和膠體金方法分別與臨床明確診斷的符合率分別為85.22%(n=196，196/230)、71.30%(n=164，164/230)和62.61%(n=144，144/230)，檢測結果與臨床明確診斷的符合率為，ELISPOT>ELISA(rCFP10-ESAT6)>膠體金。ELISPOT的靈敏度和特異度分別為86.51%和95.60%，ELISA(rCFP10-ESAT6)的靈敏度和特異度分別為76.32%和90.58%，膠體金的靈敏度和特異度分別為55.38%和86.74%。

3 討 論

結核分枝桿菌區別于卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)的重要特征是致病性結核分枝桿菌存在RD1區，而卡介苗及其它非致病性分枝桿菌中不存在。RD1區基因所編碼的蛋白在結核分枝桿菌疫苗研制開發和檢驗診斷方面都受到了廣泛的關注。大量研究表明CFP-10和ESAT-6這兩種小分子蛋白具有很強的細胞免疫活性,在感染早期,T細胞識別這兩個抗原,介導機體產生保護性細胞免疫應答，成為研究結核病診斷與預防的熱點[6，9-10]。CFP10與ESAT6有豐富的抗原表位，作為結核感染的診斷抗原具有明顯的優勢[9-13]，CFP10與ESAT6抗原在人和牛結核分枝桿菌感染診斷中均有較高的特異性和敏感性[11-13]。

由于CFP10和EAST6是結核桿菌早期感染導致宿主產生的兩種分泌性小分子蛋白，為了增加蛋白的免疫原性，本實驗在大腸桿菌中成功表達了融合蛋白CFP10-ESAT6，用此蛋白免疫家兔，獲得高效價抗CFP10-ESAT6多克隆抗體，建立以間接ELISA為基礎的結核抗體檢測方法。在170份確診結核患者血清和60例健康血清進行檢測后[14]，確定最佳抗原包被濃度為0.002 μg/mL和最佳血清稀釋度為1∶500。

本研究發現，ELISPOT、ELISA(rCFP10-ESAT6)和膠體金方法分別與臨床明確診斷的符合率分別為85.22%(n=196，196/230)、71.30%(n=164，164/230)和62.61%(n=144，144/230)，三種方法的檢測結果與臨床明確診斷的符合率為ELISPOT>ELISA(rCFP10-ESAT6)>膠體金。ELISPOT的靈敏度和特異性分別為86.51%和95.60%，ELISA(rCFP10-ESAT6)的靈敏度和特異性分別為76.32%和90.58%，膠體金的靈敏度和特異度分別為55.38%和86.74%。因此，融合蛋白rCFP10-ESAT6和靈敏度和特異性均優于商品化的膠體金試劑盒。

ELISA也存在一定比例的假陽性與假陰性，可能與下列因素有關：如結核桿菌型別不同，故可能局限部分檢出率。而假陽性可能是因為有些人過去感染過結核桿菌或其它非特異性物質的干擾。為了更好的對該診斷方法進行評估，我們選取確診結核患者血清和健康血清，對實驗操作中的參數進行調整，綜合判斷，確定最佳檢測參數。

結果表明，來源于結核桿菌RD1區的重組CFP10-ESAT6融合蛋白有望開發為結核血清學診斷用新抗原。

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Usage of CFP10-ESAT6 fusing protein as a ELISA diagnostic method for TB

XU Yan,CHEN Hai-li,LIU Xiao-qian,XIONG Yan-qing,XI Xiu-hong,ZAI Shu-bei,CAI Jin-feng,LU Shui-hua,ZHU Zhao-qin

(Shanghai Public Health Clinical Center, Shanghai 201508, China)

In this study, we prepared theMycobacteriumtuberculosisCFP10-ESAT6 fusion protein and evaluate its potential value for immunodiagnosis of tuberculosis. Thecfp-10 andesat6 gene fragments were amplified respectively and cloned into the pET-28a expression vector. Optimized the expression conditions, His-tagged recombinant CFP10-ESAT6 protein (rCFP10-ESAT6) was purified using nickel affinity chromatography. Rabbit polyclonal antibody was prepared to establish rCFP10-ESAT6 antigen enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method. We detected 170 tuberculosis sera antibodies and 60 health sera as negative control. Results showed that the recombinant plasmid pET28a-CFP10-ESAT6 target gene sequencing results consisted with the expected design. Soluble expression CFP10-ESAT6 was accounted for 40% of the total bacterial protein inE.coliBL21 (DE3). We used metal chelate affinity chromatography to purify the recombinant proteins directly, which was over 90% purity. Western blot analysis showed the recombinant protein in TB patient sera with specific immune response. CFP10-ESAT6 rabbit polyclonal antibody was in a titer of 1∶8 000. The optimal coating concentration of CFP10-ESAT6 as coating antigen-specific antibodies in serum indirect ELISA was 0.002 μg/mL and the optimal serum dilution was 1∶500. Results' consistency with clinical diagnosis of three methods was ELISPOT>ELISA (rCFP10-ESAT6)>colloidal gold. We established an indirect ELISA method that CFP10-ESAT6 as a coating antigen for TB antibodies in human serum. CFP10-ESAT6 fusion protein was efficiently expressed in pET28a-CFP10-ESAT6/BL21 (DE3), which may be a potential immunological diagnosis of tuberculosis-specific antigens.

Zhu Zhao-qin; Email:zhaoqinzhu@163.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.04.005

上海市衛生局面上基金(No.20124467)，國家自然科學基金青年基金(No.31200108)，十二五科技重大專項(No.2013ZX10004-221和2013ZX10004221-004)

朱召芹，Email：zhaoqinzhu@163.com

上海市公共衛生臨床中心,上海 201508

R378.91

A

1002-2694(2015)04-0315-05

2014-05-30；

2015-01-12