海南省關節炎和神經系統疾病患者萊姆病調查

朱 雄，張 琳，侯學霞，耿 震，陳 海，陳 婷，俞書義，郝 琴

海南省關節炎和神經系統疾病患者萊姆病調查

朱 雄1，張 琳2，侯學霞2，耿 震2，陳 海1，陳 婷1，俞書義1，郝 琴2

目的 了解我國海南省關節炎或神經性疾病患者的萊姆病感染狀況，并確認海南省是否存在萊姆病人。方法 海南省三亞市人民醫院提供血清542份，均為關節炎或神經性疾病患者。采用間接免疫熒光法(Indirect Fluorescent-Antibody Test, IFA)和免疫印跡法(Western Blot，WB)對血清標本進行萊姆病抗體檢測；并采用巢式PCR法對WB抗體陽性的血清標本進行病原學檢測。結果 IFA方法檢測血清樣本542份，54份陽性，陽性率為9.96%。應用WB法對上述54份IFA陽性血清樣本進行檢測，12份陽性。采用巢式PCR方法檢測12份WB陽性樣本，2份陽性，測序結果表明兩份均為B.garinii基因型。結論 本研究證實了海南省人群中存在萊姆病。建議當地醫生在診治關節炎和神經性疾病患者時，可以考慮其是否罹患萊姆病。

萊姆病；血清標本；抗體檢測；病原學檢測

萊姆病是一種由蜱傳播的人獸共患病，其致病病原體為伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)，俗稱萊姆病螺旋體，可引起人體多系統、多器官的損害。自1982年Burgdorfer及其同事分離到萊姆病病原體以來[1]，現已發現全世界五大洲70多個國家有萊姆病的存在，且發病區域和發病率均呈擴大和上升趨勢[2]。

我國自上世紀80年代開始研究萊姆病以來，已在29個省(自治區、直轄市)開展了萊姆病人群血清流行病學調查，并從20個省(自治區、直轄市)的病人、動物和/或蜱中分離出病原體，證實我國存在萊姆病的自然疫源地，部分地區還有典型萊姆病病例存在[3-4]。萊姆病作為地方性傳染病，在我國的分布也呈現區域性聚集的態勢，主要集中在東北、內蒙古和新疆等地。萊姆病的發生依賴于其媒介以及宿主動物的分布[4-5]。我國南方一些地區也有萊姆病的發生，然而較之北方地區，了解相對較少。海南省位于我國南海，與中國大陸隔海相望，尚未有關于萊姆病的研究報道。因此，我們開展對海南省人群萊姆病的調查是有必要的。

根據美國CDC的建議，我們采用兩步法對病人血清進行萊姆病抗體檢測，即：IFA或ELISA作為初篩試驗，WB作為確診試驗。根據不同的基因型，美國和歐洲分別制定了其WB檢測陽性判斷標準。我國也針對B.g.和B.a.兩種優勢基因型，制定了WB的陽性判斷標準[6-7]。

1 材料方法

1.1 血清樣本的收集 2013年3月6日至8月21日，我們從三亞人民醫院收集了542份血清。所有血清均來源于患有關節炎癥狀或神經癥狀，均排除風濕性關節炎等其他疾病。病人的年齡跨度從3～89歲，男性比例占到病人總數的50.18%。

1.2 主要試劑 羊抗人IgM和IgG 熒光抗體、HRP標記的羊抗人IgM和SPA，均購自美國Sigma公司。DNA 提取試劑盒(DNeasy?Blood & Tissue Kit)由德國QIAGEN 公司提供。引物由天一輝遠生物公司合成。PCR相關試劑由天根生物公司提供。萊姆病抗原片和WB膜條由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所萊姆病室提供。

1.3 DNA的提取

1.3.1 陽性對照DNA的提取 將我實驗室保存的PD91菌株于BSK培養基中傳代培養，當菌體濃度達到107bacteria/mL時，將全部培養基裝至1.5 mL Eppendorf離心管中，13 200 r/min離心30 min，棄去上清液，然后用0.01 mol/L pH7.4 PBS洗滌3遍，棄去上清液，然后加入100 μL ddH2O重懸，恒溫金屬浴上100 ℃水煮10 min，最后3 500 r/min離心5 min，吸取上清液保存于-80 ℃冰箱，備用。

1.3.2 血清樣本DNA的提取 采用DNeasy?Blood & Tissue Kit(DNA 提取試劑盒)，提取542份血清樣本DNA。具體操作按說明書進行。

1.4 萊姆病抗體檢測

1.4.1 間接免疫熒光實驗(IFA) 將血清用3%卵黃液從1∶16開始倍比稀釋，在熒光顯微鏡40×10視野下，50%以上螺旋體染上明亮熒光，抗體效價IgM≥1∶64，IgG≥1∶128為陽性。同時做陽性、陰性對照。

1.4.2 蛋白免疫印跡法 (WB) 將IFA初篩的陽性標本，進一步用WB檢測。用PBS-T以1∶25稀釋血清并浸泡抗原條，震蕩4 h，洗脫5次，每次至少10 min，將抗原條分別加入二抗IgG或IgM，過夜。再經過洗脫5次，每次至少10 min，加入顯色劑顯色30 min。顯色結束，用純水終止反應。WB結果根據中國萊姆病WB診斷標準進行判定[6-7]。

1.5 Nested PCR

1.5.1 引物 引物參照文獻[8]的rrf(5S)-rrl(23S) rRNA基因間隔區巢式PCR的引物，引物序列見表1。

1.5.2 巢式PCR反應體系及條件 50 μL反應體系：2×Taq MasterMix 25 μL，上下游引物(100 μmol/L)各1 μL，第一輪模板4 μL，第二輪模板0.5 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s(第二輪退火溫度為55 ℃)，72 ℃延伸45 s，35個循環后72 ℃延伸5 min。

1.5.3 巢式PCR產物檢測 巢式PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀成像拍照。陽性片段約為250 bp左右。

1.5.4 測序及序列分析 將巢式PCR產物送北京擎科生物工程有限公司測序，并在美國NCBI網站上用BLAST對序列進行比對分析。

2 結 果

2.1 萊姆病血清學抗體檢測結果 利用IFA方法檢測血清樣本542份, 54份陽性，其中IgG陽性40份，IgM陽性共16份，有2份樣本的IgG和IgM同時為陽性(見表2)。這次調查結果顯示，海南省關節炎或神經性疾病患者的萊姆病的IFA陽性率為9.96%。54例陽性標本的患者年齡跨度為15～93歲。其中10～39歲有13人，40～69歲有20人，70～99歲有11人，另有10份樣本無年齡報告。全部54份陽性包括25名男性患者，29名女性患者。

對IFA檢測陽性的54份血清樣本進一步用WB方法確認，結果顯示共有12份WB檢測陽性，其中IgG陽性7份，IgM陽性5份。具體結果見表3。

2.2 Nested PCR檢測結果 我們利用巢式PCR方法對12份WB檢測陽性的標本進行基因擴增，結果顯示有2例病人血清呈陽性。測序結果與美國NCBI網站上的參考序列比對發現兩例陽性病人標本所擴增出的基因片段均與B.garinii.基因型高度相似。2例病人中1例為83歲女性神經系統疾病患者(No.750)，其WB IgM陽性,為近期感染的患者；另1例為56歲男性關節炎患者(No.392)，其WB IgG陽性,為感染4～6周以上的患者。

3 討 論

萊姆病分布廣泛，全球已有70多個國家報告發現該病，且發病率呈上升趨勢，新的疫源地不斷發現。萊姆病的傳播主要依賴于媒介蜱及其宿主動物。這種自然疫源性疾病根據不同的地理環境，在自然界的循環也不同[9]。國內許多研究表明，我國29個省(市、自治區)在不同程度上都有人感染萊姆病的報道，感染率較高的地區主要集中在東北林區、內蒙古地區、新疆中部以及甘肅等地。南方一些地區比如云貴高原、湖北、福建等地也有萊姆病病例的報道[3-4,10-11]。海南省位于我國南海，它的自然地理條件與我國萊姆病發生率高的地區差異極大，尚未有過報道。 2011年的一項調查研究證明海南省存在蜱傳疾病[12]，因此對海南省進行萊姆病調查是有必要的。

本次研究首次從海南省當地人群血清中檢出萊姆病的感染，表明海南省人群中存在萊姆病的感染，在關節炎和神經性疾病患者中其萊姆病感染率達9.96%，并且通過WB方法，確診萊姆病12例。表明在海南省存在臨床表現為關節炎和神經系統癥狀的萊姆病患者。提示當地的臨床醫生在遇到相關癥狀的病人時應考慮萊姆病的鑒別診斷。

利用rrf-rrl基因間隔區nested PCR方法，對血清學確診的12例陽性病例進行檢測，發現2例檢測結果呈陽性。序列分析表明此2例患者為B.garinii基因型菌株感染，提示海南省存在B.garinii基因型致病性菌株. 海南省位于我國南海，其地理氣候與臺灣島以及廣東、福建等沿海省份相近。臺灣為萊姆病的自然疫源地，存在多種基因型的萊姆病螺旋體，其主要傳播媒介為粒形硬蜱，主要宿主動物為黃毛鼠和褐家鼠[13-14]。廣東和福建也早在90年代就被證實存在萊姆病的自然疫源地，福建從粒形硬蜱和社鼠、褐家鼠體內分離到萊姆病螺旋體[11]，廣東省從白腹巨鼠和針毛鼠分離到萊姆病螺旋體[15-16]。

今后應進一步對海南省的媒介、宿主等進行調查，從而明確海南省萊姆病的主要媒介和宿主動物，以及主要病原類型，從而為海南省萊姆病的防控提供科學依據。

[1]Burgdorfer W, Barbour AG, Hayes SF, et al. Lyme disease-a tick-borne spirochetosis[J]. Science. 1982, 216: 1317-1319.

[2]Piesman J. Strategies for reducing the risk of Lyme borreliosis in North America[J]. Int J Med Microbiol, 2006, 296: 17-22.

[3]Zhang ZF, Wan KL, Zhang JS, et al. Studies on epidemiology and etiology of Lyme disease in China[J]. Chin J Epidem, 1997, 18(1): 8. (in Chinese) 張哲夫, 萬康林, 張金聲,等. 我國萊姆病的流行病學和病原學研究[J]. 中華流行病學雜志，1997, 18(1): 8-11.

[4]Hou XX, Geng Z, Hao Q, et al. Rats, the primary reservoir hosts ofBorreliaburgdorferi, in six representative provinces, China[J]. Chin J Zoonoses, 2010, 26(11): 1034-1036. (in Chinese) 侯學霞, 耿震, 郝琴,等.中國 6 省萊姆病螺旋體主要宿主動物鼠的初步調查[J]. 中國人獸共患病學報，2010, 26(11): 1034-1036.

[5]Chen Z, Yang XJ, Yang XH, et al. Geographical distribution and fauna of Chinese Ticks[J]. Sichuan J Zool, 2008, 27(5): 820-823. (in Chinese) 陳澤, 楊曉軍, 楊曉紅,等. 中國蜱類地理分布及區系分析[J]. 四川動物. 2008, 27(5): 820-823.

[6]Jiang Y, Hou XX, Geng Z, et al. Interpretation criteria for standardized western blot for the predominant species ofBorreliaburgdorferiSensu Lato in China[J]. Biomed Environmental Sci, 2010(5), 23: 341-349.

[7]Liu ZY, Hao Q, Hou XX, et al. A study of the technique of Western Blot for diagnosis of Lyme disease caused byBorreliaafzeliiin China[J]. Biomed Environmental Sci, 2013, 26(3): 190-200.

[8]Huang HN, Ding Z, He J, et al. Investigation onBorreliaburgdorferiinfection in ticks and animal from a forest area of Jilin province[J]. Chin J Zoonoses, 2006, 22(8): 785-788. (in Chinese) 黃海楠, 丁壯, 何靜, 等. 吉林林區動物萊姆病螺旋體感染的調查研究[J]. 中國人獸共患病學報，2006, 22(8): 785-788.

[9]Lane R, Piesman J, Burgdorfer W. Lyme borreliosis: relation of its causative agent to its vectors and hosts in North America and Europe[J]. Annual Rev Entomol,1991, 36: 587-609.

[10]Geng Z, Hou XX, Wan KL, et al.Borreliaburgdorferiantibody levels in 105 patients with suspected Lyme disease[J]. Chin J Vector Biol Ctrl, 2010, 21(1): 77-79. (in Chinese) 耿震，侯學霞，萬康林，等.105例擬診萊姆病患者抗伯氏疏螺旋體抗體檢查結果分析[J].中國媒介生物學及控制雜志, 2010, 21(1): 77-79.

[11]Pan L, Yu ES, Zhang ZF.Investigation of Lyme disease in Fujian province[J]. Chin J Public Health, 1992,11(5): 271-272. (in Chinese) 潘亮, 于恩庶, 張哲夫.福建省萊姆病的調查研究[J]. 中國公共衛生學報,1992,11(5): 271-272.

[12]Jin YM, Zhang LJ, Sun LY, et al. Epidemiologyical investigation of emerging spotted fever in Chengmai county, Hainan province[J]. Dis Surveillance, 2011, 26: 18-22. (in Chinese) 金玉明, 張麗娟, 孫蓮英, 等. 海南省澄邁縣新發斑點熱流行病學調查[J]. 疾病監測,2011, 26: 18-22.

[13]Shih CM, Chang HM. Genospecies identification and characterization of Lyme disease spirochetes of genospeciesBorreliaburgdorferisensu lato isolated from rodents in Taiwan[J]. J Clin Microbiol, 1998, 36: 3127-3132.

[14]Chao LL, Liu LL, Shih CM. Prevalence and molecular identification ofBorreliaspirochetesinIxodesgranulatusticks collected fromRattusloseaon Kinmen Island of Taiwan[J]. Parasites Vectors, 2012, 5: 167.

[15]Chen WS, Luo HM, He JF, et al. An survey on host and vector of Lyme disease in Guangdong province[J]. Chin J Vector Bio Ctrl, 2000, 11(3): 190-193. (in Chinese) 陳戊申,羅會明,何劍峰,等. 廣東省萊姆病宿主動物和媒介生物調查[J].中國媒介生物學及控制雜志,2000,11(3):190-193.

[16]Feng ZQ, Chen WS, Du ZM, et al. Investigation of Lyme disease in 1992, Guangdong province[J]. Guangdong J Health Epidemic Prevent, 1993, 19(4): 7-8. (in Chinese) 馮鄭強，陳戊申，杜志明,等.廣東省1992 年萊姆病調查結果[J].廣東衛生防疫,1993,19(4)：7-8.

Investigation on Lyme Disease of patients with arthritis or neurological disorders in Hainan Province, China

ZHU Xiong1,ZHANG Lin2,HOU Xue-xia2,GENG Zhen2,CHEN Hai1,CHEN Ting1,YU Shu-yi1,HAO Qin2

(1.Clinical Laboratory, Sanya Peoples' Hospital, Hainan Province, Sanya 572000, China; 2.State Key Laboratory for Infectious Diseases Prevention and Control, National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China)

To investigate the infection status of Lyme spirochete in patients with arthritis or neurological disease in Hainan Province of China, and to confirm the presence of Lyme disease in Hainan Province, a total of 542 serum samples with arthritis or nervous system disease suspected withB.burgdorferiinfection were collected from Sanya Peoples' Hospital, Hainan Province. Antibodies for Lyme disease in serum samples were detected by Indirect Fluorescent-Antibody Test (IFA) and Western blot (WB); and the nested PCR method was used to test the pathogen in the WB positive serum samples. Results showed that 54 in total of 542 serum samples were tested positive by IFA, the positive rate was 9.96%. In the 54 IFA-positives, 12 were confirmed positive by WB. Two in 12 WB confirmed positives were tested positive by nested PCR. Sequence analysis showed the two samples were infected byB.gariniistrains. This research confirmed the existence of human Lyme disease in Hainan Province. We suggested that Lyme disease should be commonly considered by clinicians when the patients had some related symptoms of Lyme disease in Hainan, China.

Lyme disease; serum samples; antibody test; etiological test

Hao Qin, Email: haoqin@icdc.cn

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.04.013

國家“十二五”傳染病重大專項(2012ZX10004219 和2013ZX10004-101)；海南省自然科學基金項目(814389)；三亞市醫療衛生科技創新項目(YW1244)(朱雄和張琳同等貢獻)

郝琴，Email: haoqin@icdc.cn

1.海南省三亞市人民醫院檢驗科，三亞 572000; 2.中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，傳染病預防控制國家重點實驗室,北京 102206

R514

A

1002-2694(2015)04-0353-04

2014-11-02；

2015-01-05

Supported by the Major Project of the Twelfth Five Year Special for infectious diseases (Nos. 2012ZX10004219 and 2013ZX10004-101), the Natural Science Foundation of Hainan Province (No. 814389), and the Innovation Projects of Science and Technology in Medical and Health Area, Sanya (No. YW1244)

Zhu Xiong and Zhang Lin contribute equally to this study.