肺炎支原體LAMPs經PI3K/Nrf2誘導人單核細胞表達HO-1

劉 艷，劉 丹，朱翠明

肺炎支原體LAMPs經PI3K/Nrf2誘導人單核細胞表達HO-1

劉 艷1，劉 丹2，朱翠明3

目的 探討肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae，Mp)脂質相關膜蛋白(lipid-associated membrane protein，LAMPs)對人單核細胞表達血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)的影響，并探討可能的調控機制。方法 體外培養THP-1細胞，用不同濃度的LAMPs作用后，分別采用realtime-PCR和Western blot檢測HO-1 mRNA和蛋白的表達。同時采用不同濃度的放線菌素D(ActD)和放線菌酮(CHX)預處理細胞，觀察其對HO-1表達的影響，以證實HO-1的表達是否通過轉錄和翻譯水平；提取LAMPs作用前后的核蛋白，凝膠遷移率實驗檢測Nrf2的核轉位、Western blot檢測Akt的磷酸化情況；同時采用PI3K抑制劑LY294002處理細胞，觀察其對LAMPs誘導Nrf2核轉位及HO-1表達的影響；最后采用 siRNA干擾Nrf2表達，以證實Nrf2是否參與調控HO-1表達。結果 (1)0～5 μg/mL LAMPs能以劑量依賴性方式誘導THP-1表達HO-1 mRNA和蛋白；(2)5 μg/mL LAMPs能誘導THP-1細胞Akt磷酸化，并能增強其DNA結合活性；PI3K抑制劑LY294002處理后，可明顯抑制LAMPs誘導的HO-1表達和Nrf2核轉位；(3)干擾Nrf2表達后，可明顯下調LAMPs誘導THP-1細胞表達HO-1。結論 LAMPs可誘導THP-1細胞表達HO-1，其機制可能與PI3K/Nrf2通路有關。

脂質相關膜蛋白；血紅素氧合酶-1；核因子相關因子-2

肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae，Mp)是引起非典型肺炎最常見的病原體之一[1]。目前，對支原體的發病機制尚未明了。有研究顯示，支原體細胞膜上的脂質相關膜蛋白(lipid-associated membrane proteins，LAMPs)是其誘發免疫反應的主要物質[2-3]。LAMPs刺激機體產生細胞因子、活性氧類(ROS)、NO等炎癥產物[4]，一方面有利于免疫系統清除支原體，另一方面，過度炎癥可能造成機體的免疫損傷[5]。為了維持機體內環境的穩定，必然存在多種炎癥反應的負調控機制，能在炎癥發生的各個階段調控其反應的程度和強度，最終維持機體的免疫平衡。研究發現， 機體在感染狀態下可合成多種保護性蛋白，包括血紅素氧化酶-1(Heme oxygenase 1，HO-1)和還原型輔酶Ⅰ/Ⅱ醌氧化還原酶(NADPH：quinine oxidoreductase，NQO1)等。前期研究中，本研究所馬小華等發現了支原體脂肽MALP-2可通過激活Nrf2誘導HO-1表達[6]。但由于MALP-2為人工合成脂肽，無法全面反應支原體感染的實際情況。本研究旨在觀察LAMPs誘導人單核細胞表達HO-1的情況，并探討其可能的調控機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 Mp標準株(ATCC 29342)由南華大學病原生物研究所保存；人單核細胞系THP-1購自中國典型培養物保存中心。Trizol試劑購自大連寶生物生工生物公司，BCA 蛋白測定試劑盒及ECL發光液體購自Pierce，LDH分析試劑盒購自江蘇碧云天生物技術研究所，LY294002購自Sigma-Adrich，Lipofectamine 2000購自Invitrogen，Nrf2、HO-1 siRNA購自廣州Ribio公司，抗HO-1、抗β-actin和TBP多克隆抗體購自Santa Cruz，抗Nrf2、抗磷酸化Akt和Total Akt抗體購自Cell Signaling。

1.2 方法

1.2.1 THP-1細胞的培養與預處理 將冷凍保存的THP-1細胞復蘇并進行傳代，選擇處于指數生長期、且狀態好的細胞分4組分別進行預處理。第1 組：將1×106/mL的THP-1細胞在無血清RPMI-1640培養基中37 ℃，5% CO2培養24 h；第2組：分別用不同濃度的放線菌素D(ActD，轉錄抑制劑)和放線菌酮(CHX，翻譯水平抑制劑)預處理THP-1細胞1 h；第3組：用不同濃度的PI3K抑制劑LY294002預處理THP-1細胞30 min；第4組：對THP-1細胞不做任何預處理。

1.2.2 LAMPs的提取 將M129標準株菌液接種于PPLO肉湯培養基中37 ℃恒溫孵育，5～7 d后，待培養基顏色由紅色變為透亮的橙黃色后轉接進行增量培養，收菌。LAMPs的提取按照相關參考文獻進行[7]。

1.2.3 LAMPs最大作用濃度的選擇 THP-1細胞經LAMPs作用前，首先采用LDH漏出實驗確定其最大作用濃度。 將約105個THP-1細胞接種到96孔板中，加入不同濃度的LAMPs孵育24 h，通過檢測各孔OD值/空白對照孔OD值以判斷培養液中LDH的釋放水平。

1.2.4 Western Blot檢測 HO-1蛋白表達和Akt磷酸化 用不同濃度的LAMPs作用于第1組預處理THP-1細胞16 h，觀察不同濃度LAMPs對HO-1蛋白表達的影響；用最大濃度LAMPs作用于第2組預處理的THP-1細胞16 h，觀察放線菌素D和放線菌酮對THP-1細胞HO-1表達的影響；用最大濃度LAMPs作用于第3組預處理的THP-1細胞16 h，同時用最大作用濃度LAMPs作用第4組THP-1細胞0～60 min后，收集不同時間細胞總蛋白，用Akt磷酸化抗體和總抗體行Western blot，觀察LAMPs對THP-1細胞Akt磷酸化的影響。

1.2.5 RT-PCR檢測HO-1mRNA的表達水平 用不同濃度LAMPs作用THP-1細胞16 h和用最大作用濃度LAMPs作用THP-1細胞0～24 h，隨后采用TRIzol法提取處理后THP-1細胞的總RNA，用RT-PCR檢測HO-1mRNA的表達水平，觀察LAMPs對THP-1細胞表達HO-1 mRNA在不同的作用濃度和不同的作用時間上的影響。

1.2.6 凝膠遷移率實驗檢測 Nrf2 DNA 結合活性 對THP-1 細胞進行預處理后，按照試劑盒提供的方法獲取核蛋白、建立反應體系， 然后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移后，交聯固定 DNA， 化學發光顯影。

1.2.7 siRNA轉染實驗 將THP-1細胞接種于培養板中。按lipofectamine 2000提供的操作步驟，將100 nmol/L Nrf2 siRNA(正義鏈 5′-UCCCGUUUGUAGAUGACAA-3′；反義鏈 5′-UUGUCAUCUACAAACGGGA-3′)加入細胞培養板中，轉染4h后再換成完全培養基繼續培養，30 h后，再用5.0 μg/mL LAMPs刺激THP-1細胞16 h，提取總蛋白，Western blot檢測HO-1表達。

2 結 果

2.1 確定LAMPs的最大作用濃度 THP-1細胞經LAMPs作用前，首先采用LDH漏出實驗確定其最大作用濃度。如圖1所示，0.5～5 μg/mL LAMPs作用于THP-1細胞后，與對照組相比，LDH含量無統計學差異。而LAMPs濃度增加至10 μg/mL時，LDH含量明顯增高。因此在隨后研究當中，LAMPs采用最大濃度5 μg/mL作為刺激濃度。

2.2 LAMPs誘導THP-1細胞HO-1 mRNA表達RT-PCR結果顯示，陰性對照組HO-1 mRNA表達水平極低，隨著LAMPs濃度的增加，HO-1 mRNA含量逐漸增多(圖2A)。此外，HO-1 mRNA水平在不同的時間點也有所不同，其中LAMPs作用8 h后達到峰值，隨后逐漸下降(圖2B)。

Fig.1 Effect of the release of LDH by different concentration of LAMPs

2.3 LAMPs誘導THP-1細胞表達HO-1 蛋白 Western blot顯示，不同濃度LAMPs作用THP-1細胞16 h后，可明顯誘導HO-1蛋白表達，其含量與LAMPs的濃度呈一定的劑量依賴性(圖3)。

Fig.3 Impact on the expression of HO-1 protein by different concentration of LAMPs

2.4 LAMPs經持續的轉錄和翻譯誘導HO-1表達 THP-1細胞經不同濃度的放線菌素(ActD，轉錄抑制劑)和放線菌酮(CHX，翻譯水平抑制劑)作用后，可顯著抑制LAMPs誘導THP-1細胞表達HO-1(圖4A、B)。

2.5 LAMPs誘導THP-1細胞表達與PI3K有關 LAMPs作用15min后Akt磷酸化到達高峰，隨后隨之降低。而總Akt在所有處理組中保持恒定(圖5A)。此外，采用PI3K抑制劑LY294002預處理THP-1細胞后，可顯著降低LAMPs誘導HO-1的表達(圖5B)。

2.6 LAMPs增強THP-1細胞Nrf2 DNA結合活性 LAMPs處理30 min尚不能檢測出Nrf2 DNA結合活性的變化，60 min后開始增強，120 min后達到高峰。未標記Nrf2探針可使DNA-蛋白結合形成的滯后條帶消失，而NF-κB探針對其無明顯影響。此外，采用PI3K抑制劑LY294002處理后，Nrf2 DNA結合活性顯著降低。見圖6。

2.7 干擾Nrf2表達抑制LAMPs誘導THP-1細胞表達HO-1 采用siRNA干擾Nrf2表達后，再用LAMPs刺激THP-1細胞16 h，Western blot結果顯示，HO-1的表達顯著降低(圖7)。

Fig.6 LAMPs could raise the DNA-binding activity of Nrf2 via PI3K pathways

3 討 論

機體感染支原體后，單核巨噬細胞通過其表面的TLR識別，并經MyD88/TRAF6/NF-κB信號通路誘導合成和分泌一系列炎癥因子和介質。對于機體而言，這些炎癥因子的合成和分泌受到嚴格的調控，從而使機體的炎癥-抗炎反應趨于平衡而避免過度炎癥反應的發生。目前已經證實，機體可表達過多抗氧化、抗炎癥功能的蛋白以負調控炎癥反應，其中以HO-1研究最為透徹[8]。研究顯示，通過誘導HO-1高表達可顯著降低細胞因子及炎癥介質的含量，抑制粘蛋白表達以及細胞凋亡[9]。這表明HO-1在維持機體的穩態方面發揮重要作用，這可能是機體一種獲得性的自我保護機制。研究顯示，細菌脂多糖(LPS)刺激THP-1細胞后，可誘導細胞表達HO-1和NQO1，從而抑制炎癥因子的過度分泌[10]。馬小華的研究結果也顯示人工合成的MALP-2可誘導THP-1細胞表達HO-1[6]。

由于支原體的致炎物質主要是LAMPs，因此被本研究選用。在觀察LAMPs對HO-1的誘生作用時，首先必須排除LAMPs對THP-1細胞的非特異性損傷以避免干擾實驗結果。本研究通過測定LDH的方法發現LAMPs的最大作用濃度為5 μg/mL。

本研究還發現，LAMPs作用THP-1細胞4 h后即可誘導HO-1 mRNA表達，8 h后達到高峰。通過采用轉錄和翻譯抑制劑處理后證實HO-1的表達發生在轉錄和翻譯水平。有研究對LPS處理THP-1細胞后發現，刺激后8 h內檢測不到HO-1的表達，這與本研究結果不太一致。這可能與LPS和LAMPs具有不同的受體有關，因為LPS主要是通過TLR4和CD14所識別，而LAMPs則通過TLR2/6，隨后所激活的信號通路有所不同所致[11]。

PI3K是一種胞內磷脂酰肌醇激酶，人體單核/巨噬細胞中PI3K主要由調節亞基p85和催化亞基p110構成。當PI3K激活后，可將底物PIP2轉化為PIP3。PIP3作為第二信使，最終激活Akt(即，蛋白激酶B)[12]。因此，檢測細胞中Akt的磷酸化水平可以間接反應PI3K的活性。本研究發現LAMPs處理THP-1細胞后5 min即可檢測出Akt磷酸化，15 min后到達高峰，這表明LAMPs可激活PI3K。為了進一步明確PI3K是否參與HO-1的表達，本研究隨后采用PI3K抑制劑LY294002處理THP-1細胞，結果發現HO-1表達顯著降低。這表明HO-1的表達可能受PI3K的調控。

Nrf2是參與調控的主要核轉錄因子。細胞靜息狀態下，Nrf2在胞漿內與其抑制因子Keap1結合而呈非激活狀態。氧化應激、親電子物質等可使Nrf2從 Keap1中解離并轉位至細胞核內與相關基因啟動子上的抗氧化反應元件位點結合，從而誘導抗氧化作用的基因轉錄，發揮其抗氧化或抗炎癥作用[13]。本研究發現LAMPs可上調細胞核內Nrf2的DNA結合活性量，這表明LAMPs可激活Nrf2。同時，通過采用PI3K抑制劑處理后，結果顯示Nrf2的DNA結合活性明顯降低。以上結果表明LAMPs可激活PI3K/Nrf2通路。

HO-1啟動子上含有Nrf2的調控位點。為了觀察Nrf2是否參與調控HO-1的表達，本研究采用Nrf2特異性siRNA干擾其表達后[14]，結果顯示，LAMPs誘導的HO-1表達顯著降低。這表明LAMPs誘導HO-1表達是通過PI3K/Nrf2通路而實現的。

綜上所述， LAMPs可激活THP-1細胞中PI3K/Nrf2信號通路，并誘導HO-1的表達。但LAMPs與TLR結合后，能否激活其他激酶和信號通路，包括MAPKs，NADPH氧化酶等，以及LAMPs誘生的HO-1能否負調控支原體感染后的炎癥反應,尚有待于進一步研究。

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Mycoplasma pneumoniae lipid-associated membrane proteins inducing Heme oxygenase-1 expression via PI3K/Nrf2 in THP-1 cell

LIU Yan1,LIU Dan2,ZHU Cui-ming3

(1.Department of Medical Laboratory, Shaoyang Medical College, Shaoyang 422000, China;2.Shaoyang Municipal Center for Disease Control and Prevention, Shaoyang 422000, China;3.Institute of Pathogenic Biology, University of South China, Hengyang 421001, China)

The aim of this study is to investigate the mechanisms ofMycoplasmapneumonia-derived lipid-associated membrane proteins (LAMPs) inducing heme oxygenase-1 expression in human mononuclear cell line THP-1 cells. THP-1 cells were culturedinvitro, and treated by different concentration of LAMPs; the mRNA and protein level of HO-1 were detected by real time-PCR and western blot, respectively. Meanwhile, actinomycin D and cycloheximide were administered to pretreat THP-1 cell, subsequently challenged by 5.0 μg/mL LAMPs for 16 hrs, and the expression of HO-1 was detected by western blot. To determine the phosphorylation of Akt and the DNA-binding activity of Nrf2, western blot and electrophoretic mobility shift assay were used to detect the nucleoprotein and cytoplasm protein extracted from the THP-1 cell administered by LAMPs. The PI3K inhibitor LY294002 was also administered to investigate the effects of LAMPs on the activity of Nrf2. At last, siRNA was used to confirm the involvement of Nrf2 in regulation of HO-1 expression. Results showed that (Ⅰ) 0-5 μg/mL LAMPs induced HO-1 mRNA and protein dose-dependent expression in THP-1 cells; (Ⅱ)5 μg/mL LAMPs could induce Akt phosphorylation in THP-1 cells, and raise the DNA-binding activity of Nrf2, and PI3K inhibitor LY294002 could significantly inhibit its activity; (Ⅲ) Silencing of Nrf2 by siRNA could downregulate LAMPs induced HO-1 expression in THP-1 cell. In conclusion, LAMPs could induce HO-1 expression in THP-1 cell via PI3K/Nrf2 pathways.

lipid-associated membrane protein; heme oxygenase-1; nuclear factor related factor-2

Liu Dan, Email: 49467274@qq.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.04.012

劉丹，Email：49467274@qq.com

1.邵陽醫學高等專科學校，邵陽 422000； 2.湖南省邵陽市疾病預防控制中心，邵陽 422000； 3.南華大學病原生物學研究所，衡陽 421001

R375

A

1002-2694(2015)04-0348-05

2014-07-10；

2014-10-29

湖南省教育廳優秀青年項目(14B164)

Supported by the Excellent Young Project of Education Department of Hunan Province (No. 14B164)